この研究は、NIAMS AR064873、Epigen Project PBによって支持された。 P01.001.019 / Progetto BandieraエピゲノムIFTからLL

マウスを標準動物施設手順に従って飼育し、維持した。すべての実験プロトコールは、動物福祉保証およびイタリア動物保健省の動物実験倫理委員会によって承認され、NIHのケアおよび使用ガイド実験動物。 1.オートファジーフラックスの筋肉傷害およびインビボブロック<ol><li> 筋肉傷害。 <ol><li>急性骨格筋傷害を誘発するために、約20gの重さの2ヶ月齢のC57BL / 6Jマウスの左脛骨前（TA）筋肉に10μMのカルジオトキシン（CTX）ストック20μLを直接注入する。同数の男性と女性を使用してください。摂動していない対側肢を対照として用いる。 注：0.9％塩化ナトリウム溶液中の10μMCTXはろ過し（0.22μmPVDFフィルター）、-20℃で保存する必要があります。凍結融解サイクルを繰り返さないでください。 </li><li>私は30Gの針を備えたnsulinシリンジ、TAの中央にCTXを注射する。 TAの正確な損傷を誘発するために、注射器の針が筋肉の底部から上部まで5mmの遠位腱の近くに入るようにします（ 図1A ）。 </li></ol></li><li> 摂動していないマウスおよび傷害を受けたマウスにおける自食流の遮断。 <ol><li> 24時間後の傷害（pI）、腹腔内（IP）注射（ 図1B ）により24時間毎に50mg / kgクロロキン（CLQ）を4日間投与する。 <ol><li> CLQ（10mg / mL）をPBS 1Xに溶かし、0.2μm膜を通してそれをろ過する。すべてのマウスの体重を測定し、注入するCLQの量を計算します。 注：同じ日にCLQソリューションを準備して使用してください。 CLQストックは、-20℃で最大1ヶ月保存することができます。オートファジーは代謝関連のプロセスであるため、常にCLQ治療を常に同時に実行します（ つまり 、朝のbefo午前10時）。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.筋肉組織セクション<ol><li> マウスの犠牲。 <ol><li>損傷の5日後にマウスを安楽死させる。 </li><li>頸椎脱臼またはCO 2による安楽死を行う（確認のために頸椎脱臼を行う）。オートファジープロセスはマウスの睡眠/食習慣に関連するので、常に、好ましくは朝（ すなわち午前10時前）にマウスを犠牲にする。 </li></ol></li><li> TA分離および包含。 <ol><li>解剖の前に、マウスに70％エタノールを噴霧する。 </li><li>はさみを使用すると、腰のレベルでマウスの背部皮膚に小さな、垂直の切開（長さ3mm）を作る。皮膚の除去を簡素化するために尾と足を切断します。皮膚を尾に向かって引っ張り、それを取り除いて下にある筋肉を露出させる; 図2Aに示すように、TA筋肉は局在化するのが容易である</強い&gt;。 </li><li> 2つの鉗子の助けを借りて、遠位腱をつかむ。 </li><li>遠位腱を切断する。 TAとextensor digitorium longus（EDL）腱はしばしば一緒に切断され、後に分離される（2.2.6参照）。 </li><li>鉗子を使用して、腱によるTA筋肉を保持し、筋肉を近位端（膝の近く; 図2B ）に向かって慎重に引き上げる。 注：この時点で、EDLおよびTA筋肉は容易に認識され、TAはEDLより大きく、より表面的である。 </li><li> 2つの遠位腱を反対方向に引くことによって、TAをEDL筋肉から分離する（ 図2C ）。 </li><li>近位の腱を切断する。 </li><li>鉗子を使用して、組織を損傷することなく、筋肉を覆う薄い筋膜を除去する。 </li><li>ペーパータオルの助けを借りてサンプルの過剰な水分を除去してください。筋肉が濡れていなくても過度に乾燥していないことを確認してください。筋肉に大きなダメージを与え、次の染色を危険にさらします。 </li><li>最適切断温度（OCT）化合物を金型の底に置き、 図2Dに示す向きでその中に筋肉を入れます。 100％イソペンタンを約3〜4cmの深さに達するまでビーカーに加える。ビーカーをポリスチレンボックス内の液体窒素と接触させる。 </li><li>液体窒素がビーカーに入るのを避けてください。発泡泡が生成され、これが筋肉の切片に含まれて損傷することがあります。 </li><li>イソペンタンを観察し、適切な温度（-140℃〜-150℃）に達するまで待つ。適切な温度で、凍結イソペンタンの固体白色層がビーカーの底部で結晶化する。 </li><li>イソペンタンが完全に凍っている場合は、融解して凍結温度まで冷やしてから次のステップに進みます。 </li><li> prechilled鉗子を使用して、微妙に金型を下げるイソペンタンは約20〜30秒間保持する。冷凍サンプルを-80℃冷凍庫に移すまでドライアイスを入れた容器に入れます。 注記：ここではプロトコルを一時停止することができます。 </li></ol></li><li> 筋肉組織の凍結切片。 <ol><li> -80℃で少なくとも1夜後、凍結切片作製を行う。 </li><li>クライオスタットナイフとアンチロールプレートを-20℃の冷凍庫から取り出し、それぞれのサポートにクライオスタットキャビネットに入れます。 </li><li> 図2Dに視覚化されているように、サンプルスタブ上にOCTを滴下し、凍結サンプルを垂直NS方向に置く。 </li><li>サンプルスタブをチャック上に置きます。 </li><li>アンチロールプレートをナイフに引っ張らずに、筋肉を含まないOCTを取り除くために、40μmのカットをいくつか行います。筋肉が見えるようになったら、スライスの厚さを7〜8μmに減らします。 </li><li>アンチロールプレートを下になるまで下に引きますナイフの端またはそれより少し上にある。 </li><li>横断切片を7〜8μmの厚さに切断し、組織学的スライド当たり3〜4枚のスライスを取り付ける。 注：クライオスタットの推奨温度は-15℃〜-23℃です。衛星のニッチ位置で筋幹細胞を特定するために、その後の分析にはサンプルの断面が必要です。 </li><li>切片の接着性を最大にするために、スライドを室温で10〜15分間保ち、抗体インキュベーション中にそれらの分離を防ぐ。 注：空気乾燥工程は免疫染色に影響を与え、あいまいな結果をもたらす可能性があります。スライドは、-80℃で数ヶ月間固定しないで保存することができます。ここでプロトコルを一時停止することができます。 </li></ol></li><li> ヘマトキシリン・エオシン（H＆E）染色を行うことにより、TA筋肉の凍結切片における筋肉損傷をチェックする。 <ol><li>筋肉の質（ すなわち 、傷害、筋肉の隔離および包含の有効性）を評価するためにイオン、および凍結切片）を用いて、H＆E染色を行う。すべての実験時点について、スライドを4％PFAで10分間固定する。固定後、1x PBSのいくつかの変更でスライドをよく洗う。 注意：注意してください。 PFAは発癌物質であり、注意深く取り扱わなければならない。 </li><li>実験のポイントごとに1つのスライドを取り、染色瓶に入れます。 </li><li>瓶に9g / Lのヘマトキシリンを充填し、切片を覆い、8分間インキュベートする。 </li><li>ヘマトキシリンをリサイクルする。 </li><li>瓶を流水中に10分間放置して、過剰のヘマトキシリンを除去する。 注：セクションに水を直接流さないように注意してください。 </li><li>滅菌水で洗浄する。 </li><li>酸性化90％エタノール中で0.5％（w / v）のエオシンで1分間切片をインキュベートする。 </li><li>エオシンをリサイクルしてください。 </li><li> 3分間滅菌水で2回洗浄する。 注記：ケミカルフードで以下の手順を実行してください。 </li><li>切片を70％エタノールで洗浄する。 </li><li>ウォッシュ90％のエタノールを含むセクション。 </li><li> 100％エタノールで切片を洗浄する。 </li><li>切片を0.879g / mLのo-キシレンでインキュベートする。 注意：注意してください。 o-キシレンは引火性があり、適度に有毒である。手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を着用し、化学フードの下で操作してください。 </li><li> o-キシレンをリサイクルしてください。 </li><li>スライドを紙の上に置き、乾燥させます。 </li><li>クイック・ハード・キシレン・ベースのマウント・メディアを使用してスライドを閉じます。 </li><li>光学顕微鏡下で10倍の倍率で断面の品質を確認する（ 図3参照） 注記：ここではプロトコルを一時停止することができます。 </li></ol></li></ol> 3.損傷した筋肉組織切片におけるLC3およびMyoDの免疫染色<ol><li> 筋肉組織切片の固定。 <ol><li> 1枚の紙を濡らし、それを密閉可能なプラスチック製の箱の底に置くことによってインキュベーションチャンバーを準備し、高レベルを維持するチャンバー内の湿度は非常に高い。 10分間1×PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で組織切片を固定する。 注：湿った紙を使用してサンプルを乾燥させないようにします。新鮮なPFAを調製するか、-20℃で保存したPFAを使用してください。あぶない。 PFAは有毒である。原液を作る際に粉末を注意して取り扱わなければならない。この作業は、手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を備えた化学フードで実施する必要があります。また、溶液中でPFAを注意深く操作する必要があります。 </li><li> PFAを除去し、セクションを1×PBSで5〜7分間洗浄する。この手順を3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 筋組織切片の透過化。 <ol><li>パップペンを用いて組織切片の周りに疎水性障壁を描く。 注：このステップは、組織切片の周りの表面を規定し、ステップ3.4,3.6,3.7および3.9に記載される抗体の量を最小にする。 </li><li>切片を200μLの冷（-20℃）メタノールで洗浄し、インキュベーションチャンバーをフリーザー内で水平に-20℃で5分間置く。 </li><li>冷凍庫からインキュベーションチャンバーを取り出し、メタノールを吸引し、RTで5-7分間1X PBSで切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> ブロッキング <ol><li> PBS 1x中の4％ウシ血清アルブミン（BSA）の新しいブロック溶液を調製する。 注：BSA溶液は4℃で1週間保存することができます。 </li><li>切片をブロック溶液で少なくとも60分間RTでインキュベートする。 </li><li>ブロッキング溶液を除去する。 </li><li> 1×PBS中20μg/ mLの抗Fabを希釈することにより100μLの抗Fab混合物を調製する。切片を、抗マウスIgGの非結合親和性精製F（ab）断片と室温で1時間インキュベートする。 </li></ol></li><li> 一次抗体インキュベーション。 <ol><li> 1倍PBS中の4％BSAにLC3およびMyoD抗体を溶解することにより、各スライドの100μLの一次抗体混合物を調製する。 5μg/mLの抗LC3（ウサギポリクローナル抗体）および10mg / Lの抗MyoD（マウスモノクローナル抗体）を添加した。一次抗体混合物を4℃で一晩インキュベートする。 </li></ol></li><li> 洗濯。 <ol><li>一次抗体混合物を除去する。 </li><li> 10分間1X PBS中1％BSAで切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 二次抗体インキュベーション。 <ol><li>各スライドの二次抗体ミックスを100μL調製します。 1x PBS中の4％BSA中でヤギ抗ウサギ488（5μg/ mL）およびヤギ抗マウス594（5μg/ mL）を溶解する。 注：蛍光色素の漂白を防ぐために、光に過度の暴露を与えないでください。暗い場所で以下の手順を実行します。 </li><li>セクションを二次抗体ミックスとRTで45分間インキュベートする。 </li><li>二次抗体混合物を除去し、1×PBSで5〜7分間切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 一次抗体インキュベーション。 <ol><li>薄層スライド1つにつき100μLの混合物を用いて、1×PBS中の4％BSA中のn-2（α-2鎖）モノクローナル抗体（0.33μg/ mL）一次抗体ミックス中の切片をRTで1〜2時間インキュベートする。 </li></ol></li><li> 洗濯。 <ol><li>一次抗体混合物を除去する。 </li><li> 10分間1X PBS中1％BSAで切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 二次抗体インキュベーション。 <ol><li> 1X PBS中の4％BSA中のヤギ抗ラット647（5μg/ mL）を希釈することにより、各スライドの二次抗体混合物100μLを調製する。二次抗体ミックス中の切片をRTで45分間インキュベートする。 </li><li>二次抗体混合物を除去し、1×PBSで5〜7分間切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）インキュベーション。 <ol><li>各スライドに1x PBS中の300nM DAPI溶液200μLを加える。 RTで5分間インキュベートする。 4℃でDAPI溶液をダーク。 </li><li>セクションを1×PBSで5〜7分間洗浄する。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li> 染色された筋肉部分を取り付ける。 <ol><li>セクションから余分な洗浄液を除去する。 </li><li>スライドの真ん中に染色されたセクションに1×PBS（3：1）にグリセロール10μLを置き、気泡の形成を避けて、カバースリップを加える。 </li></ol></li></ol> 4.共焦点顕微鏡の取得<ol><li>画像キャプチャシステムと分析ソフトウェアを統合した4レーザー共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。 注：MyoDは、594nmレーザー（励起：590nm、発光：617nm）に理想的に適した励起を有する、明るい赤色蛍光色素である594色素とコンジュゲートされる。 LC3は、488nmのレーザーライン（励起：495nm、発光：519nm）に理想的に適した励起を伴って、明るい緑色蛍光色素である488色素と結合している。ラミニンは、647色素とコンジュゲートされており、647nmレーザーライン（励起：650nm、発光：668nm）に理想的に適した、明るい遠赤色蛍光染料である。 </li><li>スライドを顕微鏡トレイに置き、核信号を検出するために63倍の倍率を使用します。筋肉の形態に依存して、能動的再生のフィールドを中心にして手動で再生領域に焦点を当てます（ 図4参照）。 注：摂動していない筋肉では、筋繊維のサイズは事実上一定です（ 図4A ）。損傷後の筋肉再生は、再生後に新たに形成された繊維である、より小さな筋繊維の出現によって認識することができます。さらに、能動的再生における筋肉は、マクロファージ、線維脂肪生成前駆体、および損傷した筋肉に局在化して筋再生を調整する細胞（ 図4B ）からなる広範な浸潤物を特徴とする。 </li><li>再生中の免疫蛍光染色を評価するmyofibersの基底板の下に位置するMuSCに焦点を当てることにより、非侵襲性領域を検出する。 </li><li> MyoD染色に陽性であり、ラミニン染色で標識された筋線維内に位置するMuSCに焦点を当てる（ 図4B 、白矢印参照）。 </li><li>少なくとも3匹のマウス/実験群を使用し、各実験群について少なくとも7欄の63倍の拡大像を得るために顕微鏡を使用する。 </li><li> 再生領域が同定されたら、DAPI染色を用いて焦点を合わせ、他の単一チャネルを調整する。 <ol><li>以下の顕微鏡設定を使用してください。チャンネルA594ピンホール1.2エアリーユニット、ゲイン791;チャネルA488ピンホール1.6エアリーユニット、ゲイン659;チャンネルA647ピンホール1.4エアリーユニット、ゲイン719。 </li></ol></li><li>単一チャンネルの焦点を調整した後、1,024×1,024のフレームサイズと12.61μsのピクセルドウェルで画像を取得します。 </li><li> MyoD陽性細胞のパーセンテージをカウントする（tLC3陰性であるMyoD陽性細胞のパーセンテージをLC3シグナルと比較して示す図である。 注：LC3染色を示すMyoD陽性細胞のパーセンテージは、このプロトコールの読み取り値です。 </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autophagy+as+a+potential+mechanism+for+the+improved+physiological+function+by+simvastatin+in+muscular+dystrophy.">Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy.</a> Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).</li><li>Whitehead, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+therapeutic+effect+of+simvastatin+revealed+by+functional+improvement+in+muscular+dystrophy.">A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).</li><li>Fiacco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+regulates+satellite+cell+ability+to+regenerate+normal+and+dystrophic+muscles.">Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles.</a> Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).</li><li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+NAD-dependent+deacetylase+Sirt1+in+the+regulation+of+autophagy.">A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).</li><li>Rubinsztein, D. C., Mari&#241;o, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging.">Autophagy and aging.</a> Cell. 146 (5), 682-695 (2011).</li><li>Colman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+delays+disease+onset+and+mortality+in+rhesus+monkeys.">Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys.</a> Science. 325 (5937), 201-204 (2009).</li><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132 (1), 27-42 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Calorie+Restriction+Enhances+Cellular+Quality-Control+Processes+in+Human+Skeletal+Muscle.">Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).</li><li>Wenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+muscle+PGC-1alpha+expression+protects+from+sarcopenia+and+metabolic+disease+during+aging.">Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).</li><li>Carnio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Impairment+in+Muscle+Induces+Neuromuscular+Junction+Degeneration+and+Precocious+Aging.">Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging.</a> Cell Rep. , (2014).</li><li>Sandri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misregulation+of+autophagy+and+protein+degradation+systems+in+myopathies+and+muscular+dystrophies.">Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).</li><li>Cerletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+calorie+restriction+enhances+skeletal+muscle+stem+cell+function.">Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).</li><li>Gopinath, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3+promotes+quiescence+in+adult+muscle+stem+cells+during+the+process+of+self-renewal.">FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).</li><li>Tang, A. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+supports+the+bioenergetic+demands+of+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation.</a> EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).</li><li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+maintains+stemness+by+preventing+senescence.">Autophagy maintains stemness by preventing senescence.</a> Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li></ol>

著者は何も開示していない

<html>このプロトコールは、代償性筋再生中に骨格筋幹細胞におけるオートファジーをモニターする方法を記載する。 LC3とMyoDの同時染色のためのいくつかの抗体が試され、マウス組織切片で働き、成功した結果を創り出す抗体がここに掲載されています（ 材料表を参照）。メタノールによる透過処理（ステップ3.2.2参照）は、染色を成功させるために強く推奨されます。 <p clas...

骨格筋再生は、成体幹細胞（Muscle Satellite Cells、MuSCs）と再生過程に関与する他の細胞型との相互作用の結果である。筋肉の恒常性および機能性は、筋肉のニッチおよび全身的な手掛かり1,2から生じる信号を組み合わせることによって維持される。生涯にわたって、MuSC機能、筋肉のニッチ、および全身手がかりの変化が報告され、高齢者の機能的能力の低下3につながる。 MuSCは基底板の下のニッチに設置され、筋肉傷害時に損傷筋肉を修復するために活性化される4,5 。生産的な再生応答を確実にするためには、MuSCが静止からの退出、自己再生、および増殖の拡大段階に必要な異なるプロセスを調整することが重要である筋原性分化6 。高齢者および筋肉慢性疾患では、これらの機能が全て損なわれ、筋機能が変化する（2,3,6,7,8,9,10,11,12,13）。 マクロオートファジー（以下、オートファジーと呼ぶ）は、組織恒常性を維持するために不可欠な重要な生物学的プロセスとして浮上している14 。自食プロセスは、細胞質、細胞小器官、およびタンパク質の一部が最終的にリソソーム経路を介して分解されて小胞に包み込まれ、毒性分子の除去およびマクロモールのリサイクルを促進する輸送メカニズムを包含するcules。これは、ストレスまたは他の悪条件の下での細胞および組織の適応を支援するためのエネルギー豊富な化合物を提供する15,16 。オートファジーは、その細胞生存活性と共に、細胞組織の状況（ 例えば、正常組織と癌組織）およびストレス刺激のタイプに依存して、細胞死誘導因子として働くことができる17,18 。 最近の証拠によれば、オートファジーは筋肉量および筋線維の完全性を維持するために必要とされる19,20 、 Duchenne筋ジストロフィー（DMD）を含む異なる筋ジストロフィー21,22,23で障害されることが報告されている24,25,26,27 </su同様に、筋肉量の喪失（サルコペニアと呼ばれる）後の高齢者31,32,33,34,35において、自食作用の進行性低下が観察されている32,33,34（p&gt; 、 28,29,30）。 、 35,36,37 、筋電図の生存38 。 オートファジーと骨格筋の再生能力との密接な関係は、カロリー制限がMuSCの利用可能性と活性を高めることを示したWagers研究所の研究によって予想された39 。これはいいえFoxo3-Notch軸が自己再生中に自食作用過程を活性化し、MuSCが静止状態から増殖状態に移行するという最近の観察によってさらに支持された41 。これらのデータは、老化中のMuSCの数値的および機能的低下に関連して、若年から老齢および老人性のMuSCからの基礎的な自食作用の進行的な減少と一致する42 。 最近の論文では、DMDの進行の初期段階を区別する自食作用と代償性筋再生との間に密接な関係があることを示した。従って、我々は、筋肉の再生が損なわれ、線維性組織沈着が起こる、疾患の進行の後期段階で減少した自食作用の流出を観察した。興味深いことに、我々は、再生条件において、オートファジーがMuSCにおいて活性化され、オートファジープロセスを調節することがMuSC活性化およびfuに影響を及ぼすことを示した法律30 。 まとめると、これらのデータは、正常および病理学的状態および生涯にわたる筋肉再生中のMuSCにおける自食作用プロセスを探索する緊急性を強調している。ここでは、オートファジー43のマーカーである微小管関連タンパク質1A / 1B軽鎖3（LC3）およびMyoDマーカーのin situ免疫染色を行うことにより、筋再生状態におけるMuSCにおける自食作用プロセスをモニターするためのプロトコルを提供する。筋原性系統、対照および損傷マウス由来の筋肉組織切片中に存在する。報告された方法論は、1つの特定の細胞コンパートメント、筋再生を調整する上で重要な役割を果たすMuSCにおける自食作用プロセスをモニターすることを可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:332px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:251px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:128px;">000664</td>
			<td style="width:196px;">WT mice</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cardiotoxin 1</td>
			<td>Latoxan</td>
			<td>L8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Millex-VV</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td style="width:196px;">Syringe Filter Unit, 0.1 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Chloroquine diphosphate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">BD Micro-Fine + 0,5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue-Tek Cryomold Intermediate</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:122px;">o-Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1040</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Eukitt - Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LC3B Antibody</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>2775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:332px;">Monoclonal mouse anti-MyoD 
			(concentrated) clone 5.8A</td>
			<td>DAKO - Agilent Pathology Solutions</td>
			<td>M3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Laminin-2 (&#945;-2-chain) monoclonal antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>4H8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A21248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells

組織ホメオスタシスを保存するための重要な調節プロセスとして、自食作用が指摘されています。オートファジーは骨格筋の発達と再生に関与していることが知られており、オートファジー過程はいくつかの筋肉病変および加齢に関連する筋肉疾患に記載されている。筋修復中の衛星細胞の機能的枯渇と相関する、最近記載された自食プロセスのブロックは、能動的な自食作用が生産的な筋再生と結びついているという考えを支持する。これらのデータは、筋ジストロフィーのような正常および病的状態の両方における筋肉再生中の衛星細胞活性化におけるオートファジーの重要な役割を明らかにする。ここでは、筋肉再生条件下での成体筋幹細胞（MuSC）コンパートメントにおける自食作用プロセスをモニターするためのプロトコールを提供する。このプロトコールは、LC3のインサイチュ免疫蛍光イメージングを行うためのセットアップ方法論を説明している。対照マウスおよび損傷マウスからの筋肉組織切片中の筋原性マーカーであるMyoDとの間の相互作用を示す。報告された方法論は、1つの特定の細胞コンパートメント、筋肉再生を調整する中心的な役割を果たすMuSCコンパートメントにおける自食作用プロセスをモニターすることを可能にする。

このプロトコールは、筋肉再生中のMuSCにおける自食作用を検出するための有効なin situ方法を記載している。 CTX インビボ治療： TA筋肉に筋肉損傷を誘発するためにCTXを使用し、対照として摂動していない筋肉を使用する。オートファジーは非常に動的なので、CLQ?...

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In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

10.1K ビュー.  Italian National Research Council. アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。 

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Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

ラットのための手順<em&gt;その場で</em&gt;骨格筋収縮特性

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

生物学

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

長指伸筋の筋機能の評価<em&gt;エクスビボ</em&gt;と前脛骨筋<em&gt;その場</em&gt;マウスの

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...