We would like to acknowledge Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) for providing us with the F9 RARE-LacZ cells and technical support. This study is funded by the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (Grantnumber:10-3092-SCR-E-0) and the New Jersey Commission on Brain Injury Research (NJCBIR) (Grant number: CBIR13FEL006).

Tutto il lavoro animale è stato fatto secondo i metodi Rutgers-RWJMS IACUC approvati. 1. Soluzione e Media Preparazione <ol><li> Preparare soluzioni tampone e come da Tabella 1. Preparare le soluzioni di lavoro come da Tabella 2. </li></ol> 2. Cultura e manutenzione di cellule rare F9-LacZ <ol><li> Cellule congelate scongelamento <ol><li> Preparare F9 mezzo di coltura cellulare RARE-LacZ come indicato nella tabella 2. </li><li> Coat 10 cm piatti di coltura (coltura di cellule trattati) con 10 ml di 0,2% di gelatina (vedi tabella 2) per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare l&#39;eccesso di gelatina con due risciacqui di 10 ml di acqua distillata. Immediatamente aggiungere 9 ml di mezzo di coltura cellulare F9 RARE-LacZ nel pallone per impedire la gelatina da essiccazione. </li><li> Scongelare una fiala di cellule rare-LacZ F9 14 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per 2 - 3 min. Cellule piastra (circa 1 x 10 6 cellule / ml) nel piatto rivestito containing 9 ml di terreno di coltura. Cultura a 37 ° C, 5% di CO 2. Cambiare la media il giorno successivo. </li></ol></li><li> Manutenzione di F9 cellule rare-LacZ <ol><li> Mantenere un regolare passaggio ogni 2 - 3 giorni in un rapporto di 1:10. Nota: Non lasciate che le cellule crescono in confluenza come questo si tradurrà in loro differenziazione. </li><li> Dividere le culture ad una confluenza del 80-90%. Rimuovere il supporto e lavare le cellule con 10 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS). Rimuovere il PBS e aggiungere 1 ml di tripsina, incubare per 5 min. Aggiungere 9 ml di terreno di coltura, pipetta su e giù e dividere le celle 01:10 per il passaggio. </li></ol></li><li> Congelamento F9 cellule rare-LacZ <ol><li> Trypsinize un piatto di 10 centimetri contenente cellule rare-LacZ F9 a 80 - 90% confluenza come descritto al punto 2.2.2. Trasferire le cellule dissociate in un 15 ml provetta da centrifuga e far girare a 200 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare in 10 ml di F9 RARE-LacZ freezing media (vedi tabella 2). Aliquota 1 ml in cryovials etichettati e fiale di trasferimento in contenitori di congelamento. Posizionare il congelamento contenitore -80 ° C congelatore O / N e di trasferimento fiale di serbatoi di azoto liquido il giorno successivo. </li></ol></li></ol> 3. La dissezione di E8.5 embrioni <ol><li> Accoppiamento Cage Set-up e tappo di controllo <ol><li> Set-up una gabbia di accoppiamento contenente una coppia di accoppiamento. La mattina del giorno successivo, verificare la presenza di un tappo vaginale e designare il giorno una spina si trova come giorno 0.5 23. Al giorno E8.5, gli embrioni di raccolta. </li></ol></li><li> Dissezione di embrioni <ol><li> Sacrificio della diga attraverso dislocazione cervicale e spruzzare la zona addominale con il 70% di etanolo (vedi tabella 2). Fare un taglio trasversale sulla pelle sopra l&#39;addome con le forbici chirurgiche e tirare i due lembi a parte (anteriore e posteriore) per esporre la zona addominale. Fare un taglio similesul peritoneo per esporre l&#39;addome. </li><li> Individuare il uteri e rilasciare uteri dagli ovidotti e mesometrio utilizzando un paio di forbici 23. Posizionare il uteri in un piatto di 6 centimetri (cultura non-cellule trattate) con 10 ml di PBS 1x per lavare via il grasso in eccesso e sangue. Trasferimento ad un altro 6 centimetri piatto contenente freschi 10 ml di PBS 1X. </li><li> Separare una utero un embrione contenente tagliando fuori con le forbici chirurgiche. Rimuovere l&#39;utero e decidua e rilasciare il sacco vitellino che contengono l&#39;embrione con due coppie di no. 5 pinze 23. </li><li> Separare il sacco vitellino dall&#39;embrione, e trasferire il sacco vitellino di una provetta da 1,5 ml per l&#39;estrazione del DNA genomico da utilizzare per la genotipizzazione. Utilizzare una pipetta P20 con una punta ampio tunnel, trasferire l&#39;intero embrione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 10 ml di tripsina. Posizionare la provetta in ghiaccio. </li><li> Ripetere i punti 3.2.3 - 3.2.4 fino a quando tutti gli embrioni sono stati sezionati. </li></ol></li><li> Embryo dissociazione<ol><li> Incubare le provette 1,5 ml contenenti embrioni in tripsina a 37 ° C per 5 min per facilitare dissociazione enzimatica. <ol><li> Triturare delicatamente con una pipetta P20 per la dissociazione meccanica dell&#39;embrione, e la piastra tutto il volume 10 ml contenente un embrione dissociato più di un pozzo di cellule rare-LacZ F9 in una piastra a 96 pozzetti (vedi punto 5.1 per la placcatura cellule F9 RARE-LacZ in una piastra a 96 pozzetti). Culture O / N a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li></ol></li></ol> Cord 4. laminectomia, dissezione adulti vertebrale lombare e della cultura neurosfere <ol><li> laminectomia <ol><li> Sacrifica un (P60) topo adulto attraverso dislocazione cervicale. </li><li> Spruzzare il lato dorsale con il 70% di etanolo e fare un taglio trasversale con le forbici chirurgiche. Tirare entrambe le alette (anteriore e posteriore) a parte per esporre la schiena e la colonna vertebrale. </li><li> Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare i muscoli che coprono la colonna vertebrale.Individuare regione lombare della colonna vertebrale, sotto le costole. Utilizzando le forbici, fare un taglio profondo per recidere la colonna vertebrale a questo punto per esporre il midollo spinale. </li><li> Sollevare la regione lombare della colonna vertebrale senza. 5 pinza in modo che la sezione trasversale esposta del midollo spinale si trova ad affrontare lo sperimentatore. Utilizzando la punta delle forbici sottili, tagliare la vertebra e del muscolo nelle posizioni ore 3 e ore 9 del estremità esposta. Afferrare l&#39;aletta dorsale della vertebra taglio con una pinza. Continuare questi tagli caudalmente fino riceva la lunghezza del midollo spinale lombare. </li><li> Rilasciare il midollo spinale dalle vertebre tramite no. 5 così come forcipe smussato-ended. Trasferire il midollo spinale ad una provetta da 15 ml contenente 3 ml di terreno / coltura DMEM F12. Tenere in ghiaccio fino a quando tutti midollo spinale lombare sono stati isolati. </li></ol></li><li> Dissezione del midollo spinale <ol><li> Versare il terreno di coltura con il midollo spinale in un piatto 6 cm (coltura non-cellule trattate). </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere il gangli spinali e vasi sanguigni in tutto il segmento del midollo spinale afferrando i vasi sanguigni e gangli utilizzando due coppie di no. 5 pinze e delicatamente tirando via dal midollo spinale. Trasferire il segmento del midollo spinale di un piatto di 6 centimetri, senza media e tritare finemente il tessuto utilizzando un bisturi. </li><li> Trasferimento tritato tessuto a tubo da 15 ml contenente 1 ml di mezzi neurosfere di dissociazione (vedi tabella 2). Mettere la provetta in ghiaccio e ripetere i passaggi 4.2.1 - 4.2.2 fino a quando tutti i midolli spinali sono stati elaborati. </li><li> Incubare le provette contenenti tessuto macinate in medium di dissociazione a 37 ° C per 10 min, flick tubo sul lato di mescolare e incubare a 37 ° C per altri 10 min. Dopo la digestione enzimatica, triturare con pipette Sfaccettate di diametri decrescenti per la dissociazione meccanica. Nota: Preparare pipette ribruciate di diminuire diametri prima di eseguire esperimenti. Prendete un bicchiere Pasteurpipetta e inserire l&#39;estremità larga con cotone pulito. Utilizzando una lampada ad alcool, il fuoco lucidare le punte delle pipette in fiamme per creare diversi diametri: &quot;regolare&quot;, &quot;fine&quot; e &quot;extra fine&quot;. Per &quot;normali&quot; pipette lucidato, roteare l&#39;estremità della pipetta nella fiamma per arrotondare i bordi senza diminuire il diametro (~ 1 mm). Ruotare l&#39;estremità della pipetta nella fiamma per un periodo leggermente più lungo per creare &quot;fine&quot; (~&gt; 1 mm e&gt; 5 mm di diametro) e &quot;extra fine&quot; (~ 0.5 mm) pipette lucidate. Non utilizzare pipette con diametro inferiore a 0,5 mm. </li></ol></li><li> cultura neurosfere <ol><li> Spin down provette contenenti dissociate tessuto del midollo spinale a 200 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e pellet cellulare risospendere in 1 ml di terreni di coltura neurosfere (vedi tabella 2). Triturare con una pipetta P 1.000 seguito da una pipetta P200 per facilitare la dissociazione. Nota: evitare le bolle che introducono,che sarebbe diminuire la vitalità cellulare. </li><li> Trasferire 10 ml di cellule dissociate in un emocitometro e ottenere una conta cellulare. Cellule piastra ad una densità di 1x10 5/10 ml in un pallone T25 con 10 ml di terreni di coltura neurosfere. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 7 giorni fino neurospheres appaiono 24. </li></ol></li><li> neurosfere dissociazione <ol><li> Raccogliere la cultura neurosfere e trasferire a 15 mL. Spin a 200 xg per 10 min. Rimuovere la maggior parte del surnatante lasciando 1 ml. Triturare con una pipetta P 1.000 per risospendere il pellet cellulare e dissociare neurosfere in singole cellule. Trasferimento 10 ml di cellule dissociate in un emocitometro e ottenere un numero di celle. </li><li> Piastra 1 x 10 5 cellule dissociate neurosfere più di un pozzo di F9 RARE-LacZ in una piastra a 96 pozzetti (vedere paragrafo 5.1 per la placcatura F9 RARE-LacZ in piastra da 96 pozzetti). Piastra 3 pozzi come repliche. Culture O / N a 37 ° C e 5% CO 2.</li></ol></li></ol> 5. RA Assay di E8.5 embrioni e midollo spinale Neurosfere <ol><li> Placcatura F9 RARE-LacZ in piastra a 96 pozzetti <ol><li> Un giorno prima di embrioni E8.5 raccolta o la dissociazione di neurosfere, cappotto una piastra a 96 pozzetti con 100 ml di 0,2% di gelatina per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la gelatina e lavare due volte con 200 ml di acqua distillata. </li><li> cellule rare-LacZ Trypsinize F9 mantenuti in piatti di 10 cm come descritto al punto 2.2.2. Piastra 1 x 10 5 cellule / pozzetto di cellule LacZ F9-rare, ma questa volta utilizzando terreno di coltura senza G418. </li><li> Preparare sufficienti pozzetti per co-coltura di embrioni (~ 12 - 20, a seconda delle dimensioni lettiera), neurosfere (3 pozzi / genotipo) così come per una curva standard in triplice copia (27 pozzetti). </li></ol></li><li> Co-cultura F9 RARE-LacZ e E8.5 embrioni o del midollo spinale Neurosfere <ol><li> embrioni Harvest come dettagliato nella sezione 3.2 e la piastra in cima F9RARE-LacZ nella piastra a 96 pozzetti dal paragrafo 5.1. In modo simile, dissociare neurosfere e piatto sopra F9 RARE-LacZ nella piastra a 96 pozzetti come dettagliato nel passo 4.4. Culture O / N a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li><li> Generazione di una curva standard <ol><li> Per generare una curva standard, prepararsi all-trans RA (at-RA) soluzioni con le seguenti concentrazioni: 100 nm, 10 nm, 1 nm, 100 pM, 22:00, 13:00, 100 fm, per diluizione seriale del at- RA magazzino (vedi Tabella 1) con terreno di coltura RARE-LacZ F9. </li><li> Aggiungere 100 ml di questi diversi at-RA concentrazioni di cellule rare-LacZ F9 dalla sezione 5.1. Assegnare pozzetti contenenti F9 non trattata cellule rare-LacZ come controllo negativo. Preparare triplicato di ogni concentrazione RA e pozzetti di controllo negativo. Culture O / N a 37 ° C e 5% CO 2. Nota: le cellule RARE-LacZ F9 rispondono in modo lineare dose-dipendente a diverse concentrazioni di RA all trans. </li></ol></li><li> RA Assay <ol><li> Dopo cultura O / N della piastra a 96 pozzetti contenente le curve standard e co-culture, rimuovere il supporto e fissare le culture con l&#39;aggiunta di 100 ml di 2,5% glutaraldeide (vedi tabella 2) per 15 minuti, RT. Rimuovere il fissativo e lavare due volte con 200 microlitri 1x PBS, 10 minuti a lavaggio. </li><li> Rimuovere PBS e lavare tre volte con 200 ml di soluzione di lavaggio LacZ (vedi Tabella 2), 10 minuti a lavaggio. Durante il terzo lavaggio, preparare la soluzione colorante X-gal in una provetta da 15 ml avvolta in foglio (vedi Tabella 2). Calcolate quanto soluzione colorante è necessario e preparare la giusta quantità (200 pl / pozzetto). Nota: la soluzione X-gal colorazione è sensibile alla luce. Utilizzare la soluzione colorante entro 15 minuti dopo la preparazione. </li><li> Preparare una camera umidificata mettendo un tovagliolo di carta inumidito con acqua distillata in un contenitore di plastica abbastanza grande da contenere una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 200 microlitri della Xsoluzione colorante -Gal per pozzetto della piastra a 96 pozzetti e posizionare la piastra in una camera umidificata. </li><li> Incubare camera umidificata contenente la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C per consentire lo sviluppo di precipitato di colore blu. Per gli embrioni E8.5, incubare la piastra di O / N (12 - 16 ore). Per neurosfere culture, incubare la piastra per 4-8 ore. </li></ol></li><li> Leggere ad assorbanza di OD 610 e Imaging <ol><li> Dopo la reazione di colore, rimuovere la soluzione LacZ colorazione e sostituire con 200 microlitri 1x PBS. Misurare l&#39;assorbanza a 610 nm usando un lettore standard di piastra ELISA per quantificare la risposta reporter di RA. Immagine singoli pozzi utilizzando uno stereomicroscopio di serie dotato di una fotocamera. </li></ol></li></ol> 6. Subclonaggio di F9 cellule rare-LacZ <ol><li> Controllo F9 RARE-LacZ rResponse per RA <ol><li> Prima di iniziare gli esperimenti, testare la risposta delle cellule RARE-LacZ F9 per RA. Piastra F9 RARE-LacZ cells a 96 pozzetti (vedere paragrafo 5.1), e aggiungere 1 nM all-trans retinoico (vedi punto 5.3). Incubare in una camera umidificata a 37 ° CO / N. </li><li> Visualizza sviluppo di precipitato di colore blu utilizzando un microscopio. Se lo sviluppo colore non è uniforme attraverso le cellule nel pozzo (vedere Figura 1B, sinistra), eseguire subcloning seguito dettagliato. </li></ol></li><li> Subcloning di F9 cellule rare-LacZ <ol><li> Dividere le celle RARE-LacZ F9 coltivate in 10 piatti cm come descritto al punto 2.2.2. Invece di un rapporto 1:10, piastra una bassa densità di semina di 1 x 10 5 cellule / 10 ml in un piatto 10 cm per consentire la crescita di colonie isolate tale che ogni colonia deriva da una singola cella F9 RARE-LacZ. </li><li> Dopo due giorni, il cappotto di un 24-pozzetti con 500 ml di 0,2% di gelatina per pozzetto per 30 min. Rimuovere la soluzione di gelatina e risciacquare pozzi due volte con 500 microlitri di acqua distillata. Sostituire l&#39;acqua con 500 ml di F9 mezzo di coltura cellulare RARE-LacZ. </li><li> Scegliere una colonia con una sterile punta P10 pipetta e trasferire in un pozzo; fare questo 24 volte per ottenere 24 colonie individuali. Coltura a 37 ° C, 5% CO 2 per 3 - 4 giorni. </li><li> Dividere le singole colonie in due piastre da 24 pozzetti. Dopo 2 giorni di coltura, aggiungere 1nM di RA in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e cultura O / N. Eseguire LacZ colorazione come descritto nella sezione 5.4 di prova per alte responder. Visualizza reazione cromatica di ogni pozzetto sotto un microscopio per determinare responder forti e uniformi. </li><li> Una volta che un forte responder subclone è determinato, espandere la cultura corrispondente dall&#39;altro 24 pozzetti. Espandere ulteriormente quella colonia in un piatto 10 cm e congelare giù parecchie fiale come descritto nella sezione 2.3, e scartare tutte le altre colonie. Nota: solo circa un quarto delle colonie originali comporta alti responder. Tipicamente, il primo round di subcloning non si traduca in colorazione LacZ uniforme e un successivo giro di subcloning deve essere fatto araggiungere responder forti uniformi. </li></ol></li></ol>

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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+GPCR,+Gpr161,+regulates+the+retinoic+acid+and+canonical+Wnt+pathways+during+neurulation.">The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation.</a> Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).</li><li>Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (1986).</li><li>Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+adult+Mammalian+neural+stem+and+progenitor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay.</a> Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La linea cellulare F9 RARE-LacZ 14 è un potente sistema che può essere utilizzato per il rilevamento di RA prodotto da espianti tissutali 12,14,17,18. E &#39;sensibile a concentrazioni RA a partire da 100 Fm, con nessuna risposta non specifica rilevata in cellule non trattate con RA 12,14,18. Inoltre, le cellule giornalista rispondono a tutto-trans RA in modo lineare in un intervallo specifico di concentrazione, permettendo così la reazione LacZ da quantificare e utilizzato per determinare l&#39;entità di livelli RA 12,14,18. Il test rapido e facile RA giornalista qui presentata utilizza la linea cellulare giornalista F9 RARE-LacZ per la visualizzazione (Figura 2) e la misurazione quantitativa relativa (Figura 3) di embrioni e cellule staminali neurali in coltura per adulti. Questo sistema reporter permette confronto dei livelli endogeni RA tra singoli campioni, come mostrato in Figura 2. È abbastanza sensibile da poter rilevare RAgenerato dai singoli embrioni E8.5 (Figura 2A) e RA prodotti da neurospheres coltura (Figura 2B). La risposta dose-dipendente di questa linea cellulare di concentrazioni variabili di RA consente la quantificazione dei livelli RA (Figura 3A) nei campioni così come il confronto dei livelli relativi RA tra i campioni (Figura 3B). E &#39;importante notare che la linea cellulare giornalista RARE F9 misura la quantità complessiva di RA generato dai campioni di tessuto nel tempo di incubazione. Questo è equivalente al saldo netto della sintesi RA e catabolismo. Mentre il F9 sistema reporter cellule RARE-LacZ è altamente sensibile e versatile, ci sono diversi passaggi di risoluzione dei problemi critici che abbiamo incorporato per garantire l&#39;affidabilità del sistema. In primo luogo, come mostrato nella Figura 1, è importante mantenere la salute di queste cellule di passaggi regolari senza farli gremare a confluenza. Secondo, abbiamo osservato dopo passaggi tendono a provocare risposte RA inconsistenti, anche se le culture sono costantemente mantenuti in selezione con G418. Per risolvere questo, si consiglia di scartare culture dopo 20 passaggi e scongelare un nuovo flacone. Inoltre, i controlli periodici devono essere eseguiti per garantire che le cellule giornalista ancora forti responder alla presenza di RA nei media. In terzo luogo, se i primi passaggi mostrano scarsa risposta o non uniforme di RA (Figura 1B, a sinistra), uno o più giri di subcloning possono essere necessarie fino a quando responder forti sono ottenuti (Figura 1B, a de stra). Infine, prima della co-coltura, si raccomanda che i campioni di tessuto come embrioni e neurosfere sono dissociati per singole cellule. Abbiamo osservato che la dissociazione dei campioni risultati delle misurazioni colorimetriche più coerenti. Ciò può essere dovuto ad una distribuzione più uniforme delle RA nei pozzetti di coltura, le cellule dissociate sono in uniFormulario di contatto con le cellule Reporter. Diverse modifiche sono state apportate anche al protocollo originale 14. In primo luogo, la risposta RA delle cellule RARE-LacZ F9 sono stati quantificati fissando direttamente le cellule e misurare l&#39;assorbanza a 610 nm, invece di raccogliere le cellule e l&#39;analisi di lisato per l&#39;attività b-galattosidasi 14. Un&#39;altra modifica è la co-coltura diretta di campioni dissociate con F9 RARE-LacZ prima quantificazione della risposta RA. I metodi precedenti hanno riportato la coltura di campioni separatamente e aggiungendo solo il supporto da queste culture a F9 RARE-LacZ 16,18. Nonostante il suo essere un sistema potente, il saggio giornalista RARE-LacZ F9 ha diversi limiti. Una limitazione di questa linea cellulare giornalista è che anche se risponde fortemente alla presenza di tutto-trans RA, risponde anche ad altri isomeri dell&#39;acido retinoico cui 9-cis-RA e 13-cis-RA; tuttavia, sono 100 volte più sensibili a tutto-trans compa RArosso per gli altri isomeri 18. Un altro limite di questo sistema è che la risposta lineare dose-dipendente cade tra il 10 -13 M a 10 -7 M at-RA 14,18; pertanto, se si confrontano i livelli RA fuori di questi limiti, potrebbe essere necessario eseguire una diluizione seriale del campione fino a quando le misurazioni rientrano nel range lineare. Infine, poiché questo è soprattutto un saggio colorimetrico, il punto finale di sviluppo del colore può variare tra i campioni ed esperimenti. Pertanto, è importante che una curva standard sempre essere placcato in parallelo per ogni singolo esperimento per usarlo per la quantificazione della risposta cellulare giornalista. In conclusione, abbiamo riportato l&#39;utilizzo della linea cellulare giornalista RARE-LacZ RA F9 per misurare i livelli di RA quantitativamente negli embrioni E8.5 e, in precedenza non dichiarata, in neurosfere. La versatilità di questo sistema reporter può consentire la quantificazione dei livelli di RA praticamente in qualsiasi tipo di cellula o tessuto, e may portare allo sviluppo di varie applicazioni in futuro.

L&#39;acido retinoico (RA) è un derivato metabolita di retinolo o vitamina A ed è prodotto attraverso l&#39;attività sequenziali di diversi deidrogenasi cellulari 1. A causa della sua natura chimica amphiphatic, attraversa facilmente le membrane lipidiche e può agire come fattore morfogenetico solubile 1. E &#39;una molecola essenziale che regola numerosi processi cellulari sviluppo e adulti agendo come ligando per i recettori nucleari dei retinoidi e attivazione genica 2-10. Senza RA, questi recettori RA (RAR) RARE legano a DNA e ad agire come repressori; RA legandosi a questi recettori li trasforma in attivatori trascrizionali conseguente obiettivo di espressione genica 1,5,6. Anche se il percorso di segnalazione RA è ben caratterizzato, le piccole dimensioni (~ 300 Da) e la natura amphipathic di RA rende la visualizzazione diretta istologico e la misurazione di RA attualmente tecnicamente irrealizzabile 11. L&#39;unico metodo per direct misurazione dei livelli di Ra è attraverso l&#39;isolamento di RA da campioni di tessuto mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) 11. Questo metodo richiede tipicamente grandi quantità di tessuto, facilitato mettendo in comune diversi campioni 12. Così, questa tecnica è poco adatta per la misurazione dei livelli di RA nei singoli embrioni o piccole quantità di campione / tessuto. Per studiare la funzione cellulare di RA, vari metodi sono stati sviluppati per inferire indirettamente la presenza di RA. Questi metodi fanno uso di sistemi giornalista che contengono il altamente reattivo RAR-beta RARE guida l&#39;espressione di beta-galattosidasi o luciferasi 11,13,14. Il topo transgenico giornalista RARE-LacZ generato da Rossant et al. 13 è un sistema ideale per la visualizzazione regioni spazio-temporali di segnalazione RA in situ 11,13,15,16, ma non è adatto per misurazioni quantitative. La linea cellulare RARE-LacZ F9 14, su tlui, invece, è utile per il rilevamento di RA e misurazioni quantitative dei livelli di RA in espianti di tessuto 11,12,14,17,18. Cellule teratocarcinoma F9 esprimono alfa endogena, beta, e acido gamma-retinoico recettori 19, e avviare la differenziazione in parietale endoderma dopo l&#39;esposizione al RA 19-21. cellule F9 sono stati da tempo stabilito come modello per la differenziazione cellulare indotta dal RA, è per questo che è stato scelto come una linea cellulare ideale per un test RA giornalista. La linea cellulare giornalista F9-derivato Sil-15 RA generato da Wagner et al. 14 contiene una E. coli&#39;LacZ gene a valle di una copia del retinoico elemento di risposta acido 64-bp (RARE) del gene del recettore beta dell&#39;acido retinoico umano (RAR-beta). Al fine di selezionare e mantenere cloni stabili, il costrutto contiene inoltre il gene aminoglicoside fosfotransferasi (r NEO) come marcatore selezionabile in presenza di G418. Questo costrutto confers espressione inducibile di b-galattosidasi in presenza di RA, che può essere visualizzato mediante colorazione LacZ e questa risposta può essere successivamente quantificata utilizzando metodi colorimetrici 11,12,14,18. Questa linea cellulare giornalista estremamente versatile è stato ampiamente utilizzato nella rilevazione della produzione RA endogena tramite co-coltura di campioni di tessuto con le cellule giornalista, come cocleari 17 e embrionali espianti piatto piano 14. Inoltre, questa linea giornalista è stato utilizzato per la quantificazione dei livelli di RA in via di sviluppo midollo spinale coltivando sezioni pool di midolli spinali embrionali separatamente e l&#39;aggiunta di mezzi condizionati da queste culture a cellule rare-LacZ F9 18. La quantificazione è stata eseguita dopo LacZ colorazione attraverso la lettura colorimetrica utilizzando un lettore di piastre ELISA standard 11,12,18. Infine, questa linea cellulare giornalista è stato utilizzato nella rilevazione della presenza di RA enzimi metabolici monitoring cambiamenti nei livelli di RA 12,18. Qui riportiamo che la sensibilità di questa linea cellulare giornalista consente anche per la misurazione dei livelli di RA generati dai singoli embrioni E8.5 co-coltura. Ciò permette il confronto tra i singoli embrioni di diversi genotipi. Come esempio specifico, Gpr161 è un GPCR orfano che regola neurulazione in parte attraverso il percorso di segnalazione RA 22, e riportiamo utilizzare questa linea cellulare giornalista per indagare l&#39;effetto di una mutazione recessiva in Gpr161 (Gpr161 vl) sui livelli di RA complessivi del embrione. In aggiunta a questo, la versatilità e la facilità d&#39;uso di questo sistema reporter permette la libertà di misurare e confrontare i livelli di RA in diversi campioni di tessuto, anche in colture di neurosfere ottenute da cellule staminali adulte del midollo spinale. Qui si descrive la determinazione quantitativa dei livelli relativi RA negli embrioni e culture neurosfere attraverso co-coltura diretto con il F9 RARE-LacZ RA replinea cellulare Orter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9 RARE-LacZ reporter cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 C for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10131-027</td>
			<td>Store at 4 &#176;C; light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (2 % stock solution)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-33</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M155</td>
			<td>Store at 4 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 &#183; H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5670</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferrocyanide (K&#8324;[Fe(CN)&#8326;] &#183; 3H&#8322;O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-9387</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferricyanide (K&#8323;[Fe(CN)&#8326;])</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-d-galactopyranoside)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3941</td>
			<td>Store stock at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>all-trans Retinoic Acid (at-RA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R-2625</td>
			<td>Store 1 ml aliquots of stock in -80 &#176;C; extremely sensitive to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Store at 4 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Store at 4 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003176</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003703</td>
			<td>Store in 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>385908</td>
			<td>Store 200 &#956;l aliquots at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td>Store in 200 &#956;l aliquots at -20 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Store in 200 &#956;l aliquots at -20 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish (non-cell culture treated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish (cell culture treated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm culture dish (non-cell culture treated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml amber microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml cryovials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>no. 5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-ended forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alcohol lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of relative retinoic acid levels in e8.5 embryos and neurosphere cultures using the f9 rare-lacz cell-based reporter assay

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

Il F9 RARE-LacZ giornalista è una linea di cellule di carcinoma embrionale aderenti cresciuto sulla superficie di gelatina rivestita. Il costrutto giornalista permette alle cellule di rispondere quantitativamente RA con una induzione proporzionale di beta-galattosidasi. 11,12,14,18. Queste cellule mostrano una morfologia epiteliale (Figura 1A). A causa del loro alto tasso raddoppio, si raccomanda che queste cellule essere suddivisi ogni 2 - 3 giorni in un rapporto di 1:10. Durante il lavoro con questa linea cellulare giornalista, abbiamo osservato che anche con l&#39;aggiunta di G418 nel terreno di coltura, la risposta di queste cellule a RA indebolisce dopo vari passaggi (Figura 1B, sinistra), e questo può influenzare la capacità giornalista di questa linea cellulare. Questa perdita di reattività può essere dovuto alla perdita parziale del transgene in passaggi successivi. Come tale, subcloning periodica è necessaria per garantire responder forti e uniformi al RA (Figura1B, a destra). Mentre vari usi di questa linea cellulare è stato precedentemente pubblicato 12,14-18, qui riportato è l&#39;uso di questa linea cellulare per misurare i livelli endogeni RA dai singoli embrioni E8.5 con differenti genotipi. I risultati Gpr161 vl / vl mutazione in diminuzione RA embrionale segnalazione 22. Come dimostrato dalla co-coltura di embrioni dissociate con cellule rare-LacZ F9, questi embrioni Gpr161 VL / VL hanno ridotto endogena RA rispetto al wild-type cucciolata (Figura 2A). A causa della versatilità di questa linea cellulare giornalista, riportato anche qui è un nuovo uso di queste cellule per rilevare i livelli RA prodotti da colture di neurosfere ottenute da adulto Gpr161 topi WT / WT (Figura 2B). Questa linea cellulare giornalista è stato in grado di dimostrare che le culture neurosfere da cellule staminali adulte del midollo spinale produrre RA endogeno. Il grande differenza in intensità di colorazione indica una maggiore risposta delle cellule reporter di neurosfere del midollo spinale, rispetto agli embrioni E8.5. Ciò può essere dovuto a molto maggiori livelli di RA generati dalle neurosfere nel tempo rispetto agli embrioni E8.5, che potrebbe essere dovuto al fatto che neurosfere culture sono più omogenei di embrioni E8.5 e quindi contengono più cellule RA-produttori. L&#39;aggiunta di diverse concentrazioni di risultati a-RA in una risposta lineare dose-dipendente delle cellule del reporter. Questa risposta può essere misurata colorimetricamente leggendo l&#39;assorbanza a 610 nm. La curva standard generata può quindi essere utilizzato per quantificare i livelli di RA nei campioni, come ad esempio nel wild-type culture neurosfere (Figura 3a) o embrioni E8.5 (figura 3b). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig1.jpg" /> Figura 1. Maintenance e Subclonaggio di F9 cellule rare-LacZ. (A) viene ammonito immagine a contrasto di fase di cellule rare-LacZ F9. Queste cellule hanno un tempo di raddoppio di ~ 10 ore e devono essere trasmessi ogni 3 giorni. (Circa 70 - 80% di confluenza) in un rapporto 1:10 (B) Controllo periodico delle culture con aggiunta di 1 nM a-RA e successiva LacZ colorazione deve essere fatto per garantire le culture rimangono responder forti e uniformi per la RA (a destra). In caso di poor responders e non uniformi (a sinistra), subcloning deve essere eseguita. Scala bar 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig2.jpg" /> I campioni Figura 2. LacZ colorazione di co-coltura (dissociato E8.5 Embrioni / Neurosfere) e F9 cellule rare-LacZ. (A) embrione di topo E8.5<html> s di vari genotipi sono stati dissociato e placcato in cima cellule RARE-LacZ F9. LacZ colorazione 24 ore più tardi permette la visualizzazione della risposta delle cellule F9 RARE-LacZ a endogena RA prodotte da campioni di co-coltura. Il Gpr161 vl mutazione risultati in RA endogeno diminuito come visualizzato dalla ridotta risposta delle cellule giornalista. (B) a sinistra. Viene mostrato un immagine a contrasto di fase di neurosfere in coltura da cellule staminali neurali adulte del midollo spinale. Destra. Neurosfere derivate da adulto Gpr161 midollo spinale peso / peso sono state dissociate e placcati in cima cellule RARE-LacZ F9. La presenza di precipitato blu dopo colorazione LacZ indica la presenza di endogena RA in queste neurosfere. La differenza di colorazione di intensità tra le neurosfere e E8.5 embrioni co-colture indicano maggiori livelli di RA presente in neurosfere di embrioni E8.5. Scala bar 100 micron.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig3.jpg" /> Figura 3. curva standard e colorimetrica quantificazione dei livelli di RA. La risposta della linea cellulare giornalista F9 RARE-LacZ possono essere misurati colorimetria a 610 nm usando un lettore standard di piastra ELISA. (A) curva standard rappresentativa utilizzata per quantificare livelli relativi RA di wild-type neurosfere cultura s. (B) Quantificazione dei livelli relativi RA da embrioni E8.5 co-coltura. N = 3; * P &lt;0.05, test t. Le barre di errore SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> StoBuffer ck / Soluzioni </td><td> componenti </td><td> Condizioni di archiviazione </td></tr><tr><td> 10% sodio desossicolato monoidrato (C 24 H 39 NaO 4 · H 2 O) </td><td> 10 ml a 100 ml dH 2 O </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> 1 M di cloruro di magnesio (MgCl 2) </td><td></td><td> RT </td></tr><tr><td> Ferrocianuro di potassio 100x (K 4 [Fe (CN) 6] · 3 H 6 O) </td><td> 2,12 g in 10 ml dH 2 O </td><td> RT al buio </td></tr><tr><td> Ferricianuro di potassio 100x (K 3 [Fe (CN) 6]) </td><td> 1,64 g in 10 ml dH 2 O </td><td> RT al buio </td></tr><tr><td> 20 mg / ml di X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside) </td><td> aggiungere 5 ml dimetil formammide per fare 20 mg / ml di soluzione </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> 10 mM (3 mg / ml) all-trans acido retinoico </td><td> Sciogliere 50 mg a 16,67 ml di etanolo assoluto. Preparare 1 ml aliquote. </td><td> -80 ° C al buio, in provette da 1,5 ml microcentrifuga ambra </td></tr><tr><td> papaina </td><td> sciogliere un flaconcino di 7 ml HBSS </td><td> 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tamponi e soluzione composizioni. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Lavorando Buffer / Soluzioni </td><td> componenti </td><td> Condizioni di archiviazione </td></tr><tr><td> F9 mezzo di coltura cellulare RARE-LacZ </td><td> 50 ml di siero fetale bovino (FBS) (concentrazione finale 10%) </td><td> Filtro-sterilizzare. </td></tr><tr><td></td><td> 5 ml 100x penicillina streptomicina (finale conc 1X) </td><td> Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td> 4ml 50 mg / ml di G418 (finale conc 0,4 mg / ml) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 500 ml DMEM / F-12 (con L-glutammina e HEPES) </td><td></td></tr><tr><td> 0,2% di gelatina </td><td> 25 ml 2,0% di gelatina </td><td> Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td> 80 ml di acqua distillata </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Mescolare bene </td><td></td></tr><tr><td> 70% di etanolo </td><td> 30 ml di etanolo 95% </td><td> Mettere in flacone spray. </td></tr><tr><td></td><td> 70 ml di acqua distillata </td><td> Conservare a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> medio di dissociazione neurosfere </td><td> 1 ml 20U papaina </td><td> preparare fresca ogni volta </td></tr><tr><td></td><td> 100 microlitri 13 mg / ml di tripsina </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100 microlitri 7 mg / ml di acido ialuronico </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 28 microlitri 10 mg / ml DNasiI </td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 ml 4mg / acido kinurenico ml </td><td></td></tr><tr><td> terreno di coltura neurosfere </td><td> DMEM / F-12 (con L-glutammina e HEPES) </td><td> preparare fresca ogni volta </td></tr><tr><td></td><td> 2% supplemento B-27 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 ml fattore ng / crescita dei fibroblasti (FGF) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20ng fattore di crescita epidermico (EGF) </td><td></td></tr><tr><td> 2,5% glutaraldeide </td><td> 250 microlitri 50% glutaraldeide </td><td> preparare fresca ogni volta </td></tr><tr><td></td><td> 4750 ml PBS 1x </td><td></td></tr><tr><td> soluzione di lavaggio LacZ </td><td> 0,5 ml 10% desossicolato (conc finale 0,1%) </td><td> Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td> 1,0 ml 100% NP-40 (finale conc 0,2%) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 50 ml di PBS 10X </td><td></td></tr><tr><td></td><td> acqua distillata a 500 ml </td><td></td></tr><tr><td> soluzione colorante X-gal </td><td> ferrocianuro di potassio 1x </td><td> preparare fresca ogni volta </td></tr><tr><td></td><td> ferricianuro di potassio 1x </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 mg / ml di X-gal </td><td></td></tr><tr><td></td><td> a volume appropriato utilizzando la soluzione di lavaggio LacZ </td><td></td></tr><tr><td> F9 RARE-LacZ medio congelamento </td><td> F9 cultura RARE-LacZ media + 5% DMSO </td><td> preparare fresca ogni volta </td></tr></tbody></table> Tabella 2. buffer di lavoro e la soluzione di composizioni.

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Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

Misurazione quantitativa dei livelli relativi dell&#39;acido retinoico nelle E8.5 embrioni e neurosfere Culture Utilizzando il F9 RARE-LacZ cellulare a base di Reporter Assay

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.8K Views.  Rutgers University. Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line. 

Video: Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

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Neuroscienze

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in glioblastoma mutliforme (GBM), is to identify and isolate tumor initiating cell population(s) to investigate their role in tumor formation, progression, and recurrence. Understanding tumor initiating cell populations will provide clues to finding effective therapeutic approaches for these tumors. The neurosphere assay (NSA) due to its simplicity and reproducibility has been used as the method of choice for isolation and propagation of many of this tumor cells. This protocol demonstrates the neurosphere culture method to isolate and expand stem-like cells in surgically resected human GBM tumor tissue. The procedures include an initial chemical digestion and mechanical dissociation of tumor tissue, and subsequently plating the resulting single cell suspension in NSA culture. After 7-10 days, primary neurospheres of 150-200 &mu;m in diameter can be observed and are ready for further passaging and expansion.

This video protocol demonstrates the isolation and expansion of stem like cells from surgically resected human glioblastoma mutliforme (GBM) tumor tissue using the neurosphere assay culture method.

Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La valutazione primaria neurogenesi in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

Eccitazione esterna dei neuroni Usando campi elettrici e magnetici in mono e culture bidimensionali

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript describes procedures that may be used to monitor &#947;-secretase-mediated cleavage of either APP-C99 or Notch, using a Gal4 promoter-driven firefly luciferase reporter system. These assays were established by stably co-transfecting HEK293 cells with the Gal4-driven luciferase reporter gene and either the Gal4/VP16-tagged C-terminal fragment of APP (APP-C99; CG cells), or the Gal4/VP16-tagged Notch-&#916;E (N&#916;E; NG cells). Using these reporter assays in parallel, we have demonstrated that an ErbB2 inhibitor, CL-387,785, can preferentially suppress &#947;-secretase cleavage of APP-C99 in CG cells, but not N&#916;E in NG cells. The differential responses exhibited by the CG and NG cells, when treated with CL-387,785, represent a preferred characteristic for &#947;-secretase modulators, and these responses are in stark contrast to the pan-inhibition of &#947;-secretase induced by DAPT. Our studies provide direct evidence that &#947;-secretase activities toward different substrates can be differentiated in a cellular context. These new assays may therefore be useful tools in drug discovery for improved AD therapies.

We have successfully generated two substrate-specific &#947;-secretase assays. Both cell-based assays presented here are designed to quantify &#947;-secretase enzymatic activities via the output of firefly luciferase reporters.

Misurazione quantitativa della proteina precursore dell'amiloide γ-secretasi-mediata e la fenditura di Notch in Cell-based Luciferase Reporter Assay piattaforme

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing neuronal dysfunction which eventually leads to cognitive decline. Hyperphosphorylated tau aggregates in the neuron are believed to cause most of the pathology associated with AD. These aggregates are assumed to be released into the extracellular compartment and taken up by adjacent healthy neurons where they induce further tau aggregation. This &#34;prion-like&#34; spreading can be interrupted by antibodies capable of binding and &#34;neutralizing&#34; extracellular tau aggregates as shown in preclinical mouse models of AD. One of the proposed mechanisms by which therapeutic antibodies reduce pathology is antibody-mediated uptake and clearance of pathological aggregated forms of tau by microglia. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess tau uptake by microglia. This assay uses the mouse microglial cell line BV-2, allows for high specificity, low variability and medium throughput. Data generated with this assay can contribute to a better characterization of anti-tau antibody effector functions.

Here we describe a cell-based assay to quantitatively assess tau uptake by microglia with the aim of creating an investigational tool to better characterize the mechanisms of action of anti-tau antibodies.

Cell-based test per studiare la Clearance di Tau anticorpo-mediato da Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

Misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...