We would like to acknowledge Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) for providing us with the F9 RARE-LacZ cells and technical support. This study is funded by the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (Grantnumber:10-3092-SCR-E-0) and the New Jersey Commission on Brain Injury Research (NJCBIR) (Grant number: CBIR13FEL006).

全ての動物作業は承認ラトガース-RWJMS IACUCの方法に従って行いました。 1.ソリューションとメディアの準備<ol><li> 。 表1のとおり株式及び緩衝液を調製表2の通り作業ソリューションを準備します。 </li></ol> 2.文化とF9 RARE-LacZ細胞のメンテナンス<ol><li> 凍結細胞を解凍 <ol><li> 表2に詳述されるようにF9 RARE-LacZの細胞培養培地を準備します。 </li><li>室温で30分間0.2％ゼラチン10mLでコート10cmの培養皿（細胞培養処理された）（ 表2参照）。 10ミリリットルの蒸留水の2回のすすぎで過剰ゼラチンを洗い流します。すぐに乾燥からゼラチンを防止するために、フラスコにF9 RARE-LacZの細胞培養培地の9ミリリットルを追加します。 </li><li> 3分- 2 37℃の水浴中でF9 RARE-LacZ細胞14のバイアルを解凍します。 （1×10 6細胞/ ml程度）プレートセルコートディッシュCに培地の9ミリリットルをontaining。 37℃、5％CO 2で培養。翌日、培地を変更します。 </li></ol></li><li> F9 RARE-LacZ細胞のメンテナンス <ol><li> 1：10の割合で3日間 - すべての2定期的な経過を維持します。 注：これは、それらの分化になりますように、細胞がコンフルエントに成長させてはいけません。 </li><li> 80から90パーセントの密集度で培養物を分割します。メディアを取り出して、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の10mlで細胞を洗浄。 PBSを削除し、トリプシンの1ミリリットルを追加し、5分間インキュベートします。培地、上下にピペットおよび分割細胞通過のための午前1時10分の9ミリリットルを追加します。 </li></ol></li><li> F9 RARE-LacZ細胞を凍結 <ol><li>ステップ2.2.2で詳述するように、90％コンフルエンス - 80でF9 RARE-LacZ細胞を含む10cmの皿をトリプシン処理。 5分間、200×gで15ミリリットルの遠心分離管とスピンに解離細胞を転送します。 </li><li> F9 RARE-LacZのFの10ミリリットルで上清と再懸濁細胞ペレットを削除します培地をreezing（ 表2参照）。小分けし、冷凍容器にラベルされたクライオバイアルおよび転送バイアルに1ミリリットル。翌日、液体窒素タンクに-80℃の冷凍庫O / Nと転送バイアルで容器を凍結置きます。 </li></ol></li></ol> E8.5胚の3解剖<ol><li> 交尾ケージセットアップおよびプラグチェック <ol><li>セットアップ1交配対を含む交尾ケージを。次の日の朝は、膣のプラグインが存在するかを確認し、プラグが1日0.5 23として発見された日を指定します。日E8.5、収穫の胚で。 </li></ol></li><li> 胚の解剖 <ol><li> （ 表 2を参照）頚椎脱臼を通してダムを生け贄に捧げる、70％エタノールで腹部をスプレー。手術用はさみを使用して腹部の上に皮膚の上にカット横断を作成し、腹部を露出するように離れて2つのフラップ（前方および後方）を引き出します。同じようなカットを作ります腹膜上腹部を露出させます。 </li><li>子宮を見つけ、はさみ23のペアを使用して卵管と子宮間膜から子宮をリリース。余分な脂肪と血を洗い流し、PBS 1×10ミリリットルとを6cmディッシュ（非細胞培養処理）で子宮を置きます。新鮮な10ミリリットル1×PBSを含む別に6cm皿に移します。 </li><li>手術用はさみを使用してそれを切断して1胚を含む1子宮セパレート。子宮と脱落膜を取り外し、無の2ペアを使用して胚を含む卵黄嚢をリリース。 5鉗子23。 </li><li>胚から卵黄嚢を分離し、遺伝子型決定のために使用されるゲノムDNA抽出のために1.5ミリリットルのマイクロチューブに卵黄嚢を転送します。トリプシンの10μLを含む1.5 mlのマイクロチューブに全胚を転送し、広口径の先端でP20ピペットを使用してください。チューブを氷上に置きます。 </li><li>すべての胚が解剖されるまで3.2.4 - を繰り返して3.2.3を繰り返します。 </li></ol></li><li> 胚解離<ol><li>酵素的解離を促進するために、37℃で5分間トリプシンで胚を含む1.5 mlチューブをインキュベートします。 <ol><li>粉薬が優しく胚の機械的解離のためのP20ピペッターを使用して、96ウェルプレート中にF9 RARE-LacZ細胞の1つのウェルの上に1解離した胚を含む全10μlの容量をめっき（F9 RARE-LacZ細胞をプレーティングするためのステップ5.1を参照してください。 96ウェルプレート中）。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4.椎弓切除、大人腰椎脊髄の解剖と神経球文化<ol><li> 椎弓切除術 <ol><li>頸椎脱臼を通して大人（P60）マウスを生け贄に捧げます。 </li><li> 70％エタノールで背側をスプレーし、手術用はさみを使用して、横方向のカットを行います。背中や脊柱を露出するために離れて、両方のフラップ（前方および後方）を引き出します。 </li><li>手術用はさみを使用して、背骨を覆う筋肉を切り落とします。肋骨の下、脊髄の腰部の位置を確認します。はさみを使用して、脊髄を露出させるために、この時点で背骨を切断するために、深いカットをします。 </li><li>なしで脊椎の腰部を引き上げます。 5鉗子は、脊髄の露出横断面は、実験者に向くように。細かいハサミの先端を使用して、露出端の3時と9時の位置で脊椎や筋肉を切り取ります。鉗子で切断された椎骨の背側フラップをつかみます。腰部脊髄の長さが露出するまで尾側にこれらのカットを続けます。 </li><li>無使用して椎骨から脊髄をリリース。 5と同様に、平滑末端鉗子。 DMEM / F12培地3 mlを含む15mlチューブに脊髄を転送します。すべての腰椎脊髄が単離されているまで氷上で保管してください。 </li></ol></li><li> 脊髄の解剖 <ol><li> 6cmディッシュに脊髄と培地を注ぎ（非細胞培養処理します）。 </li><li>実体顕微鏡下では、無の2対を用いて神経節や血管を把持することにより、脊髄セグメントの周りに後根神経節と血管を削除します。 5鉗子、ゆっくりと脊髄からそれらを引き離します。無媒体とを6cmディッシュに脊髄セグメントを移し、細かく手術用メスの刃を用いて組織をミンチ。 </li><li>ニューロスフェアの解離培地1mlを含有する15mlチューブに移し刻んだ組織（ 表2参照）。氷の上にチューブを入れて、手順4.2.1繰り返す - すべての脊髄が処理されるまで4.2.2を。 </li><li> 10分間37℃で解離培地中で細分化した組織を含むチューブをインキュベートし、混合した後、さらに10分間37℃でインキュベートする側のチューブをフリック。酵素消化した後、機械的解離のための直径を減少させるファイアーポリッシュピペットで粉砕します。 注意：実験を実行する前に直径を減少させるファイアーポリッシュピペットを準備します。ガラスパスツールを取りますピペットとは、きれいな綿との広い方の端を差し込みます。 、「レギュラー」「ファイン」、および「極細」：異なる直径を作成するために、アルコールランプ、火ポリッシュ炎でピペットの先端を使用。 &quot;通常の&quot;洗練されたピペットは、直径（〜1ミリメートル）を低下させることなく、エッジのラウンドに難ピペットの終わりを振り回します。 「細かい」（〜&gt; 1ミリメートルと&gt;直径5mm）と「極細」（〜0.5ミリメートル）洗練されたピペットを作成するために、わずかに長い期間のための火炎中でピペットの端を回転させます。 0.5ミリメートル未満の直径を持つピペットを使用しないでください。 </li></ol></li><li> ニューロスフェアの文化 <ol><li> 10分間、200×gで解離脊髄組織を含むチューブをスピンダウン。ニューロスフェア培養培地の1ミリリットルで上清と再懸細胞ペレットを取り外します（ 表2参照）。解離を促進するために、P200ピペット続いP1,000ピペットで粉砕します。 注：気泡を導入しないでください、これは、細胞生存率を減少させます。 </li><li>血球計数器に移す解離した細胞を10μlおよび細胞数を得ます。神経球培養培地10mlでT25フラスコ中の1×10 5 / 10mlを密度でプレート細胞。ニューロスフェアは、24を表示されるまで7日間、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li></ol></li><li> ニューロスフェア解離 <ol><li>ニューロスフェアの文化を収集し、15 mLのチューブに移します。 10分間、200×gでスピン。背後に1ミリリットルを残して上清の大部分を削除します。細胞ペレットを再懸濁し、単一細胞に、神経球を解離するP1,000ピペットで粉砕します。血球計数器に移す解離した細胞を10μlおよび細胞数を取得します。 </li><li>プレート1×10 5、96ウェルプレート（96ウェルプレートにF9 RARE-LacZのメッキについては、セクション5.1を参照）にF9 RARE-LacZのの1つのウェルにわたって神経球細胞を解離しました。プレートの複製として3ウェル。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。</li></ol></li></ol> E8.5胚および脊髄神経球の5 RAアッセイ<ol><li> 96ウェルプレート中にF9 RARE-LacZのめっき <ol><li>収穫E8.5胚またはニューロスフェアの解離の前にある日、RTで30分間、ウェルあたり0.2％ゼラチン100μlでコート96ウェルプレート。ゼラチン出て吸引し、蒸留水200μlで二回すすいでください。 </li><li>ステップ2.2.2で詳述するようにトリプシン処理F9 RARE-LacZ細胞を10cm皿に維持しました。プレート1×10 5細胞/ウェルのF9-RARE LacZ細胞が、この時、G418を含まない培地を使用して。 </li><li> （ - ごみの大きさに応じて、20 12〜）、ニューロスフェア（3ウェル/遺伝子型）と同様に三連での標準曲線（27ウエル）のための胚の共培養のための十分な井戸を準備します。 </li></ol></li><li> F9 RARE-LacZおよびE8.5胚または脊髄神経球の共培養 <ol><li> F9の上のセクション3.2およびプレートに詳述するように収穫の胚セクション5.1から96ウェルプレート中のRARE-LacZを。