この作品はFPRFPRにYSは、RSLにアルフレッド·P·スローン財団からの助成金、そして健康の助成金は、米国国立衛生研究所R01 HG003224とR21 CA130266に米国国防総省の国防高等研究計画庁契約N66001-12-C-4039でサポートされていたことだったまた、先端研究のためのカナダの研究所からの交わりによっておよびカナダの優秀研究チェアプログラムでサポートされている。

1。 ProMonstersの世代<ol><li> テト2-GFPマーカーおよび配列を有するプライマーを用いてプラスミドpYOGM012（アンピシリン耐性）からURA3マーカーを増幅することによって、普遍的なGFPの交換用カセットを準備します。 GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCGとGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT（太字の地域をターゲットに交換できKanMX4カセットの隣接領域との相同性を提供してください）。 PCR反応は、0.5 ng /μLののテンプレートDNA濃度で始まるPhusionポリメラーゼは、HFバッファ、および3％ジメチルスルホキシド（New England Biolabs）で行われるべきである。 PCRプログラムは98 10秒30秒、98℃35サイクル℃で、49℃で30秒のC、1.5分間72℃である。反応容量は、各形質転換実験に十分なDNAを提供すること&gt;を50μlにする必要があります。私たちは、浄化製品には、列ごとに処理PCR反応の〜50μlでQIAクイックPCR精製キット（Qiagen）を用いますが、精製工程を省略すると、形質転換体の収量を増加させることができる。 あるいは、制限酵素EcoRI（New England Biolabs）を用いてプラスミドpYOGM057（アンピシリン耐性）を消化することによって、標的テト2-GFPおよびKanMX4の相同URA3マーカーと同様、領域を含む断片を放出。この反応におけるDNA濃度は約30 ng /μlにする必要があります。反応容量は&gt; 34μLである必要があります。 KanMX4以外の領域にGFPのカセットを統合するための、適切な相同配列に上記のPCRプライマーの相同領域を調整します。 </li><li>ユニバーサルGFPの削除カセットでKanMX4酵母ノックアウトコレクション12からA-ハプロイド株を形質転換。のウッズとGietz 13 0.34μlを別のプロトコルに続いてDNAサンプル（精製されたPCR産物または非精製制限消化）は、各形質転換実験に使用されるべきです。 CAA-裏プレートに形質転換混合物（0.67％酵母窒素ベース、2％グルコース、0.6％カザミノ酸、0.0025％アデニンヘミ、0.005％トリプトファン、2％寒天）のプレート5分の1。 </li><li>単離されたコロニーを得るために新鮮なCAA-浦プレート上で形質転換体のうちストリーク。 </li><li>成長の欠如を確認するために200μg/ mlのG418を含むYPDAプレート上にコロニー由来の細胞を移す。成功したGFPの統合​​を確認するには、手順（1.5）に従う - （1.9）コロニーPCRを行う。 </li><li> 0.2 mlのPCRチューブや96ウェルプレートのウェルに溶解緩衝液2μl（0.1Mリン酸ナトリウム、pH 7.4、ZymoResearchから1ユニットザイモリアーゼ）にコロニーから採取された細胞を追加します。ピペットチップの内と外液をピペッティング。 </li><li> P200ピペットマン（ギルソン）を使用してミネラルオイルを1滴（約20μL）をオーバーレイ。 </li><li> 37℃で混合物をインキュベート95℃で20分、その後のC℃で10分間。 </li><li> 50μlの水で溶解液を希釈します。 10回inとoutソリューションをピペッティングして混和します。 </li><li>上流の隣接領域にアニールは、シーケンスCCTGAGAAAGCAACCTGACC（カセットの先頭から285 bp）のプライマーと組み合わせること、（A）フォワードプライマーと10μlのPCR反応を用いてライセート1μlを、（B）の逆を分析プライマーその一連GCATTGGGTCAACAGTATAG（端から375 bp）のプライマーと対下流領域にアニール（C）の二つの配列がCGTACTCCTGATGATGCATGと（181 bp）のGACGAAATACGCGATCGCTGとKanMX4にアニールするプライマー、及び（D）は、2つのプライマーをその標的遺伝子の野生型配列（ 図4）にアニールする。削除コレクションで株の約8％が14異数性を含むことが知られているので、（D）は重要です。正しい形質転換体は、正の（A）と（B）と（C）と（D）と負になります。 </li><li>紹介する形質転換にGMToolkitは、形質転換株および1.6 mlのエッペンドルフチューブにRY0146（GMToolkit含有）またはRY0148（GMToolkit-αを含む）のいずれかの250,000個の細胞から約250,000個の細胞を追加します。渦。 RY0146 RY0148との遺伝子型はMATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit-[CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-SP-his5]とMATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit-α[CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr·アールLEU2]、それぞれ。 prはプロモーターを意味する。細胞数は、前培養物の光学密度から推定されるべきである。 </li><li> 2分間、800×gで遠心分離します。 </li><li>上清を取り除きます。 </li><li>空気交換を可能にするために、70％エタノールで処理した画鋲を使用して蓋に穴を開ける。 </li><li> YPDA培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース、および0.003パーセントアデニンhemisulfat50μlを追加e）に示す。渦。 </li><li> 5分間800×gで遠心分離します。 </li><li>湿ったボックスにチューブを置きます。これは、空のチップボックス、小さなチップスタンド、湿らせたペーパータオルを使用して作成できます。 </li><li> 30℃で一晩ボックスをインキュベート℃に</li><li>第一は、CAAの浦プレート上の細胞をストリーキングで交尾二倍体を選択してください。 