Name: genetic engineering of an unconventional yeast for renewable biofuel and biochemical production
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production at JoVE.com

우리는 기꺼이 싱가포르 (ETRP 1201102) 국립 환경 기관에서 자금 지원을 인정, 싱가포르 국립 연구 재단 (NRF-CRP5-2009-03), 싱가포르의 과학, 기술 및 연구를위한 기관의 경쟁력 연구 프로그램 ( 1,324,004,108), 글로벌 R &amp; D 프로젝트 프로그램, 지식 경제부, 한국 (N0000677), 국방 위협 감소기구 (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) 및 합성 생물학 싱가포르 국립 대학의 이니셔티브 ( DPRT / 943 / 09 / (14)).

Y.의 1 세대 lipolytica KU70 삭제 스트레인 <ol><li> 붕괴 카세트의 건설 주 : 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 사용 된 모든 프라이머는 표 1 참조. <ol><li> 는 Leu2 발현 카세트를 증폭하기위한 PCR 프라이머 디자인 (20)는 Y.부터 (표 1 참조) 각각과, 긴 역방향 프라이머 (표 1 # 2) lipolytica 발현 벡터 및 5 &#39;및 3&#39;에에 loxP 부위를 도입 긴 정방향 프라이머 (표 1의 1)과는 Leu2 카세트 끝. 복제 프로세스의 다음 단계에 대한 추가 제한 사이트를 소개하고, 프라이머 # 1에서 빵 HI 제한 사이트를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 표 2에 설명 된대로 높은 충실도 DNA 폴리머 라제를 사용하여 PCR을 수행한다. </li><li> PCR의의 purificatio를 사용에 loxP-프로모터는 Leu2 - 터미네이터에 loxP 카세트 PCR 생성물을 정제하여제조업체의 지침에 따라 n 개의 키트. 제조업체의 지침 (21)에 따라 정제 된 PCR 제품에 3&#39;-A의 돌출을 추가합니다. 사용 T4 DNA 리가 아제는 표 3에 따라 플라스미드 T-는 Leu2를 얻을 수있는 TA 클로닝 벡터에 A-꼬리 PCR 제품을 결찰합니다. </li><li> PCR은 프라이머 Y.에서의 # 3 / # 4를 사용 KU70 유전자 1킬로바이트 5 &#39;상류 서열을 증폭 lipolytica PO1G 표 2에 따라 게놈 DNA 22. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. <ol><li> 더블. 표 4에 따라 골목 II의 BamHI 및 효소 정제 된 PCR 생성물 및 T-는 Leu2 플라스미드 모두 소화 제조사의 지침에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 정제를 결찰하는 T4 DNA 리가 제를 사용하여 골목 II로 PCR 생성물을 분해 / T-는 Leu2의 빵 HI 부위를을 수득표 3에 따라 플라스미드 T-LEU2-5E. </li></ol></li><li> PCR은 프라이머 Y.에서의 # 5 / # 6을 사용 KU70 유전자 1킬로바이트 3 &#39;하류 서열을 증폭 lipolytica PO1G 표 2에 따라 게놈 DNA 22. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. 두 번 정제 된 PCR 제품 및 표 4에 따라 없음 I 및 이니까 I 효소와 T-LEU2-5E 플라스미드를 모두 소화. <ol><li> 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제. 이어서, 정제를 결찰하고 없음 I / 이니까 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 플라스미드 T-KO를 수득 T-LEU2-5E의 I 사이트로 PCR 생성물을 소화. </li></ol></li><li> 붕괴 카세트를 생산하기 위해 표 4에 따라 골목 II 및 이니까 I 효소로 플라스미드 T-KO 다이제스트 (그림 1 </strong&gt;). 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 DNA 단편을 정제 하였다. </li></ol></li><li> 유능한 세포의 준비와 Y의 변환 lipolytica PO1G 변형 <ol><li> 관할 세포의 준비 <ol><li> Y.의 식민지 접종 YPD 배지 10 ㎖ (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 덱스 트 로즈, 50 mM의 시트르산 염 완충액 pH 4.0) 100 mL의 플라스크에서 신선한 효모 추출물 - 펩톤 - 덱 스트로스 (YPD) 플레이트에서 lipolytica PO1G 균주. 포화 될 때까지 20 시간 (분광 광도계를 이용하여 측정 한 OD 약 15의 600)를 위해 225 rpm에서 30 ° C 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션. </li><li> 실온에서 5,000 × g으로 5 분간 원심 분리하여 세포를 펠렛. 20 ml의 트리스 EDTA (TE) 버퍼 (10 mM 트리스, 1 mM의 EDTA, pH를 7.5)로 세포를 씻어 단계 1.2.1.2에 설명 된대로 세포 펠렛. (아세트산으로 pH를 6.0으로 조정) 0.1 M 리튬 아세테이트 1 ml의 세포를 재현 탁하고, 실내 템페에서 10 분 동안 배양rature. </li><li> 멸균 1.5 ml의 튜브에 관할 세포 (100 μl를) 나누어지는. 바로 아래의 변형 단계로 진행, 또는 장기간 저장을 위해 -80 ℃에서 최종 농도가 25 % (v / v)의 저장에 글리세롤을 추가한다. </li></ol></li><li> 변환 <ol><li> 부드럽게 적격 세포 100 ㎕와 함께 변성 연어 정자 DNA (10 ㎎ / ㎖) 및 정제 붕괴 카세트 1-5 μg의 10 μL를 혼합하고, 15 분 동안 30 ℃에서 배양한다. </li><li> (0.1 M 리튬 아세테이트의 pH 6.0에 용해) 40 % 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) -4000 700 μl를 추가, 잘 혼합하고 60 분 동안 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 배양한다. 주 : 대신에 (일반적으로 종래의 효모의 형질 전환에 사용 된)의 PEG-3350, 4000의 평균 분자량 PEG를 사용하는 것이 중요하다. </li><li> 가열은 60 분 동안 39 ° C의 물을 용기에 튜브를 배치하여 전환 혼합물 충격. </li><li> 1 ml의를 YPD 매체를 추가하고30 ° C에서 2 시간, 225 rpm으로 대한 복구 할 수 있습니다. 