3D胸腺器官培養によるiPSC由来の胸腺移民の生成は、腫瘍抗原特異的ナイーブ様T細胞の均質集団を再生する初のインビボ法である。主な利点は、iTEがより生理学的に関連しており、この方法は、より強力であり、その後、他のインビボ差動法は、常に特定のT細胞を生成する。iTEは、増殖、再改変、および生体内の腫瘍抑制の能力を含む、ナイーブT細胞様機能的表現型を有するCD8α-β抗属特異的T細胞の均質な動揺である。

手順を実証することは、私の研究室のポストドクターラフィクルイスラムになります。OP9培地で37°Cで培養OP9/DLL1細胞を開始する。細胞が80〜95%の合流度に達したら、1つのXマグネシウム、カルシウム、フェノールレッドフリーPBSで1回洗浄します。

ポイントゼロ5パーセントトリプシンの4ミリリットルを追加し、5分間摂氏37度でインキュベートします。その後、4ミリリットルのOP9培地とピペットを加えて、細胞層の関連付けを解除し、単一の細胞懸濁液を作ります。100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形の管に細胞懸濁液を移す。

300Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。吸引し、OP9培地の12ミリリットルで細胞を再懸濁します。次に、OP9/DLL1細胞懸濁液の2ミリリットルを新しい10センチメートルの細胞培養ペトリ皿にプレートします。

OP9メディアを8ミリリットル追加します。この節を2~3日ごとに繰り返します。ゼロ日にトリプシン法により誘導多能性幹細胞を単一細胞懸濁液として収穫する。

細胞と遠心分離機を摂氏4度で300Gで5分間回収します。上清を吸引し、OP9培地10ミリリットルあたり100,000細胞の密度でIPCを再中断する。その後、コンフルエントOP9 / DLL1 10センチメートル皿に100,000個の細胞をプレートします。

5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベーションを続ける。3日目に古いメディアを吸引し、新鮮なOP9メディアの10ミリリットルに置き換えます。6日目には、10ミリリットルのPBSで各10センチメートルコンフルエントOP9皿を洗います。

各皿にポイントゼロ5パーセントトリプシンの3ミリリットルを追加します。室温で3~5分インキュベートします。OP9培地を4ミリリットル加え、穏やかにピペットを使って細胞を採取します。

100マイクロメートルの細胞ストレーナーと遠心分離機を通して300G、摂氏4度で5分間細胞を通過させます。その後、上清を捨てます。分化培地の10ミリリットルで細胞を再中断します。

新しい10センチメートルOP9 / DLL1コンフルエント皿に細胞懸濁液をプレートします。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベーションを続ける。9日目に、古いメディアを吸引し、新鮮な分化メディアの10ミリリットルに置き換えます。

37°Cと5%のCO2で細胞をインキュベートし続けます。iPSCコロニーで心筋細胞が観察される11日目には、ピペットを使用して非接着細胞を機械的に切断する。100マイクロメートルの細胞ストレーナーと遠心分離機を300Gで、摂氏4度で5分間濾過します。

この後、上清を吸引し、分化培地の24ミリリットルで細胞を再懸濁する。iPSCをコンフルエントOP9 /DLL1 6ウェルプレートにプレートします。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。

15日目に、非接着細胞をすべて採取し、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを介してそれらをフィルタリングします。300Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。前述のように、非接着細胞を3~4日ごとに受け継ぎ続ける。

DGWO治療の7日目に、4つの新しい10センチメートルの皿を取り出します。完全なメディアの20ミリリットルで各料理を埋めます。胸腺ローブを含むニトロセルロース膜のすべてを10センチメートル皿に移します。

鉗子を使用して、個々のローブを膜から取り外し、媒体に沈めることを可能にする。常温で1時間、ローブをインキュベートします。その後、完全なメディアで新しい10センチメートルの皿に胸腺ローブを転送します。

