私たちは感謝シンガポール（ETRP 1201102）の国家環境庁からの資金援助を認める、シンガポール国立研究財団（NRF-CRP5-2009-03）、シンガポールの科学技術研究庁の競争研究プログラム（ 1324004108）、グローバルR＆Dプロジェクトの計画、知識経済部、大韓民国（N0000677）、国防脅威削減局（DTRA、HDTRA1-13-1-0037）と合成生物学シンガポール国立大学のイニシアティブ（ DPRT / 943/9月14日）。

Yの1世代KU70欠失株リポリティカ <ol><li>破壊カセットの構築 注：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅に使用されるすべてのプライマーは、 表1を参照のこと。 <ol><li> LEU2発現カセットをPCR増幅するために設計プライマー20は、Yから（ 表1参照します） リポリティカ（lipolytica）発現ベクターおよび長いフォワードプライマー（＃1、 表1）を用いてLEU2カセットの5 &#39;および3&#39;末端にLoxP部位を導入し、それぞれ、長逆方向プライマー（ 表1＃2）。クローニングプロセスの後続のステップのために追加の制限部位を導入するために、プライマー＃1におけるBamHI制限部位を加えます。 </li><li> 表2に詳述するように、高忠実度DNAポリメラーゼを用いてPCRを行います。 </li><li> PCR purificatioを使用して、PCR産物のLoxP-プロモーター-LEU2-ターミネーターのLoxPカセットを精製製造元の指示に従って、n個のキット。製造業者の説明書21に記載の精製されたPCR産物に3&#39;-Aオーバーハングを加えます。 表3の通りプラスミドT-LEU2を得るためのTAクローニングベクターにAテールPCR産物を連結するために使用T4 DNAリガーゼ。 </li><li> PCRは、Yからプライマー＃3 /＃4を使用してKU70遺伝子の1キロバイトの5 &#39;上流配列を増幅しますリポリティカ Po1g 表2に従って、ゲノムDNA 22は、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。 <ol><li>ダブル。 表4のとおりのSacIIおよびBam HI酵素で精製したPCR産物とT-LEU2プラスミドの両方を消化し ​​、製造元の説明書に従ってPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。精製を連結するためにT4 DNAリガーゼを使用して、 サック IIにPCR産物を消化/ T-LEU2ののBamHI部位を生成しますプラスミドT-LEU2-5E 表3のとおり。 </li></ol></li><li> PCRは、Yからのプライマーを＃5 /＃6を使用してKU70遺伝子の1キロバイトの3 &#39;下流配列を増幅しますリポリティカ Po1g 表2に従って、ゲノムDNA 22は、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。ダブル精製したPCR産物と表4のとおりのNot Iおよびんで酵素とT-LEU2-5Eプラスミドの両方を消化。 <ol><li>製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。その後、精製を結紮およびNot I / んで 表3に従ってT4 DNAリガーゼを用いてプラスミドT-KOを生成するT-LEU2-5EのI部位にPCR産物を消化し ​​ました。 </li></ol></li><li>破壊カセットを生成するために、表4のとおりのSacIIおよびんで I酵素によるプラスミドのT-KOダイジェスト（ 図1 </stronグラム&gt;）。製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いて消化したDNA断片を精製します。 </li></ol></li><li>コンピテントセルの調製およびYの変換Po1g株リポリティカ <ol><li>コンピテント細胞調製<ol><li> Yのコロニーを植菌YPD培地10ml（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％デキストロースおよび50mMのクエン酸緩衝液pH 4.0）を100mlフラスコ中で、新鮮な酵母抽出物-ペプトン-デキストロース（YPD）プレートからリポリティカ Po1g株。飽和するまで20時間（分光光度計を用いて測定し、OD約15の600）を225 rpmで30℃の振盪インキュベーター中でインキュベートします。 </li><li>室温で5000×gで5分間遠心して細胞をペレット化。 