1日のために30℃で静置します。 </li><li>二倍体を選択するための200μg/ mlのG418を含むYPDAプレート上で単離されたコロニー（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース、0.003％アデニンヘミ、2％寒天）を作るためにバルク領域、ストリークからそれらを細胞を取り出す含むGMToolkit-GMToolkit-αを含む二倍体を選択するか、または100μg/ mlのnourseothricin（NAT）15。 </li><li> 3日間30℃で静置します。 </li><li>隔離されたコロニーから始めて、寒天培地（1％酵母エキス、3％ディフコ栄養ブイヨン、5％ブドウ糖なしでGNA培地500μlに細胞の大部分を移す。オートクレーブグルコースとtの残り彼のコンポーネントは別々としてふたが付いている5mlの培養管でカラメル化を避けるために、2×ソリューション）を緩めた。 </li><li> 30℃で5時間、水平管を回転℃に回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 </li><li>で使用されているコロニーを確認して（1.21）裏は、+ CAA-裏板の上にそれらをストリーキングで。 </li><li> 2分間、800×gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。 </li><li>最小限の胞子形成培地（;フィルター滅菌を1パーセント酢酸カリウム、0.005％酢酸亜鉛）500μlを添加する。渦。 </li><li> 2分間、800×gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。 </li><li>リピート（1.25） - （1.26）倍。 </li><li> 7.5μg/ mlのリジン、7.5μg/ mlのロイシン、5μg/ mlのヒスチジン、5μg/ mlのメチオニン、および1.25μg/ mlのウラシル（栄養要求株の胞子形成率を高めるために）を補充した最小限の胞子形成培地1mlを追加。渦。 </li><li> 1日室温でチューブを回転させます。 </li><li> 2日間30℃でチューブを回転させます。 </li><li> 2分間800 xgで1.6 mlのエッペンドルフチュー​​ブに、この混合物の125μLを遠心分離します。上清を捨てる。 </li><li>ザイモリアーゼ溶液（100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、1Mソルビトール、及びZymoResearchからザイモリアーゼ2単位）の50μlを添加する。ピペットチップの内と外液をピペッティング。 </li><li> 1時間30℃でインキュベートする。 </li><li> 0.02％NP-40の50μlを添加する。ピペットチップの内と外液をピペッティング。 </li><li> 5分間室温でチューブのままにしておきます。 </li><li>水500μlを添加する。 </li><li>チューブを氷上に置きます。 </li><li>ソニファイアー450（ブランソン）と3.2 mmのマイクロチップを使用して15秒に1の出力設定（最弱設定）で二回、この混合物を超音波洗浄します。超音波処理の2ラウンドの間、〜0℃に温度を戻すためにチューブを氷上に置く</li><li> 5分間、800×gで遠心する。上清を捨てる。 </li><li> SC-裏彼を200μl加え（a）またはクロスGMToolkitまたはGMToolkit-αを組み込むためのものであるかに応じて、SC-裏レイ（α）の媒体。メディアを準備するには、SC - 裏のHisレイ培地（0.67％酵母窒素ベース、2％グルコース、0.01％アルギニン0.01％、アスパラギン酸、0.01％グルタミン酸、0.01％イソロイシン0.01％、リジン、メチオニン0.01パーセント作る、0.01％フェニルアラニン、0.08％セリン、0.04％トレオニン、0.002％チロシン、0.03％バリン、0.0025％アデニン、0.005％トリプトファン、0.003％アデニン、0.005％トリプトファン）および滅菌ヒスチジンまたはロイシンでそれを補うために、使用前に最終濃度0.01％になる。 </li><li> 70％エタノールで処理した画鋲を使用して蓋に穴をあけます。 </li><li> 2日間30℃で水平にチューブを回転させます。回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 </li><li> SC-裏彼またはSC-裏レイ寒天プレート（上記と同じ成分を加えた2％寒天上の細胞外ストリークは、トレオニンとアスパラギン酸の後に追加する必要がありutoclaving; ProMonster株の単離されたコロニーを作るために）注ぐ前にヒスチジンまたはロイシンを追加します。 </li></ol> 2。性的サイクリング<ol><li> SC-HIS（）または°Cで一晩1.6 mlエッペンドルフチューブを用いて30℃で交配型に応じて、SC-レイ（α）を100μlの確立されたGFPの欠失株の培養物を回転させます。空気交換のために、70％エタノールで処理した画鋲を使って穴を開ける。水平チューブを回転させます。回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 大挙して交配を介して複数の株を横断することが可能です。ソートされたサンプルは、直接2日間30℃で200μlのこの目的は、培養細胞に使用される場合。 SC-裏のHis-Leuの媒体へとヒスチジン（0.01％）またはロイシン（0.01％）：培地を調製し、ウラシル（0.0025％最終濃度）を追加します。 </li><li> 1.6ミリリットルEPPEで250,000半数体細胞とGFP欠失株25万のα-半数体細胞を混ぜるndorfチューブ。渦。 </li><li> （1.17） - 次の手順（1.11）によって、これらの細胞を交配。 </li><li>緩め蓋を5mlの培養チューブに200μg/ mlのG418および100μg/ mlのナットを含む500μlのGNAの媒体に交配混合物10μlを転送します。出発OD 600がおよそ0.1である。 </li><li> 24時間30℃で培養を回転させます。 GMToolkit-αのGMToolkitとNatMX4でKanMX4両方を含む唯一の二倍体は、G418およびNAT（ 図3）の存在下で増殖することができるので、これは二倍体の選択を可能にする。 </li><li> G418とナットを含む新鮮なGNAの500μlに1日間培養液20μlを転送します。出発OD 600がおよそ0.2である。 </li><li>対数期（〜1のOD 600）にセルを持って来るために5時間30℃でチューブを回転させます。 </li><li>二倍体の胞子形成と胞子を分離するために（1.38） - ステップ（1.24）に従ってください。 </li><li> 2つの300-μLに胞子形成細胞の懸濁液を分割部品と別の1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブにそれぞれを置く。 </li><li> 5分間、800×gで遠心する。上清を捨てる。 </li><li> 1チューブのペレットに、-半数を選択するには、SC-Hisを100μlの培地を追加します。他のチューブのペレットには、α-半数を選択するために、SC-Leuの培地100μlを添加する。 </li><li> 30℃で一晩チューブを回転させます。最終OD 600が 0.5未満でなければなりません。 OD 600が高くなりすぎる場合は、室温で培養することを試みる。 </li><li> GFPを誘導するために、新鮮なSC-HIS（）または20μg/ mlのドキシサイクリンを含むSC-レイ（α）を100μlの培地を追加します。ドキシサイクリンの最終濃度は10μg/ mlである。渦。 </li><li> 2日間30℃でチューブを回転させます。 </li></ol> 3。フローサイトメトリー<ol><li>キャップを5 mlのポリプロピレンチューブ（BDファルコン＃352063）に10μg/ mlのドキシサイクリンを含む事前にフィルタ処理されたTEバッファー900μlの液（pH 7.5）を入れると交換セル5 mLのポリスチレンチューブからストレーナーキャップ（BDファルコン＃352235）。ポリプロピレンチューブは、フローサイトメトリーに適しています。ストレーナーキャップは大きい粒子を除去するために望まれている。 </li><li>優しくセルストレーナーキャップのドキシサイクリンをTE緩衝液75μlを置く。 </li><li>キャップで解決策に誘導された細胞の25μlを添加する。 </li><li>メッシュに対してピペットマンの先端を押しながら、ストレーナーを通して統合ソリューションのすべてを撃つ。 </li><li>ストレーナのキャップを押し下げて、ボルテックスチューブ。 </li><li> SC-HisまたはSC-Leuの200μlでフィルされたコレクションチューブ（1.6 mlのエッペンドルフチュー​​ブ）を用意します。 </li><li>セルソーターを起動し、メーカーの説明書に従って設定を調整します。 </li><li>渦両方コレクションチューブ（コートに媒体と壁）とセルソーターにそれらをロードする前に細胞が入ったチューブ。 </li><li>サンプルのフローサイトメトリーデータを取得する。 GFPを含有していない株はネガティブコントロールすることができます。 </li><li>並べ替えのためにゲートを描きます。 （）高いGFPの強度を発揮することができる細胞凝集を避けるために、FSCの高さのプロットとFSCを用いたパルス幅とパルス高MoFloソーター用または不釣り合いに小さいFSCの高さのプロットを用いて前方散乱（FSC）のために過度に大きなパルス幅の外れ値を破棄FACSAriaセルソーター（ 図5、左上のパネル）の領域。 （B）は大FSC（面積）を細胞凝集のために期待されているので、最低FSCおよび側方散乱（SSC）の細胞破片が頻繁に発見された値を使用して領域を回避しながら、唯一、FSCで下位20％に細胞を取る（ 図5、右上のパネル）。 （C）は、SSC（面積）とGFPシグナルは（面積）は、多くの場合、正の相関がある。単に上記ゲート与えられた最も明るい細胞を取っているので、高SSCの値を持つ細胞を濃縮するでしょう、各点から明るい細胞の同様の比率を取るために、GFP強度およびSSCのプロットを用いて人口の周囲に沿ってゲートを描くSSCの軸（ 図5、ボットのOM-左図）。 （C）で選択された集団は、（B）で選択された人口の0.1から1パーセントでなければなりません。 </li><li> （3.10）で与えられた基準とコレクションチューブに200個の細胞をソートします。必要に応じて一斉にプロセスについてや、より複雑な人口を必要とする他のプロジェクトのために、より多くの細胞をソートします。 </li><li>渦コレクションチューブを培地で選別された細胞をカバーする。 </li><li>プレートジェノタイピング用YPDAプレート上の細胞のサブセット（例えば、50セル）。 </li><li> 2日間30℃で静置します。 </li><li> （1.8） - ステップ（1.5）以下〜12個のコロニーのための溶解液を作る。 </li><li>そっと先端を持つプレートに触れることにより、G418およびNATを含むYPDAプレート上のスポットにで使用されるチップ（1.5）上の残りの細胞を移す。選択された半数は、この板の上に育つべきではありません。二倍体はもっとGFPのコピーを持っていることがあるため、明るくなるかもしれません。このテストでは、半数体選択の効率を示すことができます。 </li><li>タイピングについては、10μlのPCR rを用いてライセート1μlを分析するシーケンスCCTGAGAAAGCAACCTGACCのプライマーと対になって削除された各遺伝子の上流隣接領域にアニールすることをフォワードプライマーとeaction。 可能であれば、多重PCR反応（条件は単一の変異体の溶解液を用いて決定することができる）。または384ウェルフォーマット - PCRは96で行うことができます。後者の形式は、わずか5μlの反応容量に適しています。マルチチャンネルピペットまたは液体ハンドリングロボットを用いて行うことができるPCRマスターのアレイ化するプライマー及びこれらの混合物に、細胞溶解物のほかに異なるミックス。異なるPCRミックスに同じライセートを追加するときにチップの変更は省略可能です。 </li><li> PCR産物を分析します。ジェルXLウルトラV-2の電気泳動システム（Labnet）は、マルチチャンネルピペットを用いて試料のローディングと互換性があります。 </li><li>からの情報（3.16）と（3.18）をもとに、遺伝子型を希望している可能性半数体を識別します。 </li><li>新鮮なプレート（YPDA、CAAの浦、またはSC-Ura-His/Leu）にこれらの株を確立します。また、それらの凍結-80℃で25％グリセロール℃、そのような削除された遺伝子およびパルスフィールド·ゲル電気泳動のための野生型配列の有無の確認などの追加テストが推奨されています。 </li><li>有用菌株と（2.1）から性的サイクルを繰り返します。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

我々はグリーンモンスターアプローチを開発したように、我々は、ゲノム再編成につながる、異なるGFPの交換カセット間の組換えの可能性に関心を持っていた。このような事態を軽減することに成功交配と減数分裂の複数のラウンドを受けた細胞のための私達の選択である。再配列ゲノムを持つ細胞は、同一の再調整なしに細胞に交配後少なくフィットすることが期待されています。実際、?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や器具の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> G418 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A1720 </td><td> （0.2μmフィルター）を水に溶解し、フィルター滅菌してください。ストック濃度：200 mg / mlである。 4℃で保存する</td></tr><tr><td> ClonNAT（nourseothricin） </td><td>ヴェルナー生体物質</td><td> 5001000 </td><td> （0.2μmフィルター）を水に溶解し、フィルター滅菌してください。ストック濃度：100 mg / mlである。 4℃で保存する</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D9891 </td><td> 50％エタノールに溶解し、フィルター滅菌（0.2μmフィルター）。ストック濃度：10 mg / mlである。 4週間ごとに新鮮なことを確認します。 4でアルミ箔とストアを使用して光からシールド℃の</td></tr><tr><td>ザイモリアーゼ</td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco酵母窒素ベースW / Oアミノ酸</td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td>リボルバー（チューブ用回転子） </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td>エンデューロジェルXLの電気泳動装置</td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td>ソニファイアー450 </td><td>ブランソン</td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td>ソニファイアー450用マイクロチップ</td><td>ブランソン</td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAriaセルソーター</td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFloセルソーター</td><td>ベックマン·コールター- </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FXまたは同等のロボット</td><td>ベックマン·コールター</td><td></td><td>オプション。ジェノタイピングPCRを設定するため。 </td></tr></tbody> &lt;/ TABLE&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

遺伝子欠失のための表現型は、しばしば突然変異が特定の遺伝的背景や環境条件1,2でテストされているときにのみ明らかにされています。多くの遺伝子が隠された遺伝子の機能3,4のマスクを解除するために削除する必要がある例があります。重要な発見の可能性にもかかわらず、3つ以上の遺伝子が関与する遺伝的相互作用は、主に未踏されています。マルチ変異体の相互作用の網羅的な検索が欠失の可能な組み合わせの膨大な数のために現実的ではありません。しかし、このような共通機能を共有することの大きいアプリオリの確率でパラログのセットなどの遺伝子の選択セットの研究は、有益であろう。 酵母 Saccharomyces cerevisiaeにおいて、遺伝子ノックアウトは、相同組換えを介した選択マーカーと遺伝子を交換することによって達成されます。マーカーの数が限られているので、このメソッドでは、SAMを削除し、再利用のために開発されている<html>電子マーカー5,6,7,8,9,10。時間が生成される削除の数に比例して直線的に必要なので、これらのメソッドを使用して順次工学複数の変異は時間がかかります。 ここでは、日常的に酵母11に複数の削除を工学のためのグリーンモンスター方法を説明します。この方法では、削除に統合された緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターが定量的に各菌株に含まれる削除の数（ 図1）に記載の菌株にラベルを付けるために使用されています。これらの欠失の多くを運ぶ株のフローサイトメトリー濃縮と相まって酵母の接合と減数分裂を経由して、GFP-著しい失の品揃えの繰り返しラウンドは株の欠失（ 図2）の蓄積につながる。各プロセスがラウンドごとに1つ以上の欠失を組み込むとともに、並行して複数のプロセスを実行し、ひずみ建設に必要な時間が短縮されます。 GFPの削除された遺伝子座でのレポーターや&quot;ツールキット&quot;座·どちらグリーンモンスターGMToolkitまたは少なくともGMToolkit-αの1を運びそれぞれのコンテンツは、 &quot;&gt;と呼ばれる最初のステップは、半数体、単変異体を作製することは&#39;ProMonsters、&#39; can1Δ軌跡（ 図3）酵母削除コレクション12から菌株を用い、GFP顕著な欠失が便利なユニバーサルGFPでこれらの株に存在する共通のKanMX4カセット交換することによって生成することができます- URA3断片を各GMToolkitが含まれています。どちらか-またはα接合型特異半数体選択マーカー1とその2つのマーカーのちょうど1つ、両方GMToolkitsが存在する場合に、一括して二倍体の選択を可能にする。 第二段階は、欠失遺伝子座がランダムな組み合わせ、および/または減数recombにより単一細胞内で組み合わせることができるような性的サイクリングを実施することである交配と胞子形成の各サイクルを伴うもののみ。

4、GFP-著しい欠損を（ycl033cΔyer042wΔykl069wΔyol118cΔ）を運ぶのa-ハプロイド株は4失を運ぶのα-ハプロイド株と交配したとき（ycl033cΔydl242wΔydl227cΔyer042wΔ）、2つの欠失を持つ（ycl033cΔyer042wΔ）2系統、代表で共有結果が得られた。交配混合物は、二倍体を選択するには、G418およびNATを含むYPDA培地で培養した。結果として二倍体は、胞子形成培地で培養した。胞子?...

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The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

グリーンモンスターメソッドは、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子でマークされた複数の削除を迅速に組み立てることができます。このメソッドは、性的失の品揃えや、その他の欠失を保有する細胞の蛍光ベースの濃縮の繰り返しサイクルを通して酵母菌株を駆動に基づいています。

複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

the-green-monster-process-for-generation-yeast-strains-carrying

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K ビュー.  J. Craig Venter Institute. グリーンモンスターメソッドは、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子でマークされた複数の削除を迅速に組み立てることができます。このメソッドは、性的失の品揃えや、その他の欠失を保有する細胞の蛍光ベースの濃縮の繰り返しサイクルを通して酵母菌株を駆動に基づいています。

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

ライブ固定化酵母細胞の可視化のための高速手法

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

生物学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

核輸送の1分子イメージング

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

超微細構造解析のための酵母エンドソーム系のナノゴールドラベル付け

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

酵母Proteinopathyモデルを用いた増強Hsp104のバリアントを分離

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...