室温で1時間インキュベートする。この移管を繰り返し、さらに2回インキュベーションを行います。鉗子を使用して、胸腺ローブを皿に固定し、もう一方の手を使って中央に100〜200マイクロメートルの深部切開を行い、ローブの直径の半分を伸ばし、T細胞前駆物質をローブに移動させる。

完全な分化培地で満たされた新しい10センチメートルの皿に胸腺ローブを移します。下層と上のレベルのグリッドを持つ3D培養プレートを使用する場合は、両方のグリッドに滅菌PPSを充填して、吊り下げ滴の蒸発と乾燥を防ぎます。次に、1つのDGWO処理された胸腺葉を含む完全な培地の30マイクロリットルを3D培養プレートの各ウェルに移す。

OP9/DLL1 の共培養から非接着 T リネージ セルを収集します。そして、培地20マイクロリットル当たり2,000〜5,000T細胞系統細胞の密度で細胞を再懸濁する。T系統細胞懸濁液の20マイクロリットルを3D培養プレートの各胸腺葉に加えます。

5分の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、P200ピペットを30マイクロリットルに設定します。胸腺葉を取り巻くすべての細胞を取り除くために、各井戸にメディアを数回上下にピレットします。

その後、各ウェルからメディアを吸引し、完全な媒体の30マイクロリットルを交換します。このプロセスを繰り返し、メディアを5~7回パイプ、除去、交換して、ローブに移行しない余分な未熟なT細胞を除去します。毎日25~30マイクロリットルのメディアを交換するように、ローブのインキュベートを続けます。

4日目または5日目には、軽い顕微鏡を使用して、ローブの周りにiPSC由来の胸腺移民のハローの形成を確認します。ローブの中断なしにメディアをパイプすることで、iTEの毎日を収集します。メディアを毎日変更し、収集を約 12 日間継続します。

収穫されたiTEは分子分析または生体内移植の実験に使用する準備ができている。本研究では、共培養された胎児の胸腺を切除し、iPSC由来のT細胞系系細胞が胸腺葉に移行できるかどうかを分析した。非播種対照葉は、内因性CD3陽性細胞に展開されたアストロサイト様胸腺上皮ウェブを特徴とする組織アーキテクチャを有する。

しかし、iPSC由来未熟T細胞を播種した胸腺葉は、iPSC由来の未熟T細胞の葉への移行を示すCD3陽性単核細胞で再移植される。胸腺微小環境内に移行し、成熟するT細胞は、その後iTEとして出る。フローサイトメトリック解析は、様々な細胞の表型特性を検定するために使用されます。

余分胸腺T細胞は、CD4、CD8ダブル陽性T細胞およびCD8アルファ単一陽性T細胞を陽性選択マーカーの発現なしに示し、一方、iTEはCD8α単一陽性MHCクラス1陽性T細胞表現型の均質集団であり、胸腺葉から出る前に陽性選択を経て正常な通過を示す。iTEは、同結合ペプチドに対して抗原特異性を有する。iTEは、核タンパク質として無関係なペプチドをプリロードした抗原提示細胞と共培養しても、サイトカインの細胞産生には見えない。

しかしiTE共培養抗原提示細胞は、同結合ペプチドGP100でプリパルスし、TNFαインターロイキンiiとインターフェロンガンマを細胞内に産生する。開放型細胞培養はABSスロットに強く依存していることを覚えておいてください。生成されたiTEは、従来のT細胞で働く他のアッセイに使用することができる。

例えば、T細胞清算アッセイ、サイトカイン産生アッセイ、生体内腫瘍退縮試験、T細胞分化試験、エトセトラ。この技術は、多くの免疫学的またはそのようなプロジェクトに適用することができます。T細胞分化、パルスタイミングT細胞成熟、ヘマトクリット前駆体または幹細胞からの抗原特異的T細胞の生成を含む。

このビデオを見た後、視聴者は、3D胸腺臓器培養システムを使用して、誘発多能性、幹細胞由来、腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する方法を理解する必要があります。