Name: generation of induced pluripotent stem cells from human melanoma tumor-infiltrating lymphocytes
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes at JoVE.com

We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

NOTA: I pazienti devono dare il consenso informato a partecipare al Institutional Review Board e pluripotenti umane staminali Comitato cellulare ha approvato lo studio. 1. Isolamento e la coltura di TIL <ol><li> Ottenere materiale tumorale che non è necessario per la diagnosi istopatologica dal nucleo di appalto del servizio di patologia / tessuto. Posizionare 20-100 g di campioni tumorali in una provetta da 50 ml con 30 ml supporti tumorali raccolta (Tabella 1). </li><li> Sezionare solido, fermo, tessuto normale del campione di tumore da aree necrotiche fragili e / o con sangue con le forbici. Dopo aver rimosso il tessuto necrotico, utilizzare le forbici per sminuzzare il campione più piccolo possibile. </li><li> Dissociare il campione tritato in una cella singola sospensione usando un dissociatore e tumore kit di dissociazione (umana) secondo le istruzioni del produttore. Filtrare la sospensione con un colino cella di 70 micron che è impostato su un tubo da 50 ml e lavare il filtro 2 volte con2 ml di RPMI 1640. </li><li> Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 10 ml di mezzi di cellule T (Tabella 1). </li><li> Preparare una soluzione sfumatura a due fasi come Ficoll (soluzione gradiente) in una provetta da 50 ml, con un gradino più basso di 10 ml di soluzione di pendenza 100% ed una fase di mezzo di 30 ml di soluzione di pendenza 75% diluito con fosfati di Dulbecco salina tamponata, senza calcio, senza magnesio (D-PBS (-)). </li><li> Strato di sospensione cellulare (dal punto 1.4) sulla soluzione gradiente (dal punto 1.5). Centrifugare a 400 xg a 20 ° C per 45 min. </li><li> Raccogliere il livello contenente le TIL arricchite all&#39;interfaccia tra la soluzione di pendenza 100% e la soluzione pendenza 75% in una provetta da 50 ml. Diluire il livello della soluzione con i TIL arricchiti aggiungendo 20-30 ml di D-PBS (-). </li><li> Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere la frazione TIL arricchita in 10 mldei mezzi di comunicazione delle cellule T. </li><li> Culture la frazione (dal punto 1.8) con 2 ml di mezzi di cellule T e 6.000 UI / ml ricombinante umana (rh) IL-2 in una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Modificare la metà della media su giorno 5 dopo la cultura iniziazione e ogni 2-3 giorni successivi. </li><li> Dividere le celle con un rapporto di 1: 2 senza tripsinizzazione dopo dolcemente sospensione, raddoppiando il numero di pozzetti quando raggiunge 80-90% di confluenza. Aggiungere un volume metà (1 ml) di supporto delle cellule T freschi e rhIL-2 a 6.000 UI / ml. </li></ol> 2. Preparazione di Mitomicina-C-trattati SNL Feeder zolla delle cellule <ol><li> Culture cellule feeder BN in 10 ml di SNL supporti cella alimentatore (Tabella 1) su una gelatina rivestita 10 centimetri piatto 0,1% fino al 80-90% di confluenza (3-4 x 10 6 cellule) viene raggiunto. </li><li> Aggiungere 310 ml di 0,4 mg / ml soluzione mitomicina C direttamente nel piatto di coltura cellulare alimentatore BN e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 ore e 15 min. Aspirare il supporto di unnd lavare le cellule due volte con 5 ml di D-PBS (-). </li><li> Aggiungere 0,5 ml di 0,25% tripsina / 1 mM EDTA e incubare a temperatura ambiente per 1 min per dissociare le cellule. Aggiungere 4,5 ml di mezzi di cellule di alimentazione SNL per neutralizzare e risospendere le cellule in una sospensione singola. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 min. Aspirare media e contare le cellule con un emocitometro dopo la ri-sospensione in 10 ml di SNL mezzi cellule alimentatore. </li><li> Piatto 1,5 x 10 6 cellule per pozzetto di cellule feeder SNL su un piatto 10 cm e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Utilizzare le cellule di alimentazione SNL entro 3 giorni. </li></ol> 3. Generazione di iPSCs Uso del virus di Sendai (SeV) Vector <ol><li> Raccogliere il TIL (dal punto 1.11) e attivare 5 x 10 5 cellule TIL con il mouse piastriforme vincolato CD3 anti-umano (1 ug / ml) e mouse solubile CD28 anti-umano (5 mg / ml), con rhIL-2 (6.000 UI / ml) in 2 ml di mezzi di cellule T in una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 per 5 giorni. </li><li> Raccogliere il TIL (dal punto 3.1) in un tubo da 15 ml con una pipetta e contare il numero di cellule con un emocitometro. </li><li> Riattivare 1 x 10 5 cellule TIL con il mouse piastra-bound CD3 anti-umano (1 ug / ml) e topo solubile anti-human CD28 (5 mg / ml), con rhIL-2 (60 UI / ml) in 500 microlitri di mezzi di riprogrammazione (Tabella 1) per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. Preparare 3 pozzi per l&#39;infezione SeV: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc (1 bene); infezione SeV (GFP: proteina fluorescente verde) (1 bene); e conta delle cellule (1 bene). </li><li> Dopo 24 ore (dal punto 3.3), contare il numero di cellule con un emocitometro e determinare il volume di ogni virus per diversi (3-20) molteplicità di infezione (MOI). Rimuovere una serie di tubi vettore virus Sendai dal -80 ° C di stoccaggio. Scongelare i vettori Sev rapidamente in un bagno d&#39;acqua (37 ° C) e disporli sul ghiaccio. Volume del virus (ml)= MOI (CIU / cella) x numero di cellule / titolo del virus (CIU / ml) × 10-3 (ml / ml) </li><li> Aggiungere i volumi calcolati di ciascuno dei quattro tubi vettore virus Sendai che portavano singolarmente Oct3 / 4, SOX2, Klf4, e c-MYC aggiungendo una miscela di vettori SEV al 10-20 MOI in media, compresa attivato TIL. </li><li> Per determinare l&#39;efficienza di trasduzione, aggiungere i volumi calcolati di SEV-GFP in un pozzo di TIL attivati. </li><li> Collocare la capsula (dal punto 3.5 e punto 3.6) in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. Dopo 24 ore, valutare l&#39;efficienza di infezione con TIL infettati con SEV-GFP in microscopia a fluorescenza. </li><li> Raccogliere le cellule (dal punto 3.5) in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di mezzi hESC con Primate ES cellulare medio e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml). </li><li> Trasferire la sospensione in un 10 centimetri piatto che CONTAins mitomicina-C-trattata cellule di alimentazione SNL in 10 ml di hESC supporti. Modificare i media hESC a giorni alterni fino a quando le colonie sono cresciuti. </li><li> Intorno al giorno 18 al 21, rimuovere le cellule di alimentazione SNL intorno alle colonie sotto un microscopio con una punta di 10-microlitri nel banco pulito. </li><li> Raschiare le colonie con una punta di 10-microlitri e trasferirli con una punta di 200 microlitri in 100 ml di iPSCs mezzi per pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti. Pipettare su e giù a 2-3 volte di rompere le colonie in piccoli grumi con una dimensione media di 50-100 micron. </li><li> Trasferire i piccoli ciuffi in 6 pozzetti piastre di coltura dei tessuti con cellule di alimentazione SNL mitomicina-C-trattati (dal passaggio 2) in 2 ml per pozzetto di iPSCs supporti con il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml). Cambiare i media iPSCs ogni giorno. </li><li> Trasferire le iPSCs a 6 pozzetti di coltura tissutale con cellule feeder BN mitomicina-C-trattati fresche con 1 mg / ml di collagenasi IV ogni 5-6 giorni. Preparare 2 pozzi per piatti di ogni clone per immunostaining. </li><li> Determinare la completa riprogrammazione di ogni clone dalla colorazione immunoistochimica di marcatori pluripotenza (SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, TRA-1-81, e Oct3 / 4) 1. NOTA: Per ulteriori valutazione del potenziale pluripotenza, confermano che le linee IPSC completamente riprogrammate possono differenziarsi in tre foglietti embrionali da una formazione del corpo embrioide e saggio di differenziazione o di un saggio di formazione teratoma 16. </li><li> Verificare che le linee IPSC completamente riprogrammati dimostrano un cariotipo normale analisi citogenetica. </li><li> Per la formazione teratoma, iniettare una indifferenziata TIL derivato COPSI (1 x 10 6) sospensione in 100 ml di DMEM contenente 10% FCS nel tessuto sottocutaneo di 6-8 settimane topi NOD / SCID vecchi femminili. sezioni teratoma macchia con ematossilina ed eosina. </li></ol> 4. immunofluorescenza colorazione di iPSCs per SSEA3, SSEA4, TRA1-60 e TRA1-81 <ol><li> Lavare iPSCs con 1 ml di PBS e fissare i iPSCs con 1 ml di 4% annuosoluzione raformaldehyde per 10 minuti. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e lavare le iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte. NOTA: Fare attenzione quando si utilizza paraformaldeide perché è tossico. </li><li> Pretrattare le iPSCs con tampone di bloccaggio (Tabella 1) per 30 minuti. Nel frattempo, diluire gli anticorpi primari (ratto anti-umano SSEA3, topo anti-umana SSEA4, topo anti-umano TRA1-60 e mouse TRA1-81 anti-umano) soluzione di capra siero 1:50 in 1,5% diluiti con PBS e TritonX -100 (volume totale: 1 ml). </li><li> Rimuovere il tampone di bloccaggio (Tabella 1). Aggiungere la soluzione diluita anticorpo primario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Nel frattempo, diluire l&#39;anticorpo secondario (IgG anti-topo e IgM o anti-topo IgM) 1:50 in 1,5% soluzione di capra siero. </li><li> Rimuovere la soluzione diluita anticorpo primario e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ciascuno per 5 min. Aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito e incubare per 45 min a temperatura ambiente in una stanza buia. </li&gt; <li> Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario diluito e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Osservare le iPSCs con microscopia a immunofluorescenza. </li></ol> 5. immunofluorescenza colorazione di iPSCs per Oct3 / 4 <ol><li> Lavare iPSCs con 1 ml di PBS e fissare i iPSCs con 1 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% per 10 min. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e lavare le iPSCs con PBS 3 volte. </li><li> Aggiungere tampone di permeabilizzazione (Tabella 1) ed incubare a temperatura ambiente per 10 min. Rimuovere il buffer di permeabilizzazione e aggiungere tampone di bloccaggio (Tabella 1). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 min. Nel frattempo, diluire l&#39;anticorpo primario (del mouse Oct3 / 4 anti-umano) 1:50 in tampone di bloccaggio. </li><li> Aggiungere la soluzione diluita anticorpo primario e incubare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Rimuovere la soluzione diluita anticorpo primario e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Nel frattempo, dilute l&#39;anticorpo secondario (capra anti-topo IgG / IgM) 1: 100 in tampone di bloccaggio. </li><li> Aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito ed incubare a temperatura ambiente in una stanza buia per 45 min. </li><li> Rimuovere la soluzione secondaria diluita e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Osservare le iPSCs al microscopio immunofluorescenza. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Qui, abbiamo dimostrato un protocollo per la riprogrammazione TIL melanoma a iPSCs da trasduzione SEV-mediata dei quattro fattori di trascrizione Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questo approccio, utilizzando un sistema SeV per riprogrammare cellule T, offre il vantaggio di un metodo non integrare 7. Uno studio precedente ha mostrato che un sistema riprogrammazione SeV era altamente efficiente e affidabile per riprogrammare fibroblasti non solo, ma anche le cellule T del sangue peri...