20ミリリットルのTris-EDTA（TE）緩衝液（10mMのTris、1mMのEDTA、pH7.5）で細胞を洗浄し、ステップ1.2.1.2で説明したように、細胞をペレット。 （酢酸で調節してpH 6.0）を1mlの0.1M酢酸リチウム中で細胞を再懸濁し、そして室テンペで10分間インキュベートrature。 </li><li>滅菌1.5ミリリットルチューブにテント細胞（100μl）を等分。直下変換ステップに進む、または長期保存のために-80℃で、最終濃度25％（v / v）を、店舗にグリセロールを加えます。 </li></ol></li><li>変換<ol><li>穏やかにコンピテント細胞100μlと共に変性サケ精子DNA（10 mg / mlで）、精製破壊カセット1-5μgの10μLを混合し、15分間30℃でインキュベートします。 </li><li> （0.1 M酢酸リチウム液pH 6.0に溶解した）40％ポリエチレングリコール（PEG）-4000の700μl加え、よく混ぜ、60分間225rpmで30℃の振盪インキュベーター中でインキュベートします。 注：（典型的には、従来の酵母の形質転換に使用される）の代わりにPEG-3350の、4000の平均分子量を有するPEGを使用することが重要です。 </li><li>熱は、60分間39℃の水浴中に管を配置することによって、形質転換混合物に衝撃を与えます。 </li><li> 1ミリリットルをYPD培地を追加し、30°Cおよび225 rpmで2時間回復。室温で1分間、9000×gで遠心し、上清を除去し、TE緩衝液1mlでペレットを再懸濁します。 </li><li>室温で1分間9000×gの遠心分離により細胞をRepelletし、上清を捨てます。 100μlのTE緩衝液にペレットを再懸濁し、選択プレート（ 例えば 、ロイシン欠乏プレート）上にプレートし、2〜3日間30℃でインキュベートします。 </li><li> 4〜10の単一コロニーを選択し、YPD培地2mlに別々に接種します。 225 rpmで30℃の振盪インキュベーター中で一晩インキュベートします。それぞれのプライマー＃55 /＃56、及び＃56 /＃57、の2セットを用いて、 表5のとおり形質転換体22からのゲノムDNAのPCR分析によって陽性コロニーを識別します。 注：私は、直鎖状にpYLEX1ベクターがY.に変換されるわけではありません数をカウントすることにより形質転換効率を決定するためにPo1gテント細胞リポリティカμgのプラスミド当たりのコロニー形成単位（CFU）のDNAは、23を用います。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.マーカーレスキュー<ol><li> Cre発現プラスミドの構築<ol><li> pYLEX1-CREとpYLEX1-HPHの構築<ol><li>デザインプライマー20は、CreおよびHPHのオープンリーディングフレームをPCR増幅します。フォワードプライマー＃82と＃84に開始コドンの上流の余分なアデニンヌクレオチドを追加し、PCRは、CREのオープンリーディングフレームを増幅するリバースプライマー＃83と＃85の中に終止コドンの下流のKpnI制限部位を挿入し、 表2のとおりpSH69（アクセッション番号HQ412578）24からHPH。 </li><li> CRE、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを使用して、HPH断片の両方を精製します。 TABL通りのKpn I酵素で精製CREおよびHPH断片の両方を消化E 4。Pmlに基づくおよびKpnIでpYLEX1プラスミドは表4の通り酵素消化倍増。当たりの製造者の指示通りPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。 </li><li> Y.のPmlに基づく I / KpnIのサイトに精製し、消化CREおよびHPH断片を連結するには、 表3の通り、T4 DNAリガーゼを使用します発現ベクターリポリティカ 、それぞれ、pYLEX1-CREとpYLEX1-HPHを得ました。 </li></ol></li><li> pSL16-CRE-HPHの構築<ol><li> PCRは、プライマーに＃86を使用してpYLEX1-CREからのcreのプロモーター-遺伝子-ターミネーターカセットを増幅/＃87、表2のとおりのSal I / PstIの制限部位に隣接する。メーカーの指示に従って、PCR精製キットを用いてPCR産物を精製。 <ol><li>精製したPCR産物およびSal IでpSL16-CEN1-1（227）プラスミド25の両方をダブル消化し ​​、PST 表4に従って、I酵素は、製造業者の指示に従って、PCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。そして、 表3に従ってT4 DNAリガーゼを用いpSL16-CREを作成するために対応する部位にpSL16-CEN1-1（227）に精製し、消化し ​​たPCR産物を連結。 </li></ol></li><li> PCRは、＃88 /＃89は、 表2の通りのXho I / のBglII制限部位に隣接するプライマーを用いてpYLEX1-HPHからHPHのプロモーター-遺伝子-ターミネーターカセットを増幅する。製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。 <ol><li>ダブル。精製されたPCR産物および表4のとおりのXho IおよびBgl II酵素とpSL16-CREプラスミドの両方を消化し ​​、製造元の説明書に従ってPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。次に、対応するでpSL16-CREに精製し、消化したPCR産物を連結サイトは、 表3に従ってT4 DNAリガーゼを用いpSL16-CRE-HPHを生成します。 注：結果のCre発現プラスミド、pSL16-CRE-HPHは、選択可能なハイグロマイシンBのマーカーを保有し、セントロメアおよびエピソーム的に複製するベクター（ 図2）です。 </li></ol></li><li> 表4の通り（ベクターからの挿入を切り出すために、 例えば 、 サル I / PstIの ）適切な制限酵素で消化することにより全ての構築物を確認してください。 </li></ol></li></ol></li><li> Creリコンビナーゼ媒介マーカーレスキュー<ol><li>上記のセクション1.2に記載の形質転換プロトコルに従ってKU70ノックアウト株のコンピテント細胞にpSL16-CRE-HPHを変換します。プレートは、YPDプラスハイグロマイシンB上に細胞（YPDH）プレート（400 / mlのハイグロマイシンBを含む）に形質転換し、2〜3日間30℃でインキュベートします。 </li><li>正識別するためのプライマー＃84 /＃85を用いて、 表5の通りコロニーPCRを行います変換後のpSL16-CRE-HPHプラスミドを含むコロニー。 注：フォワードプライマー＃84およびリバースプライマー＃85は、hph遺伝子（ 表1）のコード領域の内側に配置されています。唯一の陽性クローンをPCR反応に特異的なPCR産物を生成します。 </li><li>陽性クローンを選択し、YPDH培地2mlに接種し、飽和するまで一晩225rpmで30℃の振盪インキュベーター中でインキュベートします。分光光度計を用いて細胞のOD 600を測定します。 〜15のOD 600で細胞を回収します。室温で5分間、5000×gで遠心分離し、滅菌水2mlで1回洗浄。 </li><li>初期OD 0.1の600でYPD培地2mlに細胞を再接種し、細胞が一晩225rpmで30℃の振盪インキュベーター中で成長することができます。単一コロニー23を分離するYPDプレート上にストリーク一晩細胞培養物。 YPD、YPDH、およびロイシン欠乏プレート23上にレプリカプレートコロニー</s&gt;アップ。 注：両方のLEU2マーカーを失っているとpSL16-CRE-HPHプラスミドのみをYPDプレート（ 図3）上に成長させることができるコロニーを。 </li></ol></li></ol>アルコール脱水素酵素およびアルコールオキシダーゼ遺伝子の3削除<ol><li> Y.で検索を実行します削除の26の遺伝子候補を同定するために基本的なローカル配列検索ツール（BLAST）を使用してリポリティカゲノムデータベース。入力Sのタンパク質配列BLAST検索ツールにセレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼIを（http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;db=yli&amp;seqid=aa）。 注：BLAST検索ツールは、Yに最も類似したタンパク質配列を返しますリポリティカゲノムデータベース。 </li><li> ＃56へのプライマー＃7（ 表1）を用いたPCRによって削除カセットを構築し、上記のセクション1.1に記載したのと同じ方法を用いて、制限酵素消化およびライゲーション反応を行います。 </li><li>予備校KU70ノックアウト株のコンピテントセルは、ある変換を行い、上記のセクション1.2に記載のプロトコルに従うことにより、＃81（ 表1）に＃55のプライマー、＃58で陽性コロニーを同定するためのPCRを実施します。 注：例として、YALI0E17787g遺伝子欠失のための手順は、 図4及び5に記載されています。相同組換え率に1キロバイトおよび2キロバイト長い相同領域の効果が報告されています。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

