ICO、またはICO-seqは、微生物にハイスループットRNAシーケンシングの最初の適応です。この方法は、ゲノムワイドスケールで微生物機能を評価した。工学的微生物の場合、この方法は、微生物ゲノムの変化がその機能を摂動する方法を解明することができる。
懸濁液培養から酵母を得て、ヘモサイトメーターを用いて細胞を数える。1ミリリットル当たり約750,000個の細胞の濃度でPBS中の細胞を再懸濁する。次に、PBSで超低融点アガロースを混合し、アガロースが溶けるまで摂氏90度で混合物を加熱します。
アガロース混合物を注射器にロードし、0.22ミクロンフィルターを取り付けます。80°Cに設定されたスペースヒーターの前にシリンジポンプを置き、ポンプに注射器を置きます。2番目の注射器に酵母懸濁液を充填し、フッ素化油で3番目の注射器を2%イオン性蛍光素で満たします。
両方の注射器をシリンジポンプにロードします。注射器からデバイスAにチューブを接続します。15ミリリットルの円錐チューブをアイスバケツに入れ、出口チューブを円錐チューブに導きます。各シリンジの流量を設定し、15ミリリットルの円錐管に約1ミリリットルのエマルジョンを集める。
チューブ内のアガロースがセットされるまで5分待った後、フッ素化油中の20%パーフルオロオクタノールの等量をエマルションに加える。円錐管を数回反転させることにより、エマルジョンとパーフルオロオクタノールを混ぜます。2分間Gの2,000倍で壊れたエマルジョンを遠心分離する。
ヒドロゲルが油相およびPFO相の上にペレットになっていることを確認してください。油相とPFO相を取り除きます。2 ミリリットルのテト(W)バッファーを加え、ヒドロゲルを再中断します。
サスペンションを新しい15ミリリットルの円錐チューブに移します。2分間Gの2,000倍でチューブを再び遠心分離する。上清を取り除き、テト(W)のヒドロゲルを再び中断します。
2,000回Gでヒドロゲルを2分間回転させた後、2ミリリットルの酵母培養培地でヒドロゲルを再懸濁した。一晩摂氏30度でチューブをインキュベートし、揺れ動かします。各株は異なる速度で成長します。
適切な培地とインキュベーション時間を選択することは、酵母がヒドロゲル内で成長することを保証するために不可欠ですが、過剰増殖せず、細胞が培地に逃げ込む可能性があります。まず、ヒドロゲルを15ミリリットルの円錐管に移します。チューブを2分間Gの2,000倍に遠心する。
ヒドロゲルをPBSで2回洗浄し、次に球状の緩衝液で1回洗浄します。球状緩衝液中の球状酵素の40倍希釈を行う。次に、希釈した酵素を1ミリリットルのヒドロゲルに加える。
ヒドロゲルのチューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。処理された酵母はより透明に見えます。ヒドロゲル懸濁液を含むチューブから、チューブの底部から懸濁液の0.8ミリリットルを引き出し、1ミリリットルの上限のないシリンジに移します。
3D プリントされたシリンジ ホルダーにシリンジを入れます。2分間2,000回Gでシリンジとホルダーを遠心分離する。先に進む前に、ヒドロゲルがシリンジの底にしっかりと詰め込まれているか確認してください。
15ミリリットルの円錐管に240,000ドロップセクビーズを入れる。チューブを1,000倍Gで1分間遠心する。上清を取り除き、500ミリモル塩化ナトリウムで0.9x酵母リシスバッファーの2ミリリットルでビーズを再懸濁します。
攪拌棒を挿入し、ビーズ懸濁液を3ミリリットルのシリンジに移します。フッ素化油中のPFPE-PEG界面活性剤を数ミリリットル含有する別のシリンジを調製する。以前に調製した酵母クローンパックヒドロゲルのシリンジを入手する。
黙認の頭を避難させ、注射器をキャップします。3つのシリンジ、ヒドロゲル、ビーズ懸濁液、オイルをシリンジポンプに挿入します。チューブを介してスポイトをカプセル化装置であるデバイスBに接続します。
出口チューブの端を氷の上の50ミリリットルの円錐管に入れる。各シリンジの流量を設定します。約1,000ミリリットルのエマルジョンを収集するか、残りのヒドロゲルがなくなるまでデバイスを実行します。
次に、cDNA合成、ライブラリの準備、およびシーケンスのための drop-seq プロトコルに従います。マイクロ流体装置を用いて、酵母細胞を160マイクロメートルの液滴に封入した。8倍のスプリッターがこれらの液滴を8つの60マイクロメートルの液滴に分けた。
一晩インキュベーションは、ヒドロゲルの一部の内に成長する等原性酵母コロニーをもたらした。酵母ヒドロゲルを第2のマイクロ流体装置にロードする前に、洗浄し、細胞壁を消化する溶液に浸漬した。適切な消化は顕微鏡検査によって検証され、処理された酵母細胞はより反射的な形態を有する。
リシスバッファー内の mRNA 捕捉ビーズの流れは、第 2 マイクロ流体デバイスのドロップメイキング接合の前に、クローズパック酵母ヒドロゲルの流れと混合した。得られたエマルジョンでは、回収された液滴の約10%が、1つのビーズを、リズしたコロニーと含んでいた。この同種コロニーシーケンシングワークフローは、C.albicansの白色不透明なスイッチング応答を分析するために使用された。
主成分、PC、分析およびtSNE次元低減は、サンプルデータセットと参照データセットとの間の一般的な一般的な一定を示した。TSNE分析は、細胞の3つのクラスターを明らかにしました。クラスター2は主にサンプルデータセットのセルで構成されていましたが、クラスター0と1は両方のサンプルのセルで構成されていました。
tSNE上にWH11発現を重ね合わせ、クラスター1が白色コロニーを含む可能性が高いことを示した。STF2 式はクラスター 1 で増加し、以前に取得したデータと一貫性があります。クラスタ 0 と 2 では、WH11 と STF2 はクラスタ 1 と比較して大幅にダウンレギュレーションされていました。
アンドロゲン微生物は、多種多様な疾患を治療するための生物学的製剤を大量生産する可能性がますます高まっています。この手順に従って、さまざまなバイオインフォマティクスツールを適用して、シーケンシングデータをさらに解析することができます。