La tecnologia di riprogrammazione cellulare che permette la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mediante la sovraespressione di un insieme definito di fattori di trascrizione promette grandi sviluppi nel campo delle terapie a base di cellule 1,2. Queste iPSCs presentano caratteristiche trascrizionali ed epigenetici e hanno la capacità di auto-rinnovamento e pluripotenza, analogamente alle cellule staminali embrionali (ESC) 3-5. Notevoli progressi realizzati nella tecnologia di riprogrammazione negli ultimi dieci anni ci ha permesso di generare iPSCs umani anche da cellule terminalmente differenziate, come le cellule T 6-8. IPSCs derivati dalle cellule T (TiPSCs) mantengono la stessa configurazione riarrangiato di recettore delle cellule T (TCR) geni catena come le celle originali T, che permette la rigenerazione delle cellule T antigene-specifiche da TiPSCs 9-11. Quasi l&#39;80% dei linfociti melanoma infiltranti (TIL) ottenuto da tumore di un paziente specificamente riconoscere tumore-antigeni associati aND mantenere la citotossicità contro le cellule tumorali originali 12. In particolare, l&#39;espressione della morte cellulare programmata proteina-1 (PD-1) sul TIL è stato trovato per identificare il repertorio tumore-reattiva autologo, compresi mutato specifico neoantigene CD8 + linfociti 13. Trasferimento adottivo di ex-vivo TIL autologhe espanse in combinazione con regimi lymphodepleting di preparazione e somministrazione sistemica di Interleuchina-2 (IL-2) può causare sostanziale regressione del melanoma metastatico in sottogruppi di pazienti 14. Nonostante gli incoraggianti risultati in modelli preclinici e nei pazienti, scarsa sopravvivenza delle cellule T infuse e l&#39;esistenza di percorsi immunosoppressivi sembrano compromettere il pieno potenziale della terapia con cellule T adottiva. Protocolli clinici attuali richiedono ampie ex vivo manipolazione di cellule T autologhe per ottenere grandi numeri. Il risultato è la generazione di cellule terminalmente differenziate T che hanno scarsa sopravvivenza, ridotto Prolla capacità iferative, e alti livelli di PD-1 15. Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superato utilizzando iPSCs che possono fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l&#39;immunoterapia. Abbiamo recentemente riportato la riprogrammazione del melanoma TIL esprimere alti livelli di PD-1 dal virus di Sendai (SeV) trasduzione mediata dei quattro fattori di trascrizione, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc 16. Mentre vettori retrovirali richiedono l&#39;integrazione in cromosomi di accoglienza per esprimere geni riprogrammazione, vettori Sev sono non-integrazione e sono poi eliminati dal citoplasma. La riprogrammazione efficienza è molto più alto con un sistema SeV rispetto lentivirus o retrovirus vettori 6-8. Inoltre, SeV possono specificatamente riprogrammare le cellule T nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), mentre alcuni cloni IPSC generati da lentivirus o vettori retrovirali possono essere da lignaggi nonlymphoid 6-8. Qui, abbiamo dettagliole procedure implementate per l&#39;isolamento e l&#39;attivazione di melanoma umano TIL e per la generazione di iPSCs TIL derivati ​​utilizzando un sistema di riprogrammazione SeV.

<table><tbody><tr><td>gentle MACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tumor Dissociation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>human AB serum</td><td>Life technologies</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Cumberland Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (6-well)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (24-well)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus vector</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL feeder cells</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>mitomycin C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>soluble in water (0.5 mg/ml)</td></tr><tr><td>gelatin</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of induced pluripotent stem cells from human melanoma tumor-infiltrating lymphocytes

Trasferimento adottivo di ex vivo ampliato linfociti tumore-infiltranti autologhe (TIL) possono mediare le risposte durature e completi in sottogruppi significativi di pazienti con melanoma metastatico. I principali ostacoli di questo approccio sono la ridotta vitalità delle cellule T trasferiti, causate da accorciamento dei telomeri, e il numero limitato di TIL ottenuti da pazienti. Le cellule T Meno dissociati con telomeri lunghi sarebbe un sottoinsieme di cellule T ideale per la terapia delle cellule T adottiva, tuttavia, generando un gran numero di queste cellule T meno dissociati è problematico. Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superata dalle cellule utilizzando indotte pluripotenti staminali (iPSCs) che l&#39;auto-rinnovarsi, mantenere i telomeri pluripotenza, si sono allungati, e di fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l&#39;immunoterapia. Qui, vi presentiamo un protocollo per generare iPSCs utilizzando vettori di virus Sendai per la trasduzione di fattori di riprogrammazione in TIL. Questo protocollo generas completamente riprogrammati, cloni libero da vettori. Questi iPSCs TIL-derivati ​​potrebbero essere in grado di generare cellule T-paziente e tumore-specifici meno dissociati per la terapia delle cellule T adottiva.

La Figura 1 mostra la descrizione della procedura che coinvolge l&#39;espansione iniziale del melanoma TIL con rhIL-2, che è seguita da attivazione con anti-CD3 / CD28 e trasferimento genico Oct3 / 4, Klf4, SOX2, e c-MYC per TIL per la generazione di iPSCs. Di solito, TIL sulla cultura con rhIL-2 cominciano a formarsi le sfere 21-28 giorni dopo l&#39;inizio della cultura. A questo punto, TIL sono pronti per essere attivato con anti-CD3 / CD28. La figura 2A</stro...

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Views.  University of Michigan. The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Video: Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Ricerca sul cancro

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Immunologia e infezioni

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Medicina

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, there is no effective long-term treatment for vitiligo. Therefore, it is imperative to develop a convenient and effective treatment for vitiligo. Regenerative medicine technology for direct reprogramming of skin cells into melanocytes seems to be a promising novel treatment of vitiligo. This involves the direct reprogramming of the patient's skin cells into functional melanocytes to help ameliorate the loss of melanocytes in patients with vitiligo. However, this method needs to be first tested on mice. Although direct reprogramming is widely used, there is no clear protocol for direct reprogramming into melanocytes. Moreover, the number of available transcription factors is overwhelming. 
Here, a concentrated lentivirus packaging system protocol is presented to produce transcription factors selected for reprogramming skin cells to melanocytes, including Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9, and Snai2. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were infected with the concentrated lentivirus for all these transcription factors for the direct reprogramming of the MEFs into induced melanocytes (iMels) in vitro. Furthermore, these transcription factors were screened, and the system was optimized for direct reprogramming to melanocytes. The expression of the characteristic markers of melanin in iMels at the gene or protein level was significantly increased. These results suggest that direct reprogramming of fibroblasts to melanocytes could be a successful new therapeutic strategy for vitiligo and confirm the mechanism of melanocyte development, which will provide the basis for further direct reprogramming of fibroblasts into melanocytes in vivo.

Here, we describe an optimized direct reprogramming system for melanocytes and a high-efficiency, concentrated virus packaging system that ensures smooth direct reprogramming.

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti di topo in melanociti

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Organoidi di melanoma derivati da pazienti: una frontiera nell'immunoterapia del cancro

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While traditional two- and three-dimensional models can offer insights into cancer development and progression, these lack crucial aspects that hinder a faithful mimic of native tumors. An alternative model that has gained a lot of attention is the patient-derived organoid. The development of these organoids recapitulates the complex intercellular communication, tumor microenvironment, and histoarchitecture of tumors. This paper describes the protocol for establishing melanoma patient-derived organoid (MPDO) models. To validate these models, we assessed the immune cell composition, including the expression levels of T-cell activation markers, to confirm the cellular heterogeneity of the organoids. Additionally, to describe the potential utility of MPDOs in cellular therapies, we evaluated the cytotoxic capabilities of treating the organoids with &#947;&#948; T-cells. In conclusion, the MPDO models offer promising avenues for understanding tumor complexity, validating therapeutic strategies, and potentially advancing personalized treatment.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ricreare la complessità del melanoma con organoidi derivati da pazienti per la valutazione dell'immunoterapia

Here, we present a protocol to generate melanoma patient-derived organoids by culturing disassociated cell suspensions from fresh melanoma tissues. These organoids faithfully recapitulate patient-specific tumors in vitro, offering an innovative approach to exploring tumor immunosuppressive mechanisms, drug screening, drug resistance mechanisms, and cancer surveillance approaches.

Svelare le opportunità terapeutiche con i modelli di organoidi derivati dai pazienti con melanoma

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il tumore

Riepilogo

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Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

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Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti di topo in melanociti

Svelare le opportunità terapeutiche con i modelli di organoidi derivati dai pazienti con melanoma

Svelare le opportunità terapeutiche con i modelli di organoidi derivati dai pazienti con melanoma

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Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

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Svelare le opportunità terapeutiche con i modelli di organoidi derivati dai pazienti con melanoma

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