この研究のための私たちの目標は、Yに標的遺伝子ノックアウトの迅速かつ効率的な生成を可能にすることですPo1g株リポリティカ 。いくつかの考慮事項は、これを達成するために対処する必要があります。まず、高変換効率が必要です。したがって、Y.ための効率的で便利な化学的形質転換プロトコルリポリティカ Po1g株を本研究に記載されました。 PEG-4000を...

サッカロマイセス・セレビシエ 、 ヤロウィアリポリティカ、型にはまらない酵母とは異なり、環境条件1,2の変化に応じて、酵母または菌糸体の形で成長することができます。したがって、この二形酵母は真菌の分化、形態形成および分類3,4,5の研究のための良いモデルとして使用することができます。一般に広く、有機酸、ポリアルコール、芳香化合物、乳化剤及び界面活性剤-6,7,8,9-などの食品添加物の多様を生成するために使用される安全な（GRAS）酵母種とし ​​て見なされます。これは絶対好気性自然細胞乾燥重量10の70％まで、多量、 すなわちに脂質を蓄積することができる周知の油性酵母です。また、栄養素11,12,13として廃資源における残基の異なる種類を含む、成長のための炭素源の広いスペクトルを利用することができます。これらのユニークな機能のすべてがYを作ります以下のための非常に魅力的リポリティカ様々なバイオテクノロジー用途。 Yの全ゲノム配列が、 リポリティカが 14,15を公開されている、この型破りな酵母の遺伝子操作は、他の酵母種よりも複雑です。まず、この酵母種の変換は、それほど効率的により安定的かつ効率的な形質転換系16,17が存在しないことです。全く自然なエピソームプラスミドシステムは、この酵母18で発見されていないように、第2の線形発現カセットの面倒なゲノム組み込みは、一般に、目的の遺伝子の発現のために使用されます。この酵母で正確な相同組換えを介して効率遺伝子ターゲッティングが低く、ほとんどの統合イベントは非相同末端結合（NHEJ）19を介して発生するため、遺伝的ノックアウトおよびノックインの第三に、世代が制限されています。 本研究では、Yのための最適化された形質転換プロトコルを報告しますリポリティカ </em&gt;の、簡単迅速、効率的かつ再現性のあるPo1g株。正確な相同組換えの頻度を高めるために、我々は、NHEJ経路における重要な酵素をコードするKU70遺伝子を削除しました。最適化された形質転換プロトコルを用いて、1キロバイト、Y.のKU70遺伝子のフランキング相同領域を含む直鎖ノックアウトカセットを形質転換することによってリポリティカ Po1gは正常に削除されました。この遺伝子の欠失方法のロバスト性は、その後Po1g KU70Δ株において、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルコールオキシダーゼ遺伝子を標的にすることによって実証されました。これは、KU70欠損株は、野生型Po1g株よりも標的相同組換えを介した遺伝子のかなり高い効率を示すことが観察されました。また、ハイグロマイシンB耐性マーカーを保有する複製Cre発現プラスミドは、マーカーレスキューを実行するように構築しました。マーカーレスキューは番目に遺伝子標的の複数のラウンドを容易にEは、遺伝子欠失突然変異体を得ました。遺伝子欠失に加えて、ここに記載の遺伝的形質転換および遺伝子欠失のための我々のプロトコルは、特定の遺伝子座に遺伝子を挿入するために適用することができ、およびY.に部位特異的変異を導入することリポリティカゲノム 。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>25 nmole DNA oligos</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Y. lipolytica&lt;/em&gt; strain Po1g</td><td>Yeastern Biotech</td><td></td><td>leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)</td></tr><tr><td>Vector pYLEX1</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>&lt;em&gt;Y. lipolytica&lt;/em&gt; expression vector</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>For cloning and propagation of plasmids</td></tr><tr><td>pGEM-T vector&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA cloning vector</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>For plasmid isolation</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and&lt;br/&gt; PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Extract DNA fragments from agarose gels&lt;br/&gt; and purify PCR products from an amplification reaction</td></tr><tr><td>The iProof high-fidelity&lt;br/&gt; DNA polymerase</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>High-fidelity DNA polymerase</td></tr><tr><td>BamHI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>NdeI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0532S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>PstI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0140S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1 kb DNA ladder</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Acetate</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass beads (425-600 &amp;micro;m)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNA Loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>1st Base</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>YNB without amino acids</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO Supplement-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Broth</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Biorad</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>Stationary/Shaking Incubator</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-shaker</td><td>Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>BioPhotometer plus</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

genetic engineering of an unconventional yeast for renewable biofuel and biochemical production

