The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1.実験の設定<ol><li> 昆虫館の要件 <ol><li>すべてのC.を維持25℃、湿度65％および12/12時間の明/暗の光でcapitataのライフステージ。 </li><li> 6 Lケージには約1,500〜2,000チチュウカイミバエ蛹を置きます。産卵42を刺激するのに十分に小さい穴を有する一方の側に真鍮メッシュでケージを使用してください。毛細管現象により水でハエを提供するために、ケージのベースにある小さい開口部からスポンジ片を挿入します。大人（ 図1A）のための食料源として酵母と砂糖（1:10）の混合物を使用してください。酵母の量を増やします（最大1：砂糖：3、酵母）メスは卵を産むために失敗する必要があります。 </li><li>メッシュを通して堆積卵を収集するために、ケージの下に水で満たされたプレートを置きます。処女雌が産卵することができるようにハエがマイクロインジェクション実験のために卵を収集する前に、少なくとも6〜7日間経過するまで、待ちます。これは、女性が交尾しているであろうことを保証しますそして卵が受精されているであろうこと。 </li><li>細かいネットストレーナーで水を濾過することによって卵を収集します。標準の幼虫の食（1.5 LH 2 O、100ミリリットルを1％HClを含有するプラスチック製の箱にストレーナから卵を移す広域スペクトル抗菌剤は50ミリリットルのエタノールに溶解した5グラム、400グラムの砂糖、175グラムの脱イオンビール酵母、1パスツールピペットを使用して）軟質小麦ふすまをkgです。 </li><li>空気の循環を可能にするために、ネット蓋を透明容器内の各ボックスを配置し、ふすまの層を含有する蛹化（ 図1B）を有利にします。 </li><li>約10日後に、幼虫の食物から出てくると蛹化のためのふすま層に飛び降りる第3齢幼虫を確認してください。 </li><li> 24時間後、柔らかいブラシを使用して、小さなカップに蛹を収集し、新しい大人のケージに転送します。大人は通常10日蛹化後に出現します。新興フライはptilinum、目の上にその頭の上に位置して膨らませてポケットを使用していますアンテナの電子ベースは、蛹殻の終わりを強制的にオフにします。出現した後、ptilinumは恒久的に頭の中に戻って崩壊します。 </li></ol></li><li> マイクロインジェクション幼虫のため1 Lの食品の調製 <ol><li> 300ミリリットルのH 2 Oに2.5グラム寒天を溶かし</li><li>ホット撹拌プレート上のウォーム500ミリリットルのH 2 Oおよび4グラム安息香酸ナトリウム、4.5ミリリットル37％HClを、42グラムの酵母エキスと115グラム脱水ニンジン粉末を溶解します。 </li><li>混合物に10ミリリットルの無水エタノールに溶解した2.86グラム広域スペクトル抗菌剤の溶液を加えます。 </li><li> 15センチメートルラウンドペトリ皿に培地を配布し、放冷します。必要に応じて、4℃で保存します。 </li></ol></li><li> スライドの準備 <ol><li>顕微鏡スライド（75×26ミリメートル2）に両面テープの2cmのストリップを置き、油スプレッドと注入された胚の結果としての乾燥を防ぐために、中国のマーカーでエッジをマークします。 </li></ol></li><li><st栄&gt;核酸の準備<ol><li>市販のキット34を用いてプラスミドDNAを単離します。エタノールを用いてプラスミドを沈殿させ、所望の濃度で注射用緩衝液（0.1 mMリン酸緩衝液pH 7.4、5ミリモルのKCl）中に再懸濁します。 </li><li>フェノール-クロロホルムを使用して、長いdsRNAを合成し、in vitroで精製、イソプロパノールを用いて沈殿させ、注入バッファ43に再懸濁します。 </li></ol></li></ol> 2.胚の準備<ol><li> 6-7日齢の成人を含むケージの下に水で満たされたトレイを置きます。 </li><li>女性は30分間産卵した後、細かいストレーナーを用いて水を濾過することによって胚を収集することを許可します。常に胚の乾燥を避けるために、水にストレーナを保ちます。 </li><li>商業50％の漂白剤溶液中に5秒間ストレーナを浸すことにより、胚をDechorionate。 </li><li>少なくとも、（繰り返しきれいな超純水にストレーナを浸すことにより、慎重に胚を洗います4-5回）。最後に、きれいな超純水にストレーナを配置します。最大2時間以内に胚を使用してください。 注：マイクロインジェクションのタイミングは、前細胞化の核分裂の段階の間に、前胚盤葉の胚に注入する必要性に関連しています。これは、注入されたDNAを採取アップする核に、具体的に配偶子を発信します始原生殖細胞核の中にできます。チチュウカイミバエ細胞化に9と12時間45,46との間で行われるのに対し、 ショウジョウバエでは、極細胞で細胞化は、胚盤葉の形成は、約30分後に44を発生すると、（25℃）受精後約90分で開始します。 </li><li> 行の胚の向き <ol><li>細かい絵筆を使用して、約50の胚を収集し、水に浸した黒濾紙ディスク上に置きます。 </li><li>解剖実体顕微鏡下では、両面テープの上面の上の行の胚を手配細かい絵筆（000）を使用して、顕微鏡スライド（ 図1C）。 注：注射は生殖系列の始点となる後極で行われているように、すべて同じ向きで胚を合わせます。後極は卵門領域に対向します。 </li><li>油は（1.3を参照）中国のマーカーの境界線上にこぼれないことを確認してクロロトリフルオロエチレン油の層で胚をカバーしています。 注：油で胚をカバーする前に、更なるステップを行うことができる：胚は、その液体の含有量を減らすため、注入されたDNA溶液の侵入を容易にするために、数分間乾燥させることができます。これは、高い液体圧力の結果として、注射または注入溶液の過度の漏洩時​​の胚の破裂を回避するのに役立つことがあります。 </li></ol></li></ol> 3.胚のマイクロインジェクション<ol><li>マイクロピペットを用いてプラスミドDNAまたはdsRNA溶液（1-2μgの/μl）を用いて、針（1-2μl）を入力します。 </li><li&gt;が噴射時間（0.5秒）を制御するマイクロインジェクション装​​置に針を接続し、圧力（800ヘクトパスカル）と背圧（150ヘクトパスカル）。 </li><li>針（ 図1D）の動きを制御するためにマイクロマニピュレーターを使用して、実体顕微鏡下でマイクロインジェクションを実行します。スライドを移動するために顕微鏡ステージを使用してください。 <ol><li>スコープのステージ上にスライドを置きます。 </li><li>胚（ 図1E）の後極に針の先端を挿入します。 </li><li>ペダルとマイクロインジェクションシステムを作動させることによって溶液を注入します。注入された液体は、胚のわずかな動きで、その結果、内部圧力の増加を誘導します。 </li><li>ペダルを離すとすぐに、しかし優しく、胚から針を取り除きます。 </li><li>注射部位のほとんどの細胞質の漏れを確認します。 注：原因マイクロインジェクションプロにDNA / dsRNAは/ siRNAおよび死亡率の潜在的な致死効果とを区別するために、自身cedure、対照実験を実施しなければなりません。これらは、逆遺伝学実験の場合には、緩衝液のみの注入を含む、または、緑色蛍光タンパク質（GFP）の二本鎖RNA（dsRNA-GFP）、またはsiRNAの由来。 </li></ol></li><li>注射後25℃で胚をインキュベートします。 </li></ol> 4.注入後の手順<ol><li>注入の2日後、実体顕微鏡下で孵化した幼虫（ 図1F）のためのスライドを確認してください。幼虫は、油に移動するが、できるだけ早く幼虫食品に転送する必要があることができます。このため、スライドを数回日をご確認ください。 </li><li>細かい絵筆（000）を使用して、静かにニンジンベースの幼虫食品に孵化した幼虫を移します。各ペトリ皿当たり200幼虫の最大値まで転送します。 </li><li>湿度65％（25℃）で幼虫をインキュベートします。空気交換を損なう、蓋が皿に固執しないことを確認してください。 </li><li>蓋をペトリ皿にしてください幼虫への空気の流れがまだあるように、ほとんど閉じました。過度の乾燥を避けるために、必要に応じて、毎日の料理をチェックし、蒸発を補うために水を追加します。 </li><li>ネット蓋と蛹化を有利に働くふすまの層を含むことにより、閉じた透明容器にペトリ皿を置きます。ルーチン昆虫館飼育については、 第3齢幼虫の幼虫の食のうち、ジャンプとはふすまで蛹になります。 </li><li> （これは世代0、G0）で蛹を収集し、大人の飼育およびスクリーニングのための小さなケージに配置します。リア標準幼虫食品に子孫。 </li><li>注入された個人は、通常、キメラあるとして生殖形質転換実験の場合には、次の世代（G1）で可能な形質転換された個人のために確認してください。転位事象は、確かに、生殖細胞系または細胞体のいずれかを形成する胚の合胞体、核のいずれかに発生した可能性があります。 <ol><li>まもなく出現した後、CO 2を使用して、G1の個人を麻酔し、TRANSFをチェック落射蛍光実体顕微鏡下でのイベントをormation。緑色蛍光のために画面にEYFPフィルタ（。。;エム30分の535内線500/20）を使用しながら、; DsRedwideフィルタ（EMM 75分の605。。内線12分の546）を使用し、赤色蛍光の存在をスクリーニングするために、 。 </li><li>異性の野生型大人と小さなケージに変換された個人を置き、新しい、最初はヘテロ接合、歪みを発信。 </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

昆虫の胚中の核酸のマイクロインジェクションは、遺伝子機能の解析とバイオテクノロジーのアプリケーションの両方を容易に普遍的な技術です。 昆虫の種数の増加から、ゲノム配列の最近の刊行物は、まだ未知の機能の遺伝子の機能解析のためのツールのための緊急の必要性につながります。 RNA干渉は、分子機能49と胚のマイクロインジェクションを推測する...

地中海ミバエは（チチュウカイミバエ）Ceratitis capitataはコスモポリタン種広範囲に被害果物や栽培作物です。このような属BactroceraやAnastrephaに属するものなど、いくつかの害虫種を含み、ミバエ科のファミリーに属します。チチュウカイミバエは、このファミリーの最も研究の種であり、それは昆虫の侵略1の研究のためだけでなく、害虫管理戦略2を最適化するためだけでなく、モデルとなっています。 チチュウカイミバエは野生と栽培植物3,4の300以上の種を攻撃することができます多化の種です。損傷は大人と幼虫の両方によって引き起こされる：交配した雌は、微生物がそれらの商業的品質に影響を与えることができるように、産卵のために果物の表面に穴を開け、果肉上の幼虫フィード一方。 3幼虫期の後、幼虫は、ホストから出てくると土壌に蛹化。Ceratitiscapitataは、アフリカ、中東、西オーストラリア、中南米、欧州、米国5の領域を含む、ほぼ世界的な分布を表示します。 チチュウカイミバエ蔓延を制限するための最も一般的な戦略は、殺虫剤（ 例えば 、マラチオン、スピノサド）と環境に優しい滅菌昆虫技術（SIT）6の使用を伴います。後者のアプローチは、電離放射線への暴露により無菌に男性の数十万の野生への放出を伴います。野生のメスのような滅菌男性の交配は、最終的に根絶につながる、人口規模の縮小を引き起こし、ノー子孫になります。 SITは、世界中の複数のキャンペーンに有効であることが証明されたが、その主な欠点がリリースされる昆虫の何百万人を飼育し、殺菌の高コストが含まれます。放出された個人のマーキング中にフィールドに入力された野生昆虫から無菌区別する必要があります活動を監視し、それが現在の蛍光粉を使用して達成されます。これらの手順は、高価であり、望ましくない副作用7を持っています。 最適化するために、および/または、この害虫の制御のためのより効果的なアプローチを開発するためには、チチュウカイミバエ生物学と遺伝学は広く世界中で数多くの研究者によって検討されています。チチュウカイミバエゲノム配列8,9の利用可能性は、遺伝子機能に関する新たな調査を容易にするであろう。 RNA干渉は、そのような研究のための強力なツールであり、それは、dsRNA（二本鎖RNA）又はsiRNA（低分子干渉RNA）の微量注入を介して達成することができます。この技術は、Cでその性別決意分子カスケードを実証するために、例えば、使用されていますcapitataは部分的にしかショウジョウバエ 10とに対して保存されています。 C.許可チチュウカイミバエ胚を顕微注入するためのプロトコルの開発最初の非すべきcapitata-Drosophilidフライ種は遺伝的に改変されます。その卵は、 ショウジョウバエと同様であり、両方の形態および乾燥11への耐性の観点から、プレ胚盤葉の胚にプラスミドDNAを送達するためのプロトコルは、最初のDのために開発されたようにショウジョウバエ 12,13 最初にCでの使用に適合しましたcapitata。これらの最初の実験は、転移因子ミノス11に基づいて、チチュウカイミバエ生殖変換を可能にしました。その後、元のシステムは、他のトランスポゾンベースのアプローチを用いて、14変更されました。これは、鱗翅目Trichoplusianiの 15からのpiggyBacの場合です。プロトコルは、以来、さらに最適化されており、これは他の多くの双翅目22-31の他tephritid種16-21の変換とを可能にしました。人工欠陥transpo：すべてのこれらのシステムは、一般的なバイナリーベクター/ヘルパープラスミドの形質転換系の使用に依存します所望の遺伝子を含有する息子は、プラスミドDNAに組み込まとトランスポザーゼ酵素32を供給することにより、昆虫のゲノムに組み込まれています。トランスジェニックチチュウカイミバエ行数は、精度を高める可能性がある、致死性を誘発する条件優性致死遺伝子を有する株、株の雄のみの子孫を生成するため、追加の雌雄鑑別戦略を必要としない、蛍光精子で株を含む複数の機能で、生成されましたSITの監視段階33-37の。トランスジェニック生物の野生でのリリースのみ38,39蚊に対するパイロットテストで発生したが、少なくとも一つの会社は、フィールド40での使用のためのトランスジェニックチチュウカイミバエ株の数を評価しています。 胚のマイクロインジェクションは、（CRを、このような転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピートなどの新しいゲノム編集ツールの開発に有利に働くことができますISPR）/ CRISPR関連タンパク質小説進化論と発達研究を可能にするだけでなく、利用可能なバイオテクノロジーのツールボックスを展開します9ヌクレアーゼ（Cas9）とホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子（HEGs）、。ゲノム編集アプローチはすでに蚊41における遺伝子ドライブシステムの生成を可能にし、チチュウカイミバエへの転送が目前に迫っています。ここでは、上記のすべてのアプリケーションに有用であることができるチチュウカイミバエ胚に核酸を微量注入のための普遍的なプロトコルを記述します。

<table><tbody><tr><td>1 x injection Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5&amp;nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Phenol-Chloroform purified</td></tr><tr><td>Standard Larval food</td><td></td><td></td><td>1.5 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50&amp;nbsp;ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#039;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td></tr><tr><td>Carrot Larval Food</td><td></td><td></td><td>2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86&amp;nbsp;g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L</td></tr><tr><td>Adult Food</td><td></td><td></td><td>yeast extract and sugar (1:10)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Injection needles&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Double slided tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Black circle paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 before use</td></tr><tr><td>Paintbrush (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Adult cages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrifluoroethylene oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ceratitis capitata&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The strain used is ISPRA</td></tr></tbody></table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

地中海ミバエ（チチュウカイミバエ）Ceratitis capitata（ヴィーデマン）（双翅目：ミバエ科）は非常に高い農業関連性を持つ害虫種です。これは、その生殖行動に起因している：彼らはパルプに卵や孵化した幼虫のフィードを置くとき、女性は果物や野菜の外表面に損傷を与えます。ワイルドC. capitata集団は、伝統的に噴霧および/または環境に優しいアプローチは、最も成功したが、無菌昆虫技術（SIT）である殺虫剤を介して制御されています。 SITは交尾する能力を保持するが、肥沃な子孫を生成することができません男性の大量飼育、放射線ベースの殺菌・フィールドリリースに依存しています。出現およびバイオテクノロジーのツールのその後の急速な発展は、一緒にチチュウカイミバエゲノム配列の可用性と、大幅にこの種の生物学の我々の理解を後押ししています。これは、ゲノム操作のための新しい戦略の増殖を支持しているCAnは集団制御に適用します。 この文脈では、胚のマイクロインジェクションは、チチュウカイミバエ制御のためのツールボックスの拡大に二重の役割を果たしています。キー生物学的プロセスを調節する遺伝子の機能を妨害する能力は、確かに、チチュウカイミバエ侵襲性の根底にある分子機構の理解を拡張します。さらに、生殖系列形質転換を達成する能力は、新規SIT設定将来フィールドアプリケーションについて試験することができる複数のトランスジェニック株の産生を促進します。実際、遺伝子操作は、例えば、フィールド内の滅菌男性パフォーマンスを監視するために使用することができる望ましい特性を付与するために使用することができ、またはそれは、初期の生命段階の致死をもたらすことができます。ここでは、これらの二つの主要な目標を達成するためにチチュウカイミバエ胚に核酸を顕微注入するための方法を記載します。

ここでは、それぞれ、目的の遺伝子の機能解析に向け胚のマイクロインジェクションの二つのアプリケーション（ケース1）を報告し、およびトランスジェニック株の世代（ケース2）で。 胚へのdsRNAの送達は、遺伝子機能を解明します。 innexin-5遺伝子は、昆虫では、男?...

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K ビュー.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

遺伝学

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

発生生物学

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

環境学

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

生物工学

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

のマイクロインジェクション法<em&gt; Patiria minata</em&gt;接合体

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

生物学

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、

要約

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この動画の章

家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する

マイクロインジェクションウエスタントウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

トウモロコシウンカ、ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

のマイクロインジェクション法

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、

要約

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家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

のマイクロインジェクション法

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

マイクロインジェクションウエスタントウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

トウモロコシウンカ、ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション