Name: in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells
Uploaded: 2017-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
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この研究は、NIAMS AR064873、Epigen Project PBによって支持された。 P01.001.019 / Progetto BandieraエピゲノムIFTからLL

マウスを標準動物施設手順に従って飼育し、維持した。すべての実験プロトコールは、動物福祉保証およびイタリア動物保健省の動物実験倫理委員会によって承認され、NIHのケアおよび使用ガイド実験動物。 1.オートファジーフラックスの筋肉傷害およびインビボブロック<ol><li> 筋肉傷害。 <ol><li>急性骨格筋傷害を誘発するために、約20gの重さの2ヶ月齢のC57BL / 6Jマウスの左脛骨前（TA）筋肉に10μMのカルジオトキシン（CTX）ストック20μLを直接注入する。同数の男性と女性を使用してください。摂動していない対側肢を対照として用いる。 注：0.9％塩化ナトリウム溶液中の10μMCTXはろ過し（0.22μmPVDFフィルター）、-20℃で保存する必要があります。凍結融解サイクルを繰り返さないでください。 </li><li>私は30Gの針を備えたnsulinシリンジ、TAの中央にCTXを注射する。 TAの正確な損傷を誘発するために、注射器の針が筋肉の底部から上部まで5mmの遠位腱の近くに入るようにします（ 図1A ）。 </li></ol></li><li> 摂動していないマウスおよび傷害を受けたマウスにおける自食流の遮断。 <ol><li> 24時間後の傷害（pI）、腹腔内（IP）注射（ 図1B ）により24時間毎に50mg / kgクロロキン（CLQ）を4日間投与する。 <ol><li> CLQ（10mg / mL）をPBS 1Xに溶かし、0.2μm膜を通してそれをろ過する。すべてのマウスの体重を測定し、注入するCLQの量を計算します。 注：同じ日にCLQソリューションを準備して使用してください。 CLQストックは、-20℃で最大1ヶ月保存することができます。オートファジーは代謝関連のプロセスであるため、常にCLQ治療を常に同時に実行します（ つまり 、朝のbefo午前10時）。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.筋肉組織セクション<ol><li> マウスの犠牲。 <ol><li>損傷の5日後にマウスを安楽死させる。 </li><li>頸椎脱臼またはCO 2による安楽死を行う（確認のために頸椎脱臼を行う）。オートファジープロセスはマウスの睡眠/食習慣に関連するので、常に、好ましくは朝（ すなわち午前10時前）にマウスを犠牲にする。 </li></ol></li><li> TA分離および包含。 <ol><li>解剖の前に、マウスに70％エタノールを噴霧する。 </li><li>はさみを使用すると、腰のレベルでマウスの背部皮膚に小さな、垂直の切開（長さ3mm）を作る。皮膚の除去を簡素化するために尾と足を切断します。皮膚を尾に向かって引っ張り、それを取り除いて下にある筋肉を露出させる; 図2Aに示すように、TA筋肉は局在化するのが容易である</強い&gt;。 </li><li> 2つの鉗子の助けを借りて、遠位腱をつかむ。 </li><li>遠位腱を切断する。 TAとextensor digitorium longus（EDL）腱はしばしば一緒に切断され、後に分離される（2.2.6参照）。 </li><li>鉗子を使用して、腱によるTA筋肉を保持し、筋肉を近位端（膝の近く; 図2B ）に向かって慎重に引き上げる。 注：この時点で、EDLおよびTA筋肉は容易に認識され、TAはEDLより大きく、より表面的である。 </li><li> 2つの遠位腱を反対方向に引くことによって、TAをEDL筋肉から分離する（ 図2C ）。 </li><li>近位の腱を切断する。 </li><li>鉗子を使用して、組織を損傷することなく、筋肉を覆う薄い筋膜を除去する。 </li><li>ペーパータオルの助けを借りてサンプルの過剰な水分を除去してください。筋肉が濡れていなくても過度に乾燥していないことを確認してください。筋肉に大きなダメージを与え、次の染色を危険にさらします。 </li><li>最適切断温度（OCT）化合物を金型の底に置き、 図2Dに示す向きでその中に筋肉を入れます。 100％イソペンタンを約3〜4cmの深さに達するまでビーカーに加える。ビーカーをポリスチレンボックス内の液体窒素と接触させる。 </li><li>液体窒素がビーカーに入るのを避けてください。発泡泡が生成され、これが筋肉の切片に含まれて損傷することがあります。 </li><li>イソペンタンを観察し、適切な温度（-140℃〜-150℃）に達するまで待つ。適切な温度で、凍結イソペンタンの固体白色層がビーカーの底部で結晶化する。 </li><li>イソペンタンが完全に凍っている場合は、融解して凍結温度まで冷やしてから次のステップに進みます。 </li><li> prechilled鉗子を使用して、微妙に金型を下げるイソペンタンは約20〜30秒間保持する。冷凍サンプルを-80℃冷凍庫に移すまでドライアイスを入れた容器に入れます。 注記：ここではプロトコルを一時停止することができます。 </li></ol></li><li> 筋肉組織の凍結切片。 <ol><li> -80℃で少なくとも1夜後、凍結切片作製を行う。 </li><li>クライオスタットナイフとアンチロールプレートを-20℃の冷凍庫から取り出し、それぞれのサポートにクライオスタットキャビネットに入れます。 </li><li> 図2Dに視覚化されているように、サンプルスタブ上にOCTを滴下し、凍結サンプルを垂直NS方向に置く。 </li><li>サンプルスタブをチャック上に置きます。 </li><li>アンチロールプレートをナイフに引っ張らずに、筋肉を含まないOCTを取り除くために、40μmのカットをいくつか行います。筋肉が見えるようになったら、スライスの厚さを7〜8μmに減らします。 </li><li>アンチロールプレートを下になるまで下に引きますナイフの端またはそれより少し上にある。 </li><li>横断切片を7〜8μmの厚さに切断し、組織学的スライド当たり3〜4枚のスライスを取り付ける。 注：クライオスタットの推奨温度は-15℃〜-23℃です。衛星のニッチ位置で筋幹細胞を特定するために、その後の分析にはサンプルの断面が必要です。 </li><li>切片の接着性を最大にするために、スライドを室温で10〜15分間保ち、抗体インキュベーション中にそれらの分離を防ぐ。 注：空気乾燥工程は免疫染色に影響を与え、あいまいな結果をもたらす可能性があります。スライドは、-80℃で数ヶ月間固定しないで保存することができます。ここでプロトコルを一時停止することができます。 </li></ol></li><li> ヘマトキシリン・エオシン（H＆E）染色を行うことにより、TA筋肉の凍結切片における筋肉損傷をチェックする。 <ol><li>筋肉の質（ すなわち 、傷害、筋肉の隔離および包含の有効性）を評価するためにイオン、および凍結切片）を用いて、H＆E染色を行う。すべての実験時点について、スライドを4％PFAで10分間固定する。固定後、1x PBSのいくつかの変更でスライドをよく洗う。 注意：注意してください。 PFAは発癌物質であり、注意深く取り扱わなければならない。 </li><li>実験のポイントごとに1つのスライドを取り、染色瓶に入れます。 </li><li>瓶に9g / Lのヘマトキシリンを充填し、切片を覆い、8分間インキュベートする。 </li><li>ヘマトキシリンをリサイクルする。 </li><li>瓶を流水中に10分間放置して、過剰のヘマトキシリンを除去する。 注：セクションに水を直接流さないように注意してください。 </li><li>滅菌水で洗浄する。 </li><li>酸性化90％エタノール中で0.5％（w / v）のエオシンで1分間切片をインキュベートする。 </li><li>エオシンをリサイクルしてください。 </li><li> 3分間滅菌水で2回洗浄する。 注記：ケミカルフードで以下の手順を実行してください。 </li><li>切片を70％エタノールで洗浄する。 </li><li>ウォッシュ90％のエタノールを含むセクション。 </li><li> 100％エタノールで切片を洗浄する。 </li><li>切片を0.879g / mLのo-キシレンでインキュベートする。 注意：注意してください。 o-キシレンは引火性があり、適度に有毒である。手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を着用し、化学フードの下で操作してください。 </li><li> o-キシレンをリサイクルしてください。 </li><li>スライドを紙の上に置き、乾燥させます。 </li><li>クイック・ハード・キシレン・ベースのマウント・メディアを使用してスライドを閉じます。 </li><li>光学顕微鏡下で10倍の倍率で断面の品質を確認する（ 図3参照） 注記：ここではプロトコルを一時停止することができます。 </li></ol></li></ol> 3.損傷した筋肉組織切片におけるLC3およびMyoDの免疫染色<ol><li> 筋肉組織切片の固定。 <ol><li> 1枚の紙を濡らし、それを密閉可能なプラスチック製の箱の底に置くことによってインキュベーションチャンバーを準備し、高レベルを維持するチャンバー内の湿度は非常に高い。 10分間1×PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で組織切片を固定する。 注：湿った紙を使用してサンプルを乾燥させないようにします。新鮮なPFAを調製するか、-20℃で保存したPFAを使用してください。あぶない。 PFAは有毒である。原液を作る際に粉末を注意して取り扱わなければならない。この作業は、手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を備えた化学フードで実施する必要があります。また、溶液中でPFAを注意深く操作する必要があります。 </li><li> PFAを除去し、セクションを1×PBSで5〜7分間洗浄する。この手順を3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 筋組織切片の透過化。 <ol><li>パップペンを用いて組織切片の周りに疎水性障壁を描く。 注：このステップは、組織切片の周りの表面を規定し、ステップ3.4,3.6,3.7および3.9に記載される抗体の量を最小にする。 </li><li>切片を200μLの冷（-20℃）メタノールで洗浄し、インキュベーションチャンバーをフリーザー内で水平に-20℃で5分間置く。 </li><li>冷凍庫からインキュベーションチャンバーを取り出し、メタノールを吸引し、RTで5-7分間1X PBSで切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> ブロッキング <ol><li> PBS 1x中の4％ウシ血清アルブミン（BSA）の新しいブロック溶液を調製する。 注：BSA溶液は4℃で1週間保存することができます。 </li><li>切片をブロック溶液で少なくとも60分間RTでインキュベートする。 </li><li>ブロッキング溶液を除去する。 </li><li> 1×PBS中20μg/ mLの抗Fabを希釈することにより100μLの抗Fab混合物を調製する。切片を、抗マウスIgGの非結合親和性精製F（ab）断片と室温で1時間インキュベートする。 </li></ol></li><li> 一次抗体インキュベーション。 <ol><li> 1倍PBS中の4％BSAにLC3およびMyoD抗体を溶解することにより、各スライドの100μLの一次抗体混合物を調製する。 5μg/mLの抗LC3（ウサギポリクローナル抗体）および10mg / Lの抗MyoD（マウスモノクローナル抗体）を添加した。一次抗体混合物を4℃で一晩インキュベートする。 </li></ol></li><li> 洗濯。 <ol><li>一次抗体混合物を除去する。 </li><li> 10分間1X PBS中1％BSAで切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 二次抗体インキュベーション。 <ol><li>各スライドの二次抗体ミックスを100μL調製します。 1x PBS中の4％BSA中でヤギ抗ウサギ488（5μg/ mL）およびヤギ抗マウス594（5μg/ mL）を溶解する。 注：蛍光色素の漂白を防ぐために、光に過度の暴露を与えないでください。暗い場所で以下の手順を実行します。 </li><li>セクションを二次抗体ミックスとRTで45分間インキュベートする。 </li><li>二次抗体混合物を除去し、1×PBSで5〜7分間切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 一次抗体インキュベーション。 <ol><li>薄層スライド1つにつき100μLの混合物を用いて、1×PBS中の4％BSA中のn-2（α-2鎖）モノクローナル抗体（0.33μg/ mL）一次抗体ミックス中の切片をRTで1〜2時間インキュベートする。 </li></ol></li><li> 洗濯。 <ol><li>一次抗体混合物を除去する。 </li><li> 10分間1X PBS中1％BSAで切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 二次抗体インキュベーション。 <ol><li> 1X PBS中の4％BSA中のヤギ抗ラット647（5μg/ mL）を希釈することにより、各スライドの二次抗体混合物100μLを調製する。二次抗体ミックス中の切片をRTで45分間インキュベートする。 </li><li>二次抗体混合物を除去し、1×PBSで5〜7分間切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）インキュベーション。 <ol><li>各スライドに1x PBS中の300nM DAPI溶液200μLを加える。 RTで5分間インキュベートする。 4℃でDAPI溶液をダーク。 </li><li>セクションを1×PBSで5〜7分間洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 染色された筋肉部分を取り付ける。 <ol><li>セクションから余分な洗浄液を除去する。 </li><li>スライドの真ん中に染色されたセクションに1×PBS（3：1）にグリセロール10μLを置き、気泡の形成を避けて、カバースリップを加える。 </li></ol></li></ol> 4.共焦点顕微鏡の取得<ol><li>画像キャプチャシステムと分析ソフトウェアを統合した4レーザー共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。 注：MyoDは、594nmレーザー（励起：590nm、発光：617nm）に理想的に適した励起を有する、明るい赤色蛍光色素である594色素とコンジュゲートされる。 LC3は、488nmのレーザーライン（励起：495nm、発光：519nm）に理想的に適した励起を伴って、明るい緑色蛍光色素である488色素と結合している。ラミニンは、647色素とコンジュゲートされており、647nmレーザーライン（励起：650nm、発光：668nm）に理想的に適した、明るい遠赤色蛍光染料である。 </li><li>スライドを顕微鏡トレイに置き、核信号を検出するために63倍の倍率を使用します。筋肉の形態に依存して、能動的再生のフィールドを中心にして手動で再生領域に焦点を当てます（ 図4参照）。 注：摂動していない筋肉では、筋繊維のサイズは事実上一定です（ 図4A ）。損傷後の筋肉再生は、再生後に新たに形成された繊維である、より小さな筋繊維の出現によって認識することができます。さらに、能動的再生における筋肉は、マクロファージ、線維脂肪生成前駆体、および損傷した筋肉に局在化して筋再生を調整する細胞（ 図4B ）からなる広範な浸潤物を特徴とする。 </li><li>再生中の免疫蛍光染色を評価するmyofibersの基底板の下に位置するMuSCに焦点を当てることにより、非侵襲性領域を検出する。 </li><li> MyoD染色に陽性であり、ラミニン染色で標識された筋線維内に位置するMuSCに焦点を当てる（ 図4B 、白矢印参照）。 </li><li>少なくとも3匹のマウス/実験群を使用し、各実験群について少なくとも7欄の63倍の拡大像を得るために顕微鏡を使用する。 </li><li> 再生領域が同定されたら、DAPI染色を用いて焦点を合わせ、他の単一チャネルを調整する。 <ol><li>以下の顕微鏡設定を使用してください。チャンネルA594ピンホール1.2エアリーユニット、ゲイン791;チャネルA488ピンホール1.6エアリーユニット、ゲイン659;チャンネルA647ピンホール1.4エアリーユニット、ゲイン719。 </li></ol></li><li>単一チャンネルの焦点を調整した後、1,024×1,024のフレームサイズと12.61μsのピクセルドウェルで画像を取得します。 </li><li> MyoD陽性細胞のパーセンテージをカウントする（tLC3陰性であるMyoD陽性細胞のパーセンテージをLC3シグナルと比較して示す図である。 注：LC3染色を示すMyoD陽性細胞のパーセンテージは、このプロトコールの読み取り値です。 </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+therapeutic+effect+of+simvastatin+revealed+by+functional+improvement+in+muscular+dystrophy.">A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).</li><li>Fiacco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+regulates+satellite+cell+ability+to+regenerate+normal+and+dystrophic+muscles.">Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles.</a> Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).</li><li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+NAD-dependent+deacetylase+Sirt1+in+the+regulation+of+autophagy.">A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).</li><li>Rubinsztein, D. C., Mari&#241;o, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging.">Autophagy and aging.</a> Cell. 146 (5), 682-695 (2011).</li><li>Colman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+delays+disease+onset+and+mortality+in+rhesus+monkeys.">Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys.</a> Science. 325 (5937), 201-204 (2009).</li><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132 (1), 27-42 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Calorie+Restriction+Enhances+Cellular+Quality-Control+Processes+in+Human+Skeletal+Muscle.">Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).</li><li>Wenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+muscle+PGC-1alpha+expression+protects+from+sarcopenia+and+metabolic+disease+during+aging.">Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).</li><li>Carnio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Impairment+in+Muscle+Induces+Neuromuscular+Junction+Degeneration+and+Precocious+Aging.">Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging.</a> Cell Rep. , (2014).</li><li>Sandri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misregulation+of+autophagy+and+protein+degradation+systems+in+myopathies+and+muscular+dystrophies.">Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).</li><li>Cerletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+calorie+restriction+enhances+skeletal+muscle+stem+cell+function.">Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).</li><li>Gopinath, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3+promotes+quiescence+in+adult+muscle+stem+cells+during+the+process+of+self-renewal.">FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).</li><li>Tang, A. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+supports+the+bioenergetic+demands+of+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation.</a> EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).</li><li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+maintains+stemness+by+preventing+senescence.">Autophagy maintains stemness by preventing senescence.</a> Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li></ol>

著者は何も開示していない

<html>このプロトコールは、代償性筋再生中に骨格筋幹細胞におけるオートファジーをモニターする方法を記載する。 LC3とMyoDの同時染色のためのいくつかの抗体が試され、マウス組織切片で働き、成功した結果を創り出す抗体がここに掲載されています（ 材料表を参照）。メタノールによる透過処理（ステップ3.2.2参照）は、染色を成功させるために強く推奨されます。 <p clas...

骨格筋再生は、成体幹細胞（Muscle Satellite Cells、MuSCs）と再生過程に関与する他の細胞型との相互作用の結果である。筋肉の恒常性および機能性は、筋肉のニッチおよび全身的な手掛かり1,2から生じる信号を組み合わせることによって維持される。生涯にわたって、MuSC機能、筋肉のニッチ、および全身手がかりの変化が報告され、高齢者の機能的能力の低下3につながる。 MuSCは基底板の下のニッチに設置され、筋肉傷害時に損傷筋肉を修復するために活性化される4,5 。生産的な再生応答を確実にするためには、MuSCが静止からの退出、自己再生、および増殖の拡大段階に必要な異なるプロセスを調整することが重要である筋原性分化6 。高齢者および筋肉慢性疾患では、これらの機能が全て損なわれ、筋機能が変化する（2,3,6,7,8,9,10,11,12,13）。 マクロオートファジー（以下、オートファジーと呼ぶ）は、組織恒常性を維持するために不可欠な重要な生物学的プロセスとして浮上している14 。自食プロセスは、細胞質、細胞小器官、およびタンパク質の一部が最終的にリソソーム経路を介して分解されて小胞に包み込まれ、毒性分子の除去およびマクロモールのリサイクルを促進する輸送メカニズムを包含するcules。これは、ストレスまたは他の悪条件の下での細胞および組織の適応を支援するためのエネルギー豊富な化合物を提供する15,16 。オートファジーは、その細胞生存活性と共に、細胞組織の状況（ 例えば、正常組織と癌組織）およびストレス刺激のタイプに依存して、細胞死誘導因子として働くことができる17,18 。 最近の証拠によれば、オートファジーは筋肉量および筋線維の完全性を維持するために必要とされる19,20 、 Duchenne筋ジストロフィー（DMD）を含む異なる筋ジストロフィー21,22,23で障害されることが報告されている24,25,26,27 </su同様に、筋肉量の喪失（サルコペニアと呼ばれる）後の高齢者31,32,33,34,35において、自食作用の進行性低下が観察されている32,33,34（p&gt; 、 28,29,30）。 、 35,36,37 、筋電図の生存38 。 オートファジーと骨格筋の再生能力との密接な関係は、カロリー制限がMuSCの利用可能性と活性を高めることを示したWagers研究所の研究によって予想された39 。これはいいえFoxo3-Notch軸が自己再生中に自食作用過程を活性化し、MuSCが静止状態から増殖状態に移行するという最近の観察によってさらに支持された41 。これらのデータは、老化中のMuSCの数値的および機能的低下に関連して、若年から老齢および老人性のMuSCからの基礎的な自食作用の進行的な減少と一致する42 。 最近の論文では、DMDの進行の初期段階を区別する自食作用と代償性筋再生との間に密接な関係があることを示した。従って、我々は、筋肉の再生が損なわれ、線維性組織沈着が起こる、疾患の進行の後期段階で減少した自食作用の流出を観察した。興味深いことに、我々は、再生条件において、オートファジーがMuSCにおいて活性化され、オートファジープロセスを調節することがMuSC活性化およびfuに影響を及ぼすことを示した法律30 。 まとめると、これらのデータは、正常および病理学的状態および生涯にわたる筋肉再生中のMuSCにおける自食作用プロセスを探索する緊急性を強調している。ここでは、オートファジー43のマーカーである微小管関連タンパク質1A / 1B軽鎖3（LC3）およびMyoDマーカーのin situ免疫染色を行うことにより、筋再生状態におけるMuSCにおける自食作用プロセスをモニターするためのプロトコルを提供する。筋原性系統、対照および損傷マウス由来の筋肉組織切片中に存在する。報告された方法論は、1つの特定の細胞コンパートメント、筋再生を調整する上で重要な役割を果たすMuSCにおける自食作用プロセスをモニターすることを可能にする。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>WT mice</td></tr><tr><td>Cardiotoxin 1</td><td>Latoxan</td><td>L8102</td><td></td></tr><tr><td>Millex-VV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td>Syringe Filter Unit, 0.1 &amp;micro;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>Caution:&lt;br/&gt; Harmful if swallowed</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine + 0.5 mL</td><td>BD</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Intermediate</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS32</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution, alcoholic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>o-Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1040</td><td>Caution:&lt;br/&gt; Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Caution:&lt;br/&gt; Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer</td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt - Quick-hardening mounting medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>LC3B Antibody</td><td>Cell signaling Technology</td><td>2775</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-MyoD&lt;br/&gt; (concentrated) clone 5.8A</td><td>DAKO - Agilent Pathology Solutions</td><td>M3512</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-2 (&amp;alpha;-2-chain) monoclonal antibody</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>4H8-2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21248</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells

組織ホメオスタシスを保存するための重要な調節プロセスとして、自食作用が指摘されています。オートファジーは骨格筋の発達と再生に関与していることが知られており、オートファジー過程はいくつかの筋肉病変および加齢に関連する筋肉疾患に記載されている。筋修復中の衛星細胞の機能的枯渇と相関する、最近記載された自食プロセスのブロックは、能動的な自食作用が生産的な筋再生と結びついているという考えを支持する。これらのデータは、筋ジストロフィーのような正常および病的状態の両方における筋肉再生中の衛星細胞活性化におけるオートファジーの重要な役割を明らかにする。ここでは、筋肉再生条件下での成体筋幹細胞（MuSC）コンパートメントにおける自食作用プロセスをモニターするためのプロトコールを提供する。このプロトコールは、LC3のインサイチュ免疫蛍光イメージングを行うためのセットアップ方法論を説明している。対照マウスおよび損傷マウスからの筋肉組織切片中の筋原性マーカーであるMyoDとの間の相互作用を示す。報告された方法論は、1つの特定の細胞コンパートメント、筋肉再生を調整する中心的な役割を果たすMuSCコンパートメントにおける自食作用プロセスをモニターすることを可能にする。

このプロトコールは、筋肉再生中のMuSCにおける自食作用を検出するための有効なin situ方法を記載している。 CTX インビボ治療： TA筋肉に筋肉損傷を誘発するためにCTXを使用し、対照として摂動していない筋肉を使用する。オートファジーは非常に動的なので、CLQ?...

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In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

10.1K ビュー.  Italian National Research Council. アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。 

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

生物学

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via the lysosome and are recycled. During autophagy, cytoplasmic LC3 protein is lipidated and recruited to the autophagosomal membranes. The autophagosome then fuses with the lysosome to form the autolysosome, where the breakdown of the autophagosome vesicle and its contents occurs. The ubiquitin-associated protein p62, which binds to LC3, is also used to monitor autophagic flux. Cells undergoing autophagy should demonstrate the co-localization of p62, LC3, and lysosomal markers. Immunofluorescence microscopy has been used to visually identify LC3 puncta, p62, and/or lysosomes on a per-cell basis. However, an objective and statistically rigorous assessment can be difficult to obtain. To overcome these problems, multispectral imaging flow cytometry was used along with an analytical feature that compares the bright detail images from three autophagy markers (LC3, p62 and lysosomal LAMP1) and quantifies their co-localization, in combination with LC3 spot counting to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Here, multispectral imaging flow cytometry with an analytical feature that compares bright detail images of 3 autophagy markers and quantifies their co-localization, along with LC3 spot counting, was used to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.

筋生検における免疫標識筋線維変性

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

マウス骨格筋を採取して幹細胞とそのニッチを培養

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

著者スポットライト:ニッチ成分で静止筋幹細胞を培養するためのEx Vivoプロトコル 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...