ヤロウィアリポリティカは 、非病原性の二形性と厳密に好気性の酵母種です。その独特の生理機能や代謝の特性により、この型破りな酵母は真菌の分化の基本的な性質の研究のための良好なモデルだけではありませんが、また、生化学的生産と大規模な遺伝子操作を必要とする様々な生物工学的適用のための有望な微生物のプラットフォームです。 Y.のが、遺伝子操作リポリティカは 、主KU70遺伝子に起因することができ、効率的かつ安定的な遺伝的形質転換システムの欠如ならびに非相同組換えの非常に高い割合に限定されています。ここでは、効率的な遺伝的形質転換のためにとYにおける遺伝子欠失のための簡単かつ迅速なプロトコルを報告しますリポリティカ Po1g。 Y.への外因性DNAの効率的な形質転換のためにまず、プロトコルリポリティカ Po1gを確立しました。セコndは、標的遺伝子のさらなる削除のために強化された二重交差相同組換え率を達成するために、KU70遺伝子は、1kbの相同性ア ​​ームを担持破壊カセットを形質転換することにより削除されました。第三に、KU70遺伝子の欠失後の増強遺伝子欠失の効果を実証するために、我々は、個別にKU70ノックアウトプラットフォーム株に同じ手順を使用して、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルコールオキシダーゼをコードする11標的遺伝子を削除しました。これは、正確な相同組換えの割合が削除のために0.5％未満の実質的に増加することが観察されました Po1g KU70Δで11標的遺伝子の単一遺伝子欠失のための33％-71％にPo1gでKU70遺伝子の。ハイグロマイシンB耐性マーカーを有する複製プラスミドとのCre / loxPシステムを構築し、酵母ノックアウト株における選択マーカー遺伝子は、最終的にタージェ複数回のを容易にするために、Creリコンビナーゼの発現により除去しましたテッド遺伝子操作。得られた単一遺伝子欠失変異体は、バイオ燃料および生化学的生産において潜在的な用途を有します。

線形化Y.リポリティカ（lipolytica）発現ベクターは、Yのゲノム中のpBRドッキングプラットフォームに挿入し単一交差組換え27を行うことにより、 リポリティカ Po1g株。本研究で確立された迅速な化学変換の手順を使用して、線形化Y.リポリティカ（lipolytica）発現ベクターは、正常&gt; 100 CFU /μgのDNAの形質転換効率で野生型Po1g株...

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Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

genetic-engineering-an-unconventional-yeast-for-renewable-biofuel

Research

JoVE Journal

Genetics

13.5K ビュー.  National University of Singapore. We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

遺伝学

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

インビボ 酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to rapidly consume hexose and pentose mixed sugars in enzyme saccharified undetoxified hydrolyzates and to accumulate over 40 g/L ethanol.

エタノールへのリグノセルロースの生物変換のための堅牢なペントース発酵酵母の進化のための技術

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

生物工学

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

免疫・感染学

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

生物学

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Biofuels: Producing Ethanol from Cellulosic Material

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
In this experiment, cellulosic material (such as corn stalks, leaves, grasses, etc.) will be used as a feedstock for the production of ethanol.&#160;The cellulosic material is first pretreated (ground and heated), digested with enzymes, and then fermented with yeast.&#160;Ethanol production is monitored using an ethanol probe.&#160;The experiment can be extended to optimize ethanol production by varying the feedstock used, pretreatment conditions, enzyme variation, yeast variation, etc.&#160;An alternative method of monitoring the reaction is to measure the carbon dioxide produced (using a gas sensor) instead of the ethanol.&#160;As a low-tech alternative, glucose meters (found in any drug store) can be used to monitor the glucose during the process, if an ethanol probe or carbon dioxide gas sensor is not available.
With an increased emphasis on &#8216;inquiry-based learning&#8221;, scientific probes are becoming more popular.&#160;Handheld devices like the Vernier Lab Quest used in conjunction with a variety of probes (such as those for conductivity, dissolved oxygen, voltage, and more) allow for less focus on collecting data and/or making graphs and more on analyzing the data and making predictions.&#160;Another advantage is that these are small and lightweight and can be taken into the field for measurements.

バイオ燃料: セルロースからのエタノールの生産

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
In this experiment, cellulosic material (such as corn stalks, leaves, ...

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

要約

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ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

インビボ酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

エタノールへのリグノセルロースの生物変換のための堅牢なペントース発酵酵母の進化のための技術

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

指向進化方法で

バイオ燃料: セルロースからのエタノールの生産

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

要約

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ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

インビボ 酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

エタノールへのリグノセルロースの生物変換のための堅牢なペントース発酵酵母の進化のための技術

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

指向進化方法で

バイオ燃料: セルロースからのエタノールの生産

インビボ酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング