Name: induction of acute skeletal muscle regeneration by cardiotoxin injection
Uploaded: 2017-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
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We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community's Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.

すべての実験は動物研究のための施設のガイドラインに厳密に従って行われ、動物実験に関する法律に従って公衆衛生、動物衛生、栄養と健康のイタリア省の食品安全省によって承認されました。頸椎脱臼手順はIACUCまたはそれと同等の要件に基づいて機関から機関に異なる場合があります。 前脛骨筋1.心臓毒注射<ol><li>手順を開始する前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中または水中で心臓毒原液を希釈することにより、心臓毒（CTX）の溶液を作業10μMのを準備します。 注：CTXを1mg / mLで水に可溶です。 70μMストック溶液を準備します。 -20℃で小分けし、店舗。 CTXは、このプロトコルのために使用される約7,000ダの分子量を有する心臓毒の混合物です。 注意：着用することが示唆されています二重手袋、衛生マスク、安全メガネは、希釈した場合でも、その溶液との接触を避けるために非常に注意する（あるいは安全メガネには、フードの下で作業することが推奨されます）。 </li><li>ケタミンおよびキシラジン（80 mgの/ kg及び10mgの体重の/ kg）または他の承認された利用可能な麻酔薬の腹腔内注射によってマウスを麻酔。 </li><li>マウス面を上にして、70％エタノールで後肢をスプレー。前脛骨（TA）筋の正確な場所を視覚化するために、メスの助けを借りて、膝の下で、下肢の前方部分に離れて髪を切ります。 注：TA筋が骨に横を下って行くと足首で終わる、脛骨の近位本体から生じます。その長い腱は、（ 図1A参照）足首全体の足の中に延びます。 </li><li>バックゆっくりプランジャーを引くことにより、シリンジへの溶液の〜100μLを描画します。 </li><li>直立シリンジを保持する、気泡を除去（針で上向き）。そっとプランジャーを引くと、チューブの内側部分に接続されているすべての気泡が上向きに来助けるために、注射器の側面をタップします。ゆっくりと、大きな気泡を解放するためにプランジャーを押してください。液体を数滴は、針を出てきます。この時点で、心臓毒の毒性を考慮すると、チューブに再び液体をピックアップし、それを分散しないようにしてください。 </li><li>所望の投与量に達するまで、注射器への溶液を撤回。各TA筋のためのCTX溶液20μLを注入します。 </li><li>膝に向かって腱から、ガイダンスとして脛骨骨の位置を追跡することによって、TAの中心に針を挿入します。 TAは薄い組織であるので、（2/3ミリメートルの深針、約10°〜20°の角度を挿入）深すぎる行かずに注射を行い、筋肉自体（ 図1A）を越えて行くことは避けてください。 </li><li>注射直後に針を引き出したが、2待ってはいけない - 漏れを防ぐために3秒CTXの年齢は筋肉から落下します。 </li><li>マウスは麻酔ので、覚醒され、使用されるエタノールは、体温を低下させるまでの手順の後、（37℃で）加熱されたプレート上にケージを配置します。 </li></ol> 2.前脛骨の分離注：筋肉は、実験の要件に応じて心臓毒注射後の異なる時点で単離することができます。 <ol><li>頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。 </li><li> 70％エタノールで後肢をスプレーします。手順の間、動物はそれを保持するために支持体に固定することができます。 </li><li> （足の上）近位腱のレベルで皮膚を切り取り、皮膚の下にはさみの刃の1を挿入して、膝の方向に、上向きに皮膚を切りました。鉗子の助けを借りて、皮膚を引き上げ、完全に筋肉を露出させます。慎重に関心領域から肌や髪のすべてを削除します。 </li><li>ゆっくりと（thとつまんまたは切断することにより、 筋膜を排除チップインピンセットやハサミを解剖細かいマイクロ付き）脛骨（ 図1B）の反対側の筋肉の極端な周囲。一度壊れて、そっと細い先端ピンセットの助けを借りて筋膜を除去します。根本的な筋肉の損傷を防ぎます。 注：他の筋肉および器官と同様に、TAは、 筋膜 （脚の深部筋膜）、深い皮膚の下にあり、それは容易に下にある筋肉を単離するために除去する必要がある結合組織の薄いシートで覆われています。 </li><li>遠位TAの腱と並置されている足、上記の伸筋Digitorum腱を視覚化します。伸筋Digitorum長い（EDL）筋肉の腱はわずかTA腱の下に位置しています。成体マウスの腱は、肉眼で見ることができます。 </li><li> 2次のいずれかの次のTA筋を削除します。 <ol><li>細かいマイクロはさみを解剖して、両方の腱をカットし、近位側に向かって、それらを引く、holdinグラム鉗子で腱。筋肉を分離するために反対方向に優しく、それらを引っ張って、2腱を分離します。 </li><li>薄チップピンセットの助けを借りて、腱自体（ 図1C、上の写真）の下にチップを渡すことによって、伸筋腱Digitorumから遠位TA腱を分離します。ゆっくり基礎となる筋肉（ 図1C、下の写真）からそれを分離するために、TA以下ピンセットをスライドさせます。 </li><li> 、わずかに隆起それを維持TAの腱を切断し、軽くひざ下の領域のみが装着されるまで、上向きにそれを引っ張って筋肉の下でピンセットを持ち（ 図1D、左画像）。はさみ（ 図1D、右の写真）と筋肉のエッジ以下、膝下TAをカットします。 注：筋肉を少し脇に取り付けられたままの場合、それを切り離す助けるためにはさみを解剖細かいマイクロを使用しています。 注：鉗子を簡単にTAの下に収まらない場合は、筋膜が完全に除去されていないことが可能であり、それはまだ、筋肉の上に見えるかもしれません。この場合、完全に進む前筋膜を除去します。 </li></ol></li></ol> 3.新鮮凍結筋肉テクニック<ol><li>トラガカントゴムまたはコルクのスライス上に同様の接着剤、凍結化合物（ 例えば、最適な切削温度（OCT）化合物）の少量を置きます。必要に応じて（ 図2A）、凍結前の逆側のコルクのスライスにラベルを付けます。 </li><li>筋肉の横断面を得るためには、コルクに対して垂直な位置にある筋肉を持って確認しながら、遠位腱を挿入し、外部の約3/4の筋肉のを残すことによって、トラガントガムにTAをシンク（ 図図2（a））。 </li><li>イソペンタンで、アルミ缶（あるいは、金属カップやガラスビーカー）を入力します。 LIQUIを含むデュワー内のイソペンタンの缶を一時停止D窒素は、液体窒素が缶に入力することができません。 注：イソペンタンは、組織の最適な凍結のために（-150から-160℃）適切な温度に到達する必要があります。いくつかの白色の固体粒子は、缶の底部に形成し、イソペンタンがわずかに粘性になったときに、正しい温度に到達します。 注：それは凍結アーチファクトにつながることができますように、固体粒子を形成する前にサンプルを凍結しないでください。それが解凍されるまで一方、イソペンタンが完全に固体になった場合、いくつかの白色粒子が依然として存在していることを確認して、室温でそれを残します。 </li><li> Mixterの鉗子を使用して、急速にイソペンタンに筋肉でコルクを浸し、下方に位置する筋肉を維持し、それが完全に液体に浸漬されたときにコルクを解放するようにしてください。試料が浮いている間このように、コルクの唯一の裏面には、液体中に表示されるはずです。 </li><li> SAを残します1分間のイソペンタンでmple。 </li><li> Mixter鉗子（または類似の鉗子）を使用して、筋肉を取ると、少なくとも2分間、液体窒素の中に浸します。 </li><li>格納-80℃のフリーザー直接標識アルミ箔で個別に試験片をラップし、直ちにドライアイス（-70℃）に配置し、または。 ステップ3.4から3.7に、手順では、正確な温度を維持し、解凍から標本を防ぐために非常に重要です：注意してください （ 例えば 、℃の冷凍庫に-80転送中。）。組織内に存在しており、最終的には人工物の形成または筋線維（繊維の中心にある大きな白い穴として組織切片上で視覚化）の故障の原因となり、水の微結晶の制御されない融解および再凍結中の温度上昇をもたらします。 </li></ol>冷凍筋肉の4クライオスタットセクショニング<ol><li>クライオスタットチャンバ温度tを設定しますO -20〜-22℃です。 </li><li>彼らは、少なくとも30分間平衡化することができ、試料のスタブ、ブレード、クライオスタットチャンバ内の試料を入れてください。 </li><li>試料スタブで凍結化合物（ 例えば、10月化合物）の少量を置き、凍結化合物が固化する前に、検体とコルクを浸します。一方、ブレードホルダーに刃を配置します。 </li><li>ブレードホルダー（ 図2B）で試料ホルダーを方向付けるために付属のネジを使用して試料とブレードの位置を合わせます。 </li><li> 10μmの切片厚を設定します。組織を切断するために進んでください。駆動輪の各ターンのために、試料ホルダーは、ブレードに向かって制御された距離を進みます。 </li><li>偏スライド（スライドあたり8〜10節）（ 図2C）のセクションを配置します。 </li><li>切片後、-80℃でスライドを保存します。 注：試料は、-80℃の冷凍庫に保存し、furtheに再利用することができます適切に処理し、保存されている場合はrを、切片。 </li></ol> 5.ルーチンの組織学的染色（ヘマトキシリン＆エオシン染色） 注：いくつかの組織学的染色は、分析によれば、筋肉切片上で実施することができます。形態学的および形態計測分析のためのルーチンの組織学的染色はヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）重クロム染色です。ヘマトキシリンは、深い紫色の核を染色します。核染色は、細胞質内の筋繊維のような好酸球の構造を、染色エオシン（ピンク/赤）、で対比されます。 <ol><li> 10のためのセクションで完全に空気乾燥冷凍スライド - 室温で15分間、染色トレイにスライドを申し立てる、および染色トラフにトレイを置きます。 </li><li>ヘマトキシリンで1分間染色します。 </li><li>ヘマトキシリンを洗い流すために10分間、かなり弱い水道水ジェットの下で染色トラフを置きます。 </li><li>エオシンのアルコール溶液が使用される場合（Tをスキップし、95％エタノール中で5分間、スライドを浸漬水性エオシン溶液の場合では、彼のステップ）。 </li><li>エオシン溶液で1分間対比染色。 </li><li>過度のエオシン液を除去するために水ですすいでください。 注：ヘマトキシリンまたはエオシンのいずれかで染色の最適なタイミングは、各新しいバッチのために定義されるべきです。 </li><li> 50％および70％（数秒ごと）：段階的エタノールシリーズでサンプルを脱水します。急速に100％エタノールで2変化、それぞれ5分、続いて95％エタノールに浸します。 </li><li>キシレンの2の変更、各5分以上でクリア。このステップは、化学フードの下で行わなければなりません。 </li><li>スライド上のメディアをマウントし、カバーガラスで覆い、数滴を適用し、キシレン系封入剤でスライドをマウントします。マウンティング培地はまた、カバーガラススライド上に置き、カバースリップを適用することができます。 <ol><li>スライドとカバーガラスの間に空気の泡を形成することは避けてください。 、気泡を除去する（実装後）縦スライドを維持し、過剰カ月を絞り出すために、優しく鈍鉗子（または類似の鈍ツール）でカバースリップ上で押してuntingメディアや気泡。 </li></ol></li><li>キシレンは、分析に進む前に、完全に蒸発させるために数時間または一晩フードの下のスライドを保管してください。 </li><li>マウスごとに少なくとも1つの全体の筋肉部分の非重複シリアル画像を用いて、H＆E染色された再生筋肉切片の形態学的および形態計測解析を実行します。 20X倍率で、明視野顕微鏡で画像をキャプチャします。 注：5匹のマウスの最小数は、測定値の統計的有意性を得ることが推奨されます。 注：画像解析ソフトウェアは、無料ダウンロードソフトウェアImageJのように、この目的のために利用可能である（http://imagej.nih.gov/ij/）。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここでは、骨格筋（ すなわち、CTXの筋肉注射）での急性損傷を誘導するためのプロトコルを記述します。これは、 インビボでの骨格筋再生のダイナミクスを研究するための強力なツールとして広く用いられています。 CTX注入は筋細胞膜の脱分極および繊維12の収縮によって引き起こされる筋線維の変性を誘導し、筋肉の再生につながる事象のカスケードを誘発します。...

哺乳類の成体の骨格筋が収縮するために特化して多核筋細胞（筋線維）のfasciculesのグループによって形成されています。各筋線維は、筋細胞膜（原形質膜）に囲まれた、細長い合胞体であり、定期的に繰り返し編成収縮タンパク質（アクチンとミオシンフィラメント）で構成されている筋原繊維を含みます。大人の生活の中で、および休止状態で、骨格筋は、彼らの筋核1の非常に低い離職率を持っています。確かに、筋線維の周囲に位置している筋核は、筋細胞膜の下で、細胞周期のG0期で停止し、1,2を増殖することはできませんされています。 骨格筋は、互いに緊密に関連している組織リモデリングのいくつかのイベントの後ホメオスタシスに達し、次のダメージを再生する独特の能力を有します。急性損傷または外傷後、変性は、誘導される再生過程が続きますすなわち、筋細胞、衛星細胞（SCS）の居住集団を含む異なる細胞集団を含みます。実際、任意の環境刺激の非存在下では、衛星細胞は静止状態にあり、筋細胞膜と基底板3,4の間に特殊なニッチに位置しています。怪我や病気に続いて、SCが、活性化、増殖、損傷領域に移行し、最終的に分化し、新たに筋線維5を形成を生じます。活性化のSCは、異なる細胞集団で外傷6-8のサイトで募集されている主に炎症細胞を、クロストークを確立します。このクロストークは、細胞が分子シグナルが最終的ホメオスタシス9につながる、構造的修飾を駆動することによって調整されたパラダイムに従うことができます。 SC、炎症および間質細胞、血管形成過程、および再神経支配のイベントの他にも、この高度に組織とsを修復するために協調的に作用し、関与していますpecialized構造。 筋肉の生理学を理解するだけでなく、プロセス全体のより深い知識を必要とする治療戦略を改善するだけでなく、骨格筋再生のさまざまな側面を研究することに大きな関心があります。いくつかの実験的アプローチは、現在、異なる細胞集団、シグナル伝達経路、および関与する分子メカニズムのアイデンティティと機能を研究するために利用可能です。急性の傷害のマウスモデルは、このプロセスの多くの側面を研究するための強力なツールを表します。研究者は非常に早い段階からプロセスの最後に、 インビボでの再生プロセスに従うことができるように、急性筋損傷を誘発する別の一般的に使用される技術。このプロトコルは、筋変性を誘導し、組織サンプルの分析まで、再生処理をトリガするヘビ毒由来の心臓毒（CTX）の筋肉内注射からの手順を説明します。 CTXの注射後、MICEは、実験の要件に応じて異なる時点で犠牲にすることができ、骨格筋を解剖し、さらなる分析のために処理することができます。最後に、我々は、形態学的観察結果と基本的な定量分析を行うための組織切片の染色プロトコルを記述する。このプロトコルは、非常に再現性のある方法10のin vivoでの急性骨格筋再生の研究を可能にします。

<table><tbody><tr><td>Cardiotoxin from&amp;nbsp;&lt;em&gt;Naja mossambica mossambica&lt;/em&gt;</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C9759</td><td></td></tr><tr><td>Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth Gum</td><td>MP BIOMEDICALS,LLC</td><td>104792</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane (Isopentane)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>78-78-4.</td><td></td></tr><tr><td>OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat</td><td>Bio-optica</td><td>&amp;nbsp;05-9801</td><td></td></tr><tr><td>Feather Microtome Blade S35</td><td>Bio-optica</td><td>&amp;nbsp;01-S35</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide Superfrost Plus</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>09-OPLUS</td><td></td></tr><tr><td>Dumon #5 Mirror Finish Forceps&amp;nbsp;</td><td>2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td><td>11251-23</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Straight Sharp/Sharp</td><td>2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Noyes Straight</td><td>2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm</td><td>2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Bio-optica</td><td>09-00100</td><td></td></tr><tr><td>Slide Coverslip</td><td>BIOSIGMA</td><td>VBS651</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>sigma-Aldrich</td><td>02860-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline</td><td>J.T. BAKER</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>LEICA</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr></tbody></table>

induction of acute skeletal muscle regeneration by cardiotoxin injection

骨格筋再生は、損傷または疾患に応じて、成人骨格筋に発生する生理学的プロセスです。急性損傷誘導骨格筋再生は筋肉の再生に関与するイベントだけでなく、メカニズムと異なる選手を研究するために広く使用されている、強力なモデル系です。実際には、このプロセスの詳細な知識は、骨格筋の変性につながる病的状態をより良く理解するために不可欠であり、それは新たな標的治療戦略を同定するのに役立ちます。本研究は、心臓毒の単回筋肉内注射（CTX）を介して、マウスにおける急性骨格筋再生を誘導するための詳細と再現性のプロトコルについて説明します。 CTXは、ヘビ毒毒素のファミリーに属し、最終的には再生イベントをトリガ筋線維の筋変性を引き起こします。骨格筋再生のダイナミクスは、筋肉切片の組織学的分析によって評価されます。また、プロトコル、解剖凍結、および前脛骨筋だけでなく、広くその後の形態学的および形態計測分析のために使用されるルーチンのヘマトキシリン＆エオシン染色を切断するための実験手順を示しています。

H＆E染色は、骨格筋の再生中に特定の時点で再生プロセスの形態の評価が可能になります。 図3は 、野生型マウスの負傷したTA筋肉に行っ時間経過解析を示します。 図3Aに図式として筋肉は、CTXの注射後3、7、15、30日目に単離されています。 H＆E染色した横断面の代表的な写真が（ 図3B-E）は、時間の経過骨格筋修復のダイナミク...

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Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

induction-acute-skeletal-muscle-regeneration-cardiotoxin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.9K ビュー.  Institute of Genetics and Biophysics "A. Buzzati Traverso", CNR. この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。 

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A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional capacity. Transcutaneous surface stimulation of skeletal muscle involves a current flow between a cathode and an anode, thereby inducing excitement of the motor unit and the surrounding muscle fibers. 
NMES is an attractive modality to evaluate skeletal muscle adaptive responses for several reasons. First, it provides a reproducible experimental model in which physiological adaptations, such as myofiber hypertophy and muscle strengthening6, angiogenesis7-9, growth factor secretion9-11, and muscle precursor cell activation12 are well documented. Such physiological responses may be carefully titrated using different parameters of stimulation (for Cochrane review, see 13). In addition, NMES recruits motor units non-selectively, and in a spatially fixed and temporally synchronous manner14, offering the advantage of exerting a treatment effect on all fibers, regardless of fiber type. Although there are specified contraindications to NMES in clinical populations, including peripheral venous disorders or malignancy, for example, NMES is safe and feasible, even for those who are ill and/or bedridden and for populations in which rigorous exercise may be challenging. 
Here, we demonstrate the protocol for adapting commercially available electrodes and performing a NMES protocol using a murine model. This animal model has the advantage of utilizing a clinically available device and providing instant feedback regarding positioning of the electrode to elicit the desired muscle contractile effect. For the purpose of this manuscript, we will describe the protocol for muscle stimulation of the anterior compartment muscles of a mouse hindlimb.

A murine model of neuromuscular electrical stimulation (NMES), a safe and inexpensive clinical modality, to the anterior compartment muscles is described. This model has the advantage of modifying a readily available clinical device for the purpose of eliciting targeted and specific muscle contractions in mice.

神経筋電気刺激による筋力トレーニングのマウスモデル

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional ...

医学

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

生物工学

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

カーディオトキシン損傷による骨格筋再生中の衛星細胞機能の解析と生体内での自己送出型siRNAの注射

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

遺伝学

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

発生生物学

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

変更されたベルイストローム法を用いたヒト骨格筋生検手順

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new muscle fibers under the right conditions. Although SCs can be harvested from muscle tissue and cultured in vitro, the resulting myoblast cells are not very effective in promoting myogenesis when transplanted into host muscle. Surgically exposing the host muscle and grafting segments of donor muscle tissue, or the isolated muscle fibers with their SCs onto host muscle, promotes better myogenesis compared to myoblast transplantation. We have developed a novel technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME). MIME involves passing a surgical needle through the host muscle, drawing a piece of donor muscle tissue through the needle track, and then leaving the donor tissue embedded in the host muscle so that it may act as a source of SCs for the host muscle. Here we describe in detail the steps involved in performing MIME in an immunodeficient mouse model that expresses a green fluorescent protein (GFP) in all of its cells. Immunodeficiency in the host mouse reduces the risk of immune rejection of the donor tissue, and GFP expression enables easy identification of the host muscle fibers (GFP+) and donor-cell-derived muscle fibers (GFP-). Our pilot data suggest that MIME can be used to implant an extensor digitorum longus (EDL) muscle from a donor mouse into the tibialis anterior (TA) muscle of a host mouse. Our data also suggest that when a myotoxin (barium chloride, BaCl2) is injected into the host muscle after MIME, there is evidence of donor-cell-derived myogenesis in the host muscle, with approximately 5%, 26%, 26% and 43% of the fibers in a single host TA muscle showing no host contribution, minimal host contribution, moderate host contribution, and maximal host contribution, respectively.

Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

We describe a novel experimental technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME), which is based on the evidence that skeletal muscle tissue contains viable myogenic cells that can facilitate donor-cell-mediated myogenesis when implanted into a host muscle.

低侵襲の筋肉 (MIME) の埋め込み - ドナー細胞の筋を容易にする新しい実験手法

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

生物学

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

ラットモデルの筋肉損傷を治療するためのDingのロール操作に基づくマッサージャー

Mimicking Ding's Roll Method on Notexin-Induced Muscle Injury in Rats

Ding's roll method is one of the most commonly used manipulations in traditional Chinese massage (Tuina) clinics and one of the most influential contemporary Tuina manipulations in China. It is based on the traditional rolling method commonly used in the one finger Zen genre and named Ding's roll method. Due to its anti-inflammatory and blood circulation-promoting effects, Ding's rolling method has sound therapeutic effects on myopathy. Because of the large area of force applied to human skin, Ding's roll method is challenging to perform on experimental animals with small skin areas, such as rats and rabbits. Additionally, the strength of Tuina applied to the human body differs from that applied to experimental animals, so it may happen that the strength is too high or too low to achieve the therapeutic effect of Tuina during the experiment. This experiment aims to create a simple massager suitable for rats based on Ding's rolling manipulation parameters (strength, frequency, Tuina duration). The device can standardize manipulation in animal experiments and reduce the variation in Tuina force applied to different animals due to subjective factors. A rat model of notexin-induced skeletal muscle injury was established, and plasma injury markers creatine kinase (CK) and fatty acid binding protein 3 (FABP3) were used to assess the therapeutic effect of Tuina on skeletal muscle injury. The results showed that this Tuina massager could reduce the levels of CK and FABP3 expression and slow down the degree of skeletal muscle injury. Therefore, the Tuina massager described here, mimicking Ding's roll method, contributes to standardizing Tuina manipulation in experimental research and is of great help for subsequent research on the molecular mechanism of Tuina for myopathy.

著者スポットライト:自作マッサージャーを使用したラットのTuinaマッサージの実施 

This protocol describes a simple device that mimics Ding's roll method, establishes a rat model of skeletal muscle injury, and uses hematoxylin-eosin staining to observe the pathology of damaged tissue and enzyme-linked immunosorbent assay to detect changes in serum damage markers.