同様に、ステップ4.4で詳述したように96ウェルプレート中のF9 RARE-LacZの上部にニューロスフェア、プレートを解離します。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。 </li></ol></li><li> 標準曲線を作成します <ol><li>アットの連続希釈によって、100 nMで、10 nMの、1 nMで、100ピコモル、10ピコモル、1ピコモル、100マッサ：、標準曲線を生成するには、次の濃度のオールトランスRA（AT-RA）溶液を調製するために、 F9 RARE-LacZの培地でRA株（ 表1参照）。 </li><li>セクション5.1からF9 RARE-LacZの細胞にこれらの異なるで-RA濃度の100μLを加えます。未処理のF9 RARE-LacZの細胞のような負の対照を含むウェルを割り当てます。各RA濃度及び陰性対照ウェルの三連を準備します。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。 注：F9 RARE-LacZ細胞は、オールトランスRAの様々な濃度に用量依存的な直線的に応答します。 </li></ol></li><li> RAアッセイ <ol><li>標準曲線との共培養を含む96ウェルプレートのO / N培養後、培地を除去し、15分間2.5％グルタルアルデヒド（ 表2を参照されたい）、RT100μlを加えることによって、培養物を固定します。固定液を削除し、200μlの1×PBS、1回の洗浄あたり10分で二回洗浄します。 </li><li> PBSを取り外しおよびLacZ洗浄液200μlで3回洗浄し、洗浄あたり10分（ 表2参照）。 3回目の洗浄の際に、ホイルに包まれた15mlチューブ中のX-gal染色溶液を調製する（ 表2参照）。必要とされているどのくらいの染色液を計算し、適切な量（200μL/ウェル）を準備します。 注：X-gal染色溶液は感光性です。調製後15分以内に染色液を使用します。 </li><li> 96ウェルプレートを保持するのに十分な大きさのプラスチック容器に蒸留水で湿らせたペーパータオルを置くことによって加湿チャンバーを準備します。 Xの200μLを加えます96ウェルプレートのウェルあたり-Gal染色液と加湿チャンバー内でプレートを配置します。 </li><li>青色の沈殿物の開発を可能にするために、37℃で96ウェルプレートを含む加湿チャンバーをインキュベートします。 （ - 16〜12時間）E8.5胚のために、プレートO / Nインキュベートします。 8時間 - ニューロスフェア培養のために、4静置します。 </li></ol></li><li> OD 610とイメージングでの吸光度を読みます <ol><li>発色反応後、LacZ染色溶液を除去し、200μlの1×PBSと交換してください。 RAに対するレポーター応答を定量するために、標準的なELISAプレートリーダーを用いて610 nmの吸光度を測定します。カメラを搭載した標準的な実体顕微鏡を用いた画像個々のウェル。 </li></ol></li></ol> F9 RARE-LacZ細胞の6サブクローニング<ol><li> RAにF9 RARE-LacZのrResponseをチェック <ol><li>いずれの実験を開始する前に、RAに​​F9 RARE-LacZ細胞の応答をテストします。プレートF9 RARE-LacZのC96ウェルプレート中のellsは（セクション5.1を参照）、および1 nMの全トランスレチノイン酸（ステップ5.3を参照）を追加します。 37°CO / Nの加湿チャンバー内でインキュベートします。 </li><li>顕微鏡を使用して青色の沈殿物の開発を可視化します。発色がウェルの細胞全体が均一でない場合（左図1Bを参照）、以下に詳述サブクローニングを行います。 </li></ol></li><li> F9 RARE-LacZ細胞のサブクローニング <ol><li>ステップ2.2.2で詳述するように10cmの皿で培養F9 RARE-LacZ細胞を分割します。代わりに、1：10の比率で、各コロニーは単一F9 RARE-LacZの細胞から生じるように分離されたコロニーの増殖を可能にするために、10cmの皿に1×10 5細胞/ 10ミリリットルの低播種密度をめっき。 </li><li> 2日後、30分間ウェル当たり0.2％ゼラチン500μlのとコート24ウェルプレートを。ゼラチン溶液を除去し、蒸留水500μlのウェルを2回すすぎます。 F9 RARE-LacZの細胞培養培地500μlに水を交換してください。 </li><li> 1つのウェルに滅菌P10ピペットチップおよび転送を使用してコロニーを選択してください。 24個々のコロニーを得るために、この24回を行います。 4日- 3、37℃、5％CO 2で培養。 </li><li> 2つの24ウェルプレートに個々のコロニーを分割します。文化の中で2日後、1 24ウェルプレートや文化O / Nの各ウェルにRAの1nMのを追加します。高い反応性をテストするためにセクション5.4で説明するようにLacZ染色を実行します。強力かつ均一な反応者を決定することは、十分に顕微鏡下で各色反応を可視化します。 </li><li>強力なサブクローンの応答が決定されると、他の24ウェルプレートから対応する文化を展開します。また、10cmの皿にその植民地を拡大2.3節で詳述されるように、いくつかのバイアルを下に凍結し、他のすべてのコロニーを捨てます。 注：のみ元のコロニーの約4分の1は、高い反応性をもたらします。一般的に、サブクローニングの最初のラウンドは、均一なLacZ染色およびサブクローニングのその後のラウンドにはなりませんに行われる必要があります均一な強いレスポンダを達成。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