실온에서 1 분 동안 9000 × g으로 원심 분리기, 상등액을 제거하고 TE 완충액 1 ml 중에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 실온에서 1 분 동안 9000 × g으로 원심 분리하여 세포를 Repellet하고 상층 액을 제거한다. TE 완충액 100 ㎕에 펠렛을 재현 탁하고 선택적 플레이트 (예를 들어, 류신 - 결핍 플레이트) 위에 플레이트 2-3 일 동안 30 ° C에서 배양한다. </li><li> 10 단일 콜로니 4를 선택하고 YPD 배지 2 ㎖에 개별적으로 접종. 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 하룻밤 품어. 각각의 프라이머 # 55 / # 56의 두 세트, 그리고 # 56 / # 57을 사용하여 표 5에 따라 형질 전환 (22)로부터 게놈 DNA의 PCR 분석에 의해 긍정적 인 식민지를 확인합니다. 참고 : 없음 나는 pYLEX1 벡터 (Y)로 변환된다 선형화 수를 카운트하여 변환 효율을 결정하기 위해 lipolytica PO1G는 적격 세포μg의 플라스미드 당 집락 형성 단위 (CFU)의 DNA는 23을 사용했다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 마커 구조 <ol><li> Cre 호텔 발현 플라스미드의 구축 <ol><li> pYLEX1-CRE와 pYLEX1-HPH의 건설 <ol><li> 디자인 프라이머 (20)는 CRE와 HPH의 오픈 리딩 프레임을 증폭 PCR합니다. 포워드 프라이머 # 82, # 84에 시작 코돈의 상류 추가 아데닌 뉴클레오티드를 추가하고, PCR은 CRE의 오픈 리딩 프레임을 증폭 역방향 프라이머 # 83, # 85을에서 정지 코돈의 하류 KPN I 제한 사이트를 삽입하고 표 2에 따라 pSH69 (수탁 번호 HQ412578) (24)로부터 HPH. </li><li> CRE 제조업체의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용 HPH 단편 모두 정제. 다이제스트 모두 내가 TABL에 따라 효소 KPN과 정제 된 CRE와 HPH 조각예 4.. 표 4에 따라 PML KPN I 및 I 효소로 pYLEX1 플라스미드 다이제스트 두배 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. </li><li> Y.의 PML I / KPN I 사이트에 정제 및 소화 CRE와 HPH 조각을 결찰 표 3 당으로 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 각각 pYLEX1-CRE와 pYLEX1-HPH를 산출 lipolytica 발현 벡터. </li></ol></li><li> pSL16-CRE-HPH의 건설 <ol><li> PCR 프라이머의 # 86을 사용 pYLEX1-CRE에서 CRE의 프로모터 유전자 터미네이터 카세트를 증폭 / # 87 표 2에 따라, 샐 I / pst 파일 I 제한 부위를 플 랭킹. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하여 . <ol><li> 두 살 난과 함께 정제 된 PCR 제품 및 pSL16-CEN1-1 (227) 플라스미드 (25)을 모두 소화PST 표 4에 따라 I 효소. 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 이어서, 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용 pSL16-CRE을 만드는 대응하는 부위에서 pSL16-CEN1-1 (227)로 분해하고 정제 PCR 생성물을 결찰. </li></ol></li><li> PCR 프라이머를 사용 pYLEX1-HPH에서 HPH의 프로모터 유전자 터미네이터 카세트를 증폭 # 88 / # 89. 표 2에 따라,을 XhoI /을 BglII 제한 부위를 플 랭킹 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하여 . <ol><li> 더블. 정제 된 PCR 생성물 및 표 4에 따라,와을 XhoI을 BglII 효소 pSL16-CRE 플라스미드 모두 소화 제조사의 지침에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 그리고, 대응에 pSL16-CRE로 정제 절단 PCR 생성물을 결찰위치는 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용 pSL16-CRE-HPH를 생성한다. 참고 : 결과 Cre 호텔 발현 플라스미드, pSL16-CRE-HPH는, 선택 가능한 하이 그로 마이신 B 마커를 항구 및 센트로 미어와 에피 좀 복제 벡터 (그림 2)입니다. </li></ol></li><li> 표 4에 따라 적절한 제한 효소 (예를 들어, 샐 I / 태평양 표준시 나는, 벡터에서 삽입을 절제하는)와 소화에 의해 모든 구조를 확인합니다. </li></ol></li></ol></li><li> CRE 재조합 효소 매개 마커 구조 <ol><li> 위의 섹션 1.2에 설명 된 변환 프로토콜 다음 KU70 녹아웃 균주의 유능한 세포로 pSL16-CRE-HPH 변환. YPD 플러스 하이 그로 마이신 B 상에 플레이트 형질 전환 세포 (YPDH) 플레이트 (400 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신 B를 포함), 그리고 2 ~ 3 일 동안 30 ° C에서 품어. </li><li> 표 5에 따라 식민지 PCR을 수행하여 프라이머 # 84 / # 85 긍정적 인 식별변환 후 pSL16-CRE-HPH 플라스미드를 함유하는 콜로니. 주 : # 84 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 # 85 HPH 유전자 (표 1)의 코딩 영역의 내부에 위치한다. 양성 클론 만이 PCR 반응에서 특정 PCR 생성물을 생성한다. </li><li> 긍정적 인 복제를 선택하고 YPDH 매체 2 ㎖에 접종하고, 포화 밤새 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 배양한다. 분광 광도계로 OD 셀 (600)을 측정한다. ~ (15)의 OD 600에서 세포를 수확. 실온에서 5 분 동안 5000 × g으로 원심 분리하고, 멸균 수 2 ㎖로 한번 세척 하였다. </li><li> 초기 OD 0.1 600 YPD 배지 2 ㎖로 세포를 재 접종하고, 세포를 밤새 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 성장을 허용한다. 킬 YPD 플레이트 상에 하룻밤 세포 배양은 단일 콜로니 (23)를 분리합니다. 복제 판 YPD, YPDH 위에 식민지, 그리고 류신 결핍 판 (23) </s&gt;입니다. 참고 : (그림 3) 모두는 Leu2 마커를 잃고 pSL16-CRE-HPH 플라스미드는 YPD 플레이트에서 성장할 수 식민지를. </li></ol></li></ol> 알코올 탈수소 효소와 알코올 산화 효소 유전자의 3. 삭제 <ol><li> Y.에서 검색을 수행 삭제 26 유전자 후보들을 식별하는 기본 로컬 맞춤 검색 도구 (BLAST)를 사용 lipolytica 게놈 데이터베이스. 입력 S. 단백질 서열 BLAST 검색 도구로 cerevisiae의 알코올 탈수소 효소 I을 (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;db=yli&amp;seqid=aa). 주 : BLAST 검색 도구가 Y. 가장 유사한 단백질 서열을 반환 lipolytica 게놈 데이터베이스. </li><li> # 56 (표 1)에 프라이머 번호 7 PCR로 결실 카세트를 구축하고, 제한 효소 절단 및 상기 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 동일한 방법을 이용하여 라이 게이션 반응을 수행한다. </li><li> 예습KU70 녹아웃 균주의 유능한 세포는있다 변환을 수행하고 위의 섹션 1.2에 설명 된 프로토콜에 따라 # 81 (표 1)에 # 55 프라이머, # 58 긍정적 인 식민지를 식별하기 위해 PCR을 수행합니다. 참고 예로서, YALI0E17787g 유전자의 삭제를위한 절차는도 4 및 5에 기재되어있다. 상동 재조합 속도에 1킬로바이트 및 2킬로바이트 긴 상동 지역의 효과를보고있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Jim&#233;nez-Bremont, J. F., Rodr&#236;guez-Hern&#225;ndez, A. A., Rodr&#236;guez-Kessler, M., J, R. u. i. z. -. H. e. r. r. e. r. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. , 58-66 (2012).</li><li>Coelho, M., Amaral, P., Belo, I., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. , 930-940 (2010).</li><li>Martinez-Vazquez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+transcription+factor+Znc1p,+which+regulates+the+yeast-to-hypha+transition+in+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica.">Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Plos One. 8 (6), e66790 (2013).</li><li>Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagging+morphogenetic+genes+by+insertional+mutagenesis+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica.">Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).</li><li>Flores, C. L., Mart&#236;nez-Costa, O. H., S&#225;nchez, V., Gancedo, C., Arag&#242;n, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica+possesses+an+atypical+phosphofructokinase:+characterization+of+the+enzyme+and+its+encoding+gene.">The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene.</a> Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).</li><li>Dom&#236;nguez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conventional+yeasts+as+hosts+for+heterologous+protein+production.">Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production.</a> Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).</li><li>Zinjarde, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food-related+applications+of+Yarrowia+lipolytica.">Food-related applications of Yarrowia lipolytica.</a> Food Chem. 152, 1-10 (2014).</li><li>Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acid+production+by+the+yeast+Yarrowia+lipolytica:+a+review+of+prospects.">Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects.</a> Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).</li><li>Groguenin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+the+&#946;-oxidation+pathway+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica+to+increase+the+production+of+aroma+compounds.">Genetic engineering of the &#946;-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiesel+production+from+oleaginous+microorganisms.">Biodiesel production from oleaginous microorganisms.</a> Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).</li><li>Papanikolaou, S., Aggelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+production+by+Yarrowia+lipolytica+growing+on+industrial+glycerol+in+a+single-stage+continuous+culture.">Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture.</a> Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).</li><li>Tai, M., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+push+and+pull+of+lipid+biosynthesis+in+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+for+biofuel+production.">Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production.</a> Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).</li><li>Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+applications+of+Yarrowia+lipolytica:+Past,+present+and+future.">Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future.</a> Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).</li><li>Liu, L., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draft+genome+sequence+of+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+PO1f,+a+commonly+used+metabolic+engineering+host.">Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host.</a> Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).</li><li>Dujon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+yeasts.">Genome evolution in yeasts.</a> Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).</li><li>Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+transformation+of+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica.">One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).</li><li>Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+electroporation+of+Yarrowia+lipolytica.">High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica.</a> J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).</li><li>Matsuoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+regions+essential+for+the+function+of+chromosomal+replicator+sequences+from+Yarrowia+lipolytica.">Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica.</a> Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).</li><li>Kretzschmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+homologous+integration+frequency+in+Yarrowia+lipolytica+strains+defective+in+non-homologous+end-joining.">Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining.</a> Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+blunt-end+DNA+fragments+into+the+pGEM-T+Vector+Systems.">Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems.</a> Promega Notes. 62, 15-18 (1997).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).</li><li>Hegemann, J. H., Heick, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delete+and+repeat:+a+comprehensive+toolkit+for+sequential+gene+knockout+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).</li><li>Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+centromeric+DNA+from+yeast+Yarrowia+lipolytica+and+identification+of+protein-binding+site+required+for+plasmid+transmission.">Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission.</a> J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).</li><li>McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST:+at+the+core+of+a+powerful+and+diverse+set+of+sequence+analysis+tools.">BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools.</a> Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).</li><li>Madzak, C., Tr&#233;ton, B., Blanchin-Roland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+hybrid+promoters+and+integrative+expression/secretion+vectors+for+quasi-constitutive+expression+of+heterologous+proteins+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica.">Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).</li><li>Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yarrowia+lipolytica,+a+yeast+model+for+the+genetic+studies+of+hydroxy+fatty+acids+biotransformation+into+lactones.">Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 연구에 대한 우리의 목적은 Y.에서 대상 유전자 녹아웃의 신속하고 효율적인 생성을 활성화하는 것입니다 이를 위해 lipolytica PO1G 균주. 몇몇 고려 해결 될 필요가있다. 먼저, 높은 변환 효율이 요구된다. Y.에 대한 따라서, 효율적이고 편리한 화학 변환 프로토콜 lipolytica PO1G 균주는 본 연구에서 설명했다. PEG-4000의 사용은이 균주의 성공적인 전환을위한 중요한 ?...

사카로 마이 세스 세레 비지에, Yarrowia의 lipolytica, 비 전통적인 효모와는 달리, 환경 조건의 1, 2의 변화에 대응하여 효모 또는 균사의 형태로 증가 할 수 있습니다. 따라서,이 동종 이형 누룩 곰팡이 분화, 형태 형성 및 분류 3,4,5- 연구를위한 좋은 모델로서 사용될 수있다. 이것은 일반적으로 널리 유기산, 폴리 알콜, 아로마 화합물, 유화제 및 계면 활성제로 -6,7,8,9- 식품 첨가물의 종류를 생성하기 위해 사용되는 안전한 (GRAS) 효모 종으로 간주된다. 이는 최대 10 세포 건조 중량의 70 %를하기 위해, 의무적의 aerobe 자연스럽게 다량으로 지질을 축적 할 수있는 공지의 유성 효모, 즉이다. 또한 영양소 11,12,13 같은 폐 자원 잔기의 종류를 포함한 성장 탄소원의 넓은 스펙트럼을 이용할 수있다. 이러한 독특한 기능은 모두 Y.을 매우 매력적인 lipolytica다양한 생명 공학 응용 프로그램. Y.의 전체 게놈 서열 비록 lipolytica가 14, 15을 게시되었습니다,이 틀에 얽매이지 않는 효모의 유전자 조작은 다른 효모 종보다 더 복잡합니다. 첫째, 효모 종의 변화로 인해 안정하고 효율적인 유전자 변환 시스템 (16, 17)의 부재에 훨씬 덜 효율적이다. 에피 솜 본연 플라스미드 시스템이 효모 (18)에서 발견되지 않은 둘째, 선형 발현 카세트의 게놈 통합 힘든 공통 관심 유전자의 발현에 사용된다. 이 효모에 정확한 상동 재조합을 통해 효율성을 대상으로 유전자가 낮은 대부분의 통합 이벤트가 비상 동 말단 연결 (NHEJ) (19)를 통해 발생하기 때문에 유전자 노크 아웃 및 노크 인의 셋째, 세대가 제한됩니다. 본 연구에서는 Y.에 최적화 된 변환 프로토콜 신고 lipolytica </EM&gt;, 쉽고 빠르게, 효율적이고 재현 PO1G 변형,. 정확한 동성 재조합 빈도를 향상시키기 위해, 우리는 NHEJ 경로에서 중요한 효소를 코딩하는 유전자를 KU70 삭제. 최적화 된 변환 프로토콜을 사용하고, 1킬로바이트의 Y. KU70의 유전자를 상동 영역을 포함하는 선형 측면 녹아웃 카세트를 변환하여 lipolytica PO1G가 성공적으로 삭제되었습니다. 이 유전자 삭제 방법의 견고성은 다음 PO1G KU70 Δ 변형 알코올 탈수소 효소와 알코올 산화 효소 유전자를 대상으로 입증되었다. 그것은 KU70 결실 균주는 야생형 균주 PO1G보다도 타겟팅 동성 재조합을 매개 유전자의 상당히 높은 효율을 발휘하는 것이 확인되었다. 또한, 하이 그로 마이신 B 내성의 마커를 운반하는 복제 성 Cre 호텔 발현 플라스미드는 마커 복구를 수행하도록 구성 하였다. 마커 구조는 일에 대상 유전자의 여러 라운드를 용이하게전자는 유전자 결실 돌연변이를 획득했습니다. 유전자 삭제 게다가, 여기에 설명 된 유전자 변형 및 유전자 삭제를위한 우리의 프로토콜은 특정 유전자좌에 유전자를 삽입하고, Y.로 사이트 별 돌연변이를 소개하고 적용 할 수 있습니다 lipolytica 게놈.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>25 nmole DNA oligos</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Y. lipolytica&lt;/em&gt; strain Po1g</td><td>Yeastern Biotech</td><td></td><td>leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)</td></tr><tr><td>Vector pYLEX1</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>&lt;em&gt;Y. lipolytica&lt;/em&gt; expression vector</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>For cloning and propagation of plasmids</td></tr><tr><td>pGEM-T vector&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA cloning vector</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>For plasmid isolation</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and&lt;br/&gt; PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Extract DNA fragments from agarose gels&lt;br/&gt; and purify PCR products from an amplification reaction</td></tr><tr><td>The iProof high-fidelity&lt;br/&gt; DNA polymerase</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>High-fidelity DNA polymerase</td></tr><tr><td>BamHI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>NdeI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0532S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>PstI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0140S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1 kb DNA ladder</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Acetate</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass beads (425-600 &amp;micro;m)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNA Loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>1st Base</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>YNB without amino acids</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO Supplement-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Broth</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Biorad</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>Stationary/Shaking Incubator</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-shaker</td><td>Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>BioPhotometer plus</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