F9 RARE-LacZの細胞ライン14は、組織外植片12,14,17,18によって生成されるRAの検出のために使用することができる強力なシステムです。これは、RA 12,14,18と、未処理の細胞で検出された非特異的な応答なしで、100 fMのような低いRAの濃度に敏感です。さらに、レポーター細胞は、このようにLacZ反応が定量化RAレベル12,14,18の大きさを決定するために使用することができるように、濃度の特定の範囲内に直線的にオールトランスRAに応答します。ここに提示され、迅速かつ簡単にRAのレポーターアッセイは、胚培養成体神経幹細胞の可視化（ 図 2）との相対的な定量測定（ 図3）のためのF9 RARE-LacZのレポーター細胞株を利用します。 図2に示すように、このレポーターシステムは、個々のサンプル間の内因性RAレベルの比較を可能にする。RAを検出することができるように十分に敏感です培養したニューロスフェア（ 図2B）によって生成され、個々のE8.5胚（ 図2A）と同様にRAによって生成されます。 RAの濃度を変化させることに、この細胞株の用量依存的応答は、サンプル（ 図3B）との間の相対的なRAレベルのサンプル中のRAレベル（ 図3A）の定量、ならびに比較を可能にします。また、F9 RAREレポーター細胞株は、インキュベーションの時間をかけて組織サンプルにより生成されるRAの全体的な量を測定することに留意することが重要です。これは、RA合成と異化の正味残高に相当します。 F9 RARE-LacZの細胞レポーターシステムは、高感度かつ汎用性であるが、我々は、このシステムの信頼性を確保するために組み込まれているいくつかの重要なトラブルシューティングの手順があります。 図1に示すように、まず、彼らにGをさせることなく、定期的な継代によって、これらの細胞の健康を維持することが重要ですコンフルエントに行。第二に、我々が観察した後に継代培養物は常にG418での選択下で維持されている場合でも、一貫性のないRAレスポンスをもたらす傾向があります。これを解決するには、20継代後の培養物を破棄して新しいバイアルを解凍することをお勧めします。また、定期的なチェックは、レポーター細胞がまだメディアでのRAの存在に強い応答者であることを保証するために実行する必要があります。第三に、初期の通路が強いレスポンダが（ 図1B、RIGHトン）が得られるまで、必要があるかもしれRA（ 左図1B）、1またはサブクローニングのいくつかのラウンドに乏しいまたは不均一な応答が表示されます。共培養の前に最後には、そのような胚およびニューロスフェアのような組織試料は、単一の細胞に解離することをお勧めします。私たちは、より一貫性の比色測定中の試料の結果の解離を観察しています。解離した細胞はユニであるように、これは、培養ウェルにおけるRAのより均一な分布に起因する可能性がありますレポーター細胞を使用してフォームの連絡先。 いくつかの変更は、元のプロトコル14に行われました。まず、F9 RARE-LacZ細胞のRA応答は、直接細胞を固定し、610 nmでの吸光度を測定する代わりに、細胞を収集し、β-ガラクトシダーゼ活性の14のための溶解物を分析することによって定量しました。別の修飾は、RA応答の定量化の前にF9 RARE-LacZの解離したサンプルの直接の共培養です。以前の方法は、個別のサンプルを培養し、これらの培養物からF9 RARE-LacZを16,18にのみメディアを追加することを報告しました。 それは、強力なシステムであるにもかかわらず、F9 RARE-LacZレポーターアッセイは、いくつかの制限があります。このレポーター細胞株の1つの制限は、それは、オールトランスRAの存在に強く応答するが、それはまた、9-シス-RA及び13-シスRAを含む他のレチノイン酸異性体に応答することです。しかしながら、それらは、オールトランスRAのコンパに敏感100倍です他の異性体18に赤。このシステムの別の制限は、線形用量依存性応答はわずか10 -7に10 -13 Mの間に入ることであるMで-RA 14,18;したがって、これらの範囲外RAレベルを比較する場合、測定値が直線範囲内に入るまで、サンプルの連続希釈を行う必要があるかもしれません。これは主に比色アッセイであるので、最後に、発色のエンドポイントは、サンプルと実験の間で変化します。これにより、標準曲線が常にレポーター細胞応答の定量化のためにそれを使用するためにすべての単一の実験のために並列に播種することが重要です。 結論として、我々はニューロスフェアで、以前に報告されていない、E8.5胚において定量的にRAのレベルを測定し、F9キーRARE-LacZのRAレポーター細胞株の使用を報告しています。このレポーターシステムの汎用性は、実質的に任意の細胞または組織型、およびmにおけるRAレベルの定量化を可能にすることができますAY将来的に多様なアプリケーションの開発につながります。

レチノイン酸（RA）は、レチノールまたはビタミンAの代謝産物の誘導体であり、いくつかの細胞デヒドロゲナーゼ1の順次活性により製造されます。理由は、その両親媒性の化学的性質のため、それは容易に脂質膜を横断し、可溶性形態形成因子1として作用することができます。それは、核レチノイド受容体に対するリガンドとして作用し、遺伝子発現2-10を活性化することにより、多数の発達及び成体の細胞プロセスを調節する必須の分子です。 RAがなければ、これらのRA受容体（RAR類）プレッサーとしてのDNAと行動で結合するレアアイテム。 RAは、これらの受容体への結合は、標的遺伝子の発現1,5,6で得られた転写活性化因子に変換します。 RAシグナル伝達経路は十分に特徴付けされていますが、RAの小さいサイズ（〜300ダ）と両親媒性の性質は、直接組織学的可視化し、現在RAの測定11技術的に実現不可能になります。 dirのための唯一の方法RAレベルのECT測定は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）11を用いて組織サンプルからRAの単離を介してです。この方法は、典型的には、異なるサンプル12をプールすることによって容易に組織を大量に必要とします。したがって、この技術は、個々の胚またはサンプル/組織の少量でRAレベルの測定のためにあまり適していません。 RAの細胞機能を調査するために、いくつかの方法は、間接的に、RAの存在を推測するために開発されています。これらの方法は、β-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ11,13,14の発現を駆動RARE高応答RAR-βを含むレポーターシステムを利用します。 Rossant ら 13によって生成されたトランスジェニックRARE-LacZレポーターマウスは、 その場 11,13,15,16 に RAシグナル伝達の時空間領域を可視化するための理想的なシステムであるが、定量的な測定には不向きです。トンにF9 RARE-LacZの細胞株14、彼一方、組織外植片11,12,14,17,18におけるRAとRAレベルの定量的測定の検出に有用です。 F9奇形癌細胞は、内因性α-、β-、およびγ-レチノイン酸受容体19を発現し 、RA 19-21への曝露後壁側内胚葉への分化を開始します。 F9細胞は、長い間、それはRAレポーターアッセイのための理想的な細胞株として選ばれた理由であるRAによって誘発される細胞分化のモデルとして確立されています。 Wagnerらにより生成されたF9由来SIL-15 RAレポーター細胞ライン14は 、Eを含有しますヒトβ-レチノイン酸受容体（RAR-β）遺伝子の64-bpのレチノイン酸応答要素（RARE）の1コピーの下流coli&#39;LacZ遺伝子 。安定したクローンを選択し、維持するために、構築物はまた、G418の存在下での選択マーカーとしてアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（NEO R）遺伝子が含まれています。この構築物の共同LacZ染色を介して可視化することができ、この応答はその後、比色法11,12,14,18を用いて定量することができるRAの存在下でβ-ガラクトシダーゼのnfers誘導発現。 この非常に多目的レポーター細胞株は、広くそのような17蝸牛および胚の底板外植片14とレポーター細胞と組織サンプルとの共培養を介して内因性RA産生の検出に使用されてきました。また、このレポーターラインは、別々に、胚脊髄のプールされたセクションを培養し、F9 RARE-LacZ細胞18に、これらの培養物からの馴化培地を添加することにより、開発脊髄におけるRAレベルの定量のために使用されてきました。定量化は、標準的なELISAプレートリーダー11,12,18を使用して比色読み取りを介してLacZ染色後に行きました。最後に、このレポーター細胞株は、monitoriによってRA代謝酵素の存在の検出に使用されていますRAレベル12,18でngの変化。 ここでは、このレポーター細胞株の感受性もまた、個々の共培養E8.5胚から生成されたRAレベルの測定を可能にすることを報告しています。これは、異なる遺伝子型の個々の胚の間の比較を可能にします。具体的な例としては、Gpr161は、RAシグナル伝達経路22を介して部分的には神経胚形成を制御するオーファンGPCRである、と私たちは中の全体的なRAレベル上のGpr161（Gpr161のVL）における劣性突然変異の効果を調査するために、このレポーター細胞株を使用して報告します胚。これに加えて、汎用性と使いやすさ、このレポーター系の自由があっても成人脊髄幹細胞から得られたニューロスフェア培養物中で、別の組織サンプルにおいてRAのレベルを測定し、比較することができます。ここでは、F9 RARE-LacZのRA担当者との直接の共培養による胚および神経球培養における相対的なRAレベルの定量的な決意を記述するorter細胞株。

<table><tbody><tr><td>C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000316</td><td></td></tr><tr><td>F9 RARE-LacZ reporter cell line</td><td></td><td></td><td>from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 &amp;deg;C for media preparation</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive</td></tr><tr><td>G418</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131-027</td><td>Store at 4 &amp;deg;C; light-sensitive</td></tr><tr><td>2% Gelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>B-27 supplement (2 % stock solution)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation</td></tr><tr><td>Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td>Prepare 100 &amp;mu;g/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td>Prepare 100 &amp;mu;g/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>50% glutaraldehyde</td><td>Amresco</td><td>M155</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 &amp;middot; H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5670</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-d-galactopyranoside)</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td>Store stock at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>all-trans Retinoic Acid (at-RA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R-2625</td><td>Store 1 ml aliquots of stock in -80 &amp;deg;C; extremely sensitive to light</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605-010</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td>alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered solution (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LK003176</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003703</td><td>Store in 1 ml aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hyaluronic acid&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>385908</td><td>Store 200 &amp;mu;l aliquots at -20 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td>Store in 200 &amp;mu;l aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K3375</td><td>Store in 200 &amp;mu;l aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>95% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Freezing container</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>10 cm culture dish (non-cell culture treated)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm culture dish (cell culture treated)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 cm culture dish (non-cell culture treated)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well cell culture plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml amber microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml cryovials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>surgical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fine surgical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>no. 5 forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>blunt-ended forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scalpel blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass pasteur pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cotton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>alcohol lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISA plate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>stereomicroscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of relative retinoic acid levels in e8.5 embryos and neurosphere cultures using the f9 rare-lacz cell-based reporter assay

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

F9 RARE-LacZレポーターは、ゼラチンでコーティングされた表面上に成長させた接着性胚性癌細胞株です。レポーター構築物は、細胞がβ-ガラクトシダーゼ。11,12,14,18の比例誘導とRAに定量的に対応できるようになります。これらの細胞は、上皮形態（ 図1A）を表示します 。 1：10の割合で3日間 - その高い倍加率のために、これらの細胞は、すべての2を分割することをお勧めします。このレポーター細胞株との作業中に、私たちも培地へG418を添加して、RAに対するこれらの細胞の応答は、数回の継代（ 左側の 図1B）後に弱く、これはレポーターの能力に影響を与えることができることを観察しましたこの細胞株。応答性のこの損失は、後の継代における導入遺伝子の部分的な喪失に起因し得ます。このように、定期的なサブクローニングは、RA（ 図に強力かつ均一な応答者を確保する必要があります1B、右）。 この細胞株の様々な用途は、以前12,14-18を公表してきたが、ここで報告異なる遺伝子型を有する個体E8.5胚からの内因性RAのレベルを測定するために、この細胞株の使用です。 22シグナル伝達の減少胚性RAにおけるGpr161 VL / VL変異をもたらします。 F9 RARE-LacZ細胞との解離胚の共培養によって示されるように、これらのGpr161 VL / VL胚は野生型同腹仔（ 図2A）と比較して、内因性RAが減少しています。なぜならまた、ここで報告このレポーター細胞株の多様性、成人Gpr161 重量/ wtマウス（ 図2B）から得られたニューロスフェア培養により産RAレベルを検出するために、これらの細胞の新規な使用です。このレポーター細胞株は、内因性RAを生成成人脊髄性幹細胞からのニューロスフェア培養物を示すことができました。偉大な差分染色強度のレンスは、E8.5胚に比べて脊髄の神経球に大きいレポーター細胞応答を示しています。これは、原因ニューロスフェア培養物はE8.5胚よりも均質であり、したがって、より多くのRA産生細胞が含まれているという事実である可能性がありE8.5胚に比べて時間をかけて、神経球によって生成されたはるかに大きいRAレベルにすることができます。 レポーター細胞の用量依存性の線形応答で-RAその結果、異なる濃度の添加。この反応は、610 nmの吸光度を読み取ることによって比色測定することができます。生成された標準曲線は、その後、野生型ニューロスフェア培養物（ 図3A）またはE8.5胚（ 図3B）のようなサンプル中のRAのレベルを定量化するために使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig1.jpg" /> 図1. メイントenanceとF9 RARE-LacZ細胞のサブクローニング。 （A）F9 RARE-LacZ細胞の位相差画像を示しています。これらの細胞は、約10時間の倍加時間を持っているし、3日ごとに渡されなければなりません。 - 1：10の割合で（およそ70〜80％コンフルエンス）（B）とその後のLacZ-RAで1 nMで添加した培養液の定期的なテストを染色は文化がRA（右）に強く、均一な応答者のまま確保するために行わなければなりません。貧困層や不均一な応答者（左）の場合には、サブクローニングを実行する必要があります。スケールは100μmのバー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig2.jpg" /> 共培養したサンプル（解離E8.5胚/ニューロスフェア）とF9 RARE-LacZの細胞の 図2 のLacZ染色。（A）E8.5マウス胚<html>様々な遺伝子型のsが解離し、F9 RARE-LacZ細胞の上にプレーティングしました。 LacZのは24時間後に染色して共培養したサンプルによって産生される内在性RAにF9 RARE-LacZの細胞の応答の可視化を可能にします。レポーター細胞の減少反応により可視化減少内因性RAにおけるGpr161 VL変異の結果（B）は、左。成体の脊髄の神経幹細胞から培養された神経球の位相差画像を示しています。右。大人Gpr161 重量/重量脊髄由来神経球を分離し、F9 RARE-LacZ細胞の上にプレーティングしました。 LacZの染色後、青色の沈殿物の存在は、これらの神経球中の内因性RAの存在を示します。ニューロスフェアとE8.5胚の共培養の間の染色強度の差は、E8.5胚よりニューロスフェア中にRAの存在のより高いレベルを示しています。スケールは100μmのバー。ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig3.jpg" /> 図3 標準曲線とRAレベルの比色定量。F9 RARE-LacZのレポーター細胞株の反応は、標準的なELISAプレートリーダーを用いて610 nmで比色測定することができる。（A）の相対的なRAレベルを定量するために使用される代表的な標準曲線を野生型ニューロスフェア培養秒。 （B）共培養E8.5胚からの相対的なRAレベルの定量。 N = 3。 * P &lt;0.05、スチューデントのt検定。エラーバーはSEM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> サントCKのバッファ/ソリューション</td><td> コンポーネント </td><td> 保管条件 </td></tr><tr><td> 10％デオキシコール酸ナトリウム一水和物（C 24 H 39 NaOが4・H 2 O） </td><td> 100ミリリットルのdH 2 Oで10ミリリットル</td><td> 4ºC </td></tr><tr><td> 1 M塩化マグネシウム（MgCl 2） </td><td></td><td> RT </td></tr><tr><td> 100Xフェロシアン化カリウム（K 4 [Fe（CN）6]を・3H 6 O） </td><td> 10ミリリットルのdH 2 O中2.12グラム</td><td>暗所でRT </td></tr><tr><td> 100倍のフェリシアン化カリウム（K 3 [Fe（CN）6]を） </td><td> 10ミリリットルのdH 2 O中1.64グラム</td><td>暗所でRT </td></tr><tr><td> 20 mg / mlでのX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド） </td><td> 20mg / mlストック溶液を作るために、5 mlのジメチルホルムアミドを加えます</td><td> -20ºC </td></tr><tr><td> 10 mMの（3 mg / mlで）すべて-TRANSレチノイン酸</td><td> 16.67ミリリットルの無水エタノール中に50mgを溶解します。 1ミリリットルのアリコートを準備します。 </td><td> 1.5ミリリットルアンバー微量遠心チューブで暗所で-80ºC、 </td></tr><tr><td>パパイン</td><td> 7ミリリットルHBSSで1バイアルを溶解</td><td> 4ºC </td></tr></tbody></table> 表1バッファとソリューションの組成物。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ワーキングバッファ/ソリューション </td><td> コンポーネント </td><td> 保管条件 </td></tr><tr><td> F9 RARE-LacZの細胞培養培地</td><td> 50 mlのウシ胎児血清（FBS）（最終濃度10％） </td><td>フィルター滅菌します。 </td></tr><tr><td></td><td> 5ミリリットル100×ペニシリンストレプトマイシン（最終濃度1X） </td><td> 4ºCで保管してください。 </td></tr><tr><td></td><td> 4mlの50 mg / mlでG418（最終濃度0.4 mg / mlで） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 500 mlのDMEM / F-12（L-グルタミンおよびHEPESを含みます） </td><td></td></tr><tr><td> 0.2％ゼラチン</td><td> 25 mlの2.0％ゼラチン</td><td> 4ºCで保管してください。 </td></tr><tr><td></td><td> 80mlを蒸留水</td><td></td></tr><tr><td></td><td>よく混ぜます</td><td></td></tr><tr><td> 70％エタノール</td><td> 30 mlの95％エタノール</td><td>スプレーボトルに入れます。 </td></tr><tr><td></td><td> 70mlを蒸留水</td><td> RTで保存</td></tr><tr><td>神経球分離培地</td><td> 1ミリリットル20Uパパイン</td><td>新鮮なたびを準備</td></tr><tr><td></td><td> 100μlの13 mg / mlでトリプシン</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100μlの7 mg / mlでヒアルロン酸</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 28μlの10 mg / mlでのDNaseI </td><td></td></tr><tr><td></td><td>50μlの4mgの/ mlのキヌレン酸</td><td></td></tr><tr><td>ニューロスフェア培養培地</td><td> DMEM / F-12（L-グルタミンおよびHEPESを含みます） </td><td>新鮮なたびを準備</td></tr><tr><td></td><td> 2％のB-27サプリメント</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20ng / mlの線維芽細胞増殖因子（FGF） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20ng上皮成長因子（EGF） </td><td></td></tr><tr><td> 2.5％グルタルアルデヒド</td><td> 250μlの50％グルタルアルデヒド</td><td>新鮮なたびを準備</td></tr><tr><td></td><td> 4750μlの1×PBS </td><td></td></tr><tr><td> LacZを洗浄溶液</td><td> 0.5 10mlの％のデオキシコール酸（最終濃度0.1％） </td><td> 4ºCで保管してください。 </td></tr><tr><td></td><td> 1.0ミリリットル100％NP-40（最終濃度0.2％） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 50ミリリットル10X PBS </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 500ミリリットルの蒸留水</td><td></td></tr><tr><td> X-gal染色溶液</td><td> 1xのフェロシアン化カリウム</td><td>新鮮なたびを準備</td></tr><tr><td></td><td> 1xのフェリシアン化カリウム</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1mg / mlのX-galを</td><td></td></tr><tr><td></td><td> LacZの洗浄液を使用して、適切なボリュームに</td><td></td></tr><tr><td> F9 RARE-LacZを凍結培地</td><td> F9 RARE-LacZの培地+ 5％DMSO </td><td>新鮮なたびを準備</td></tr></tbody></table> 表2ワーキングバッファーおよびソリューションの組成物。

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Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

F9 RARE-lacZをセルベースレポーターアッセイを使用したE8.5胚および神経球培養における相対的なレチノイン酸レベルの定量的測定

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

quantitative-measurement-relative-retinoic-acid-levels-e85-embryos

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.8K ビュー.  Rutgers University. Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line. 

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Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to tissue and cell-type specific regulation of gene expression during the cellular differentiation. Thus, their identification and further investigation is important in order to understand how cell fate is determined. Integration of gene expression data (e.g., microarray or RNA-seq) and results of chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based genome-wide studies (ChIP-seq) allows large-scale identification of these regulatory regions. However, functional validation of cell-type specific enhancers requires further in vitro and in vivo experimental procedures. Here we describe how active enhancers can be identified and validated experimentally. This protocol provides a step-by-step workflow that includes: 1) identification of regulatory regions by ChIP-seq data analysis, 2) cloning and experimental validation of putative regulatory potential of the identified genomic sequences in a reporter assay, and 3) determination of enhancer activity in vivo by measuring enhancer RNA transcript level. The presented protocol is detailed enough to help anyone to set up this workflow in the lab. Importantly, the protocol can be easily adapted to and used in any cellular model system.

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

発生生物学

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

の活動の定量化シス</em植片エレクトロポレーションによってマウス網膜で>調節エレメント

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

神経科学

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

の解離、文化、および分析<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚性網膜組織

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during development and in disease states. Single-cell RNA sequencing allows us to comprehensively profile gene expression changes observed in retinal development and disease at a cellular level, while single-cell ATAC-Seq allows analysis of chromatin accessibility and transcription factor binding to be profiled at similar resolution. Here the use of these techniques in the developing retina is described, and MULTI-Seq is demonstrated, where individual samples are labeled with a modified oligonucleotide-lipid complex, enabling researchers to both increase the scope of individual experiments and substantially reduce costs.

Here, the authors showcase the utility of MULTI-seq for phenotyping and subsequent paired scRNA-seq and scATAC-seq in characterizing the transcriptomic and chromatin accessibility profiles in retina.

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

口腔顔面表現型の定量化で<em&gt;アフリカツメガエル</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

生物学

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

ニトロレダクターゼ/メトロニダゾール媒介アブレーションとゼブラフィッシュ網膜色素上皮の再生を研究するためのMATLABプラットフォーム(RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Measuring Retinoic Acid Levels in Neurospheres Using a Retinoic Acid Reporter Cell Line

Source: Ababon, M. R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54443">Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2016).
This video demonstrates the measurement of retinoic acid (RA) secretion from neurosphere cells using RA reporter cells. It outlines the steps involved in co-culturing neurosphere cells with RA reporter cells and performing a colorimetric RA assay to measure RA levels.

レチノイン酸レポーター細胞株を用いたニューロスフェアにおけるレチノイン酸レベルの測定(英語)

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solution and Media ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Developmental and Pediatric Disorders

Employing Reporter Cells in a Co-Culture to Study Retinoic Acid Production by Mouse Embryonic Cells

Source: Ababon, M. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54443">Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for assessing retinoic acid activity in mouse embryos. Upon isolating cells from the mouse embryos, the cells are co-cultured with retinoic acid (RA) reporter cells. Embryonic cells produce RA, which induces beta-galactosidase expression in reporter cells, indicating RA activity in the embryonic cells.

レポーター細胞を共培養に用いたマウス胚細胞によるレチノイン酸産生の研究

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines
1. Solution and Media Preparation

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神経細胞培養技術

共培養と相互作用の研究

Retinoic Acid-Induced Neurogenesis using Mouse Embryonic Carcinoma Cells

Source: Leszczy&#324;ski, P., et al.,&#160; <a href="https://app.jove.com/v/58225">Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates a simple technique for retinoic acid-induced neurogenesis in P19 mouse embryonic carcinoma cells. Retinoic acid activates transcription factors and triggers gene expression for neuronal differentiation.

F9 RARE-lacZをセルベースレポーターアッセイを使用したE8.5胚および神経球培養における相対的なレチノイン酸レベルの定量的測定

要約

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レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

の活動の定量化シス調節エレメント

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

の解離、文化、および分析

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

口腔顔面表現型の定量化で

ニトロレダクターゼ/メトロニダゾール媒介アブレーションとゼブラフィッシュ網膜色素上皮の再生を研究するためのMATLABプラットフォーム(RpEGEN)

レチノイン酸レポーター細胞株を用いたニューロスフェアにおけるレチノイン酸レベルの測定(英語)

レポーター細胞を共培養に用いたマウス胚細胞によるレチノイン酸産生の研究

マウス胚性癌細胞を用いたレチノイン酸誘導性新生