genetic engineering of an unconventional yeast for renewable biofuel and biochemical production

Yarrowia의 lipolytica는 비 병원성 동종 이형 엄격 호기성 효모 종입니다. 독특한 생리 기능과 신진 대사 특성으로 인해,이 틀에 얽매이지 않는 효모뿐만 아니라 곰팡이 차별화의 기본 성격의 연구를위한 좋은 모델뿐만 아니라 생화학 적 생산과 광범위한 유전자 조작을 필요로 다양한 생명 공학 응용을위한 유망한 미생물 플랫폼입니다. Y.의 그러나, 유전자 조작 lipolytica 인해 주로 KU70 유전자에 기인 할 수있는, 효율적이고 안정적으로 유전자 형질 전환 시스템의 부족뿐만 아니라 비 - 상 동성 재조합의 매우 높은 속도로 제한되었다. 여기, 우리는 효율적인 유전자 변환에와 Y 유전자 삭제 쉽고 빠른 프로토콜을보고 lipolytica PO1G. Y.로 외래 DNA의 효율적인 변환을위한 우선, 프로토콜 lipolytica PO1G가 설립되었다. 세코ND, 표적 유전자의 추가적인 삭제 향상된 이중 교차 상동 재조합 율을 달성하기 위해 유전자는 KU70 1킬로바이트 동성 암 반송 파쇄 카세트 바뀌는 삭제 하였다. 셋째, KU70 유전자의 삭제 후 향상된 유전자 결실 효율을 입증하기 위해, 우리는 개별적 KU70 녹아웃 플랫폼 균주에서 동일한 절차를 사용하여 알코올 탈수소 효소, 알코올 산화 효소를 코딩하는 11 표적 유전자를 삭제. 이것은 정확한 상동 재조합 속도가 삭제 0.5 % 미만에서 실질적으로 증가하는 것이 관찰 PO1G KU70 Δ 11에서 표적 유전자의 단일 유전자 결실에 대한 33 % -71 %의 PO1G에서 KU70 유전자. 하이 그로 마이신 B 내성 마커와 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 운반하는 복제 성 플라스미드를 구축하고, 효모 녹아웃 균주의 선별 마커 유전자는 결국 타지 여러 발사를 용이 Cre 호텔 재조합 효소의 발현에 의해 제거테드 유전자 조작. 그 결과 단일 유전자 삭제 돌연변이 생물 연료 및 생화학 생산에 응용 가능성이 있습니다.

선형화 된 Y. lipolytica 발현 벡터 Y.의 게놈에 PBR 도킹 플랫폼에 삽입 하나의 크로스 오버 재조합 (27)를 수행하여 lipolytica PO1G 변형. 본 연구에서 확립 급속 화학 변환 절차, Y. 선형화를 사용하여 lipolytica 발현 벡터 성공적&gt; 100 CFU / μg의 DNA의 변환 효율 야생형 PO1G 균주에 형질 전환 하였다. 1킬로바이트 상동 서열에 의해 형벌 녹아?...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production at JoVE.com

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

genetic-engineering-an-unconventional-yeast-for-renewable-biofuel

Research

JoVE Journal

Genetics

13.6K 조회수.  National University of Singapore. We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

비디오: Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

연구

유전학

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

생체 내 Monitoring of transcriptional activity during metabolic transition using a bioluminescent reporter in yeast(효모의 생물발광 리포터를 사용한 대사 전이 중 전사 활동 모니터링)

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to rapidly consume hexose and pentose mixed sugars in enzyme saccharified undetoxified hydrolyzates and to accumulate over 40 g/L ethanol.

에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

생체공학

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

면역학 및 감염병학

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

액적 기반 RNA 시퀀싱을 통한 높은 처리량 효모 균주 현상태핑

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

생물학

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Biofuels: Producing Ethanol from Cellulosic Material

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
In this experiment, cellulosic material (such as corn stalks, leaves, grasses, etc.) will be used as a feedstock for the production of ethanol.&#160;The cellulosic material is first pretreated (ground and heated), digested with enzymes, and then fermented with yeast.&#160;Ethanol production is monitored using an ethanol probe.&#160;The experiment can be extended to optimize ethanol production by varying the feedstock used, pretreatment conditions, enzyme variation, yeast variation, etc.&#160;An alternative method of monitoring the reaction is to measure the carbon dioxide produced (using a gas sensor) instead of the ethanol.&#160;As a low-tech alternative, glucose meters (found in any drug store) can be used to monitor the glucose during the process, if an ethanol probe or carbon dioxide gas sensor is not available.
With an increased emphasis on &#8216;inquiry-based learning&#8221;, scientific probes are becoming more popular.&#160;Handheld devices like the Vernier Lab Quest used in conjunction with a variety of probes (such as those for conductivity, dissolved oxygen, voltage, and more) allow for less focus on collecting data and/or making graphs and more on analyzing the data and making predictions.&#160;Another advantage is that these are small and lightweight and can be taken into the field for measurements.

바이오 연료: 셀룰로오스 물질에서 에탄올 생산

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
In this experiment, cellulosic material (such as corn stalks, leaves, ...