今日まで、CRISPRはほんの一握りの半翅目でしか使用されていません。ここで概説されているプロトコルは、研究者が他の半翅目種にCRISPRと生殖細胞系列の形質転換を適用するのに役立つ可能性があります。このプロトコルは、乾燥に敏感な昆虫胚のために特別に開発されました。
プロトコルの多くのステップは、他の昆虫種の転帰を改善する可能性があります。トランスジェニックウンカを生成する能力は、もはやウイルスを感染させることができない昆虫を作成するなど、新しい制御方法への扉を開きます。この技術は、西洋の花アザミウマなどの他の害虫の遺伝子機能を研究するための革命的であろう。
このCRISPR技術をアザミウマの胚に適応させ、有望な結果をもたらしました。このシステムでの実践は成功に不可欠であることがわかりました。ここに示す方法は、日常的に実行すると、さまざまな設定で柔軟に使用できるはずです。
成虫のPeregrinus maidis昆虫を保持するためのチャンバーを作るには、1オンスのカップの底に穴を開け、空気交換のために穴の上にスクリーンを接着します。生後1週間の成虫の雌昆虫を選択するには、コロニーを15ミリリットルの円錐形のチューブに1時間吸引してから、昆虫を氷上で短時間冷やします。腹部の腹側にある、通常は腹部の他の部分よりも暗い産卵管の存在によって女性を識別します。
彼らが集められるとき、女性をカップに移します。15人の女性が選択されたら、5 x 5センチメートルのパラフィンワックスフィルムでカップを密封します。400マイクロリットルの10%スクロース溶液をフィルムの上部に塗布し、2番目の5 x 5センチメートルのフィルムを溶液の上に置きます。
プラスチックパラフィンワックスフィルム側が産卵培地に直接接触した状態で採卵皿に成体室を置き、空気穴を覆わずに産卵室全体をラップで包みます。次に、チャンバーを摂氏25度、湿度70%、光14時間、暗10時間のサイクルに置きます。胚採取では、希望の産卵期間の後、22×30ミリメートルのカバースリップに1×15ミリメートルの両面テープを貼り、カバースリップを産卵室の産卵培地に置きます。
細かいブラシと解剖顕微鏡を使用して、個々の半透明の胚を寒天表面から両面テープに移動します。約25個の胚を選択したら、バナナの形をした胚を横に配置し、大きい方の端をテープに貼り付けます。胚のマイクロインジェクションの場合、まず、加湿フード内の解剖顕微鏡下で1%寒天と同じ高さの100 x 15ミリリットルのペトリ皿にカバースリップを置きます。
射出圧力を確認するには、石英注射針の先端を水滴に入れ、射出サイクルを開始します。圧力設定を確認後、カバースリップの左側から近づき、1つの胚の大きい方の端に針を挿入します。注射液を卵の中に届け、素早く針を引き抜きます。
すべての卵が注入されたら、カバースリップを新しい1%寒天皿の表面に置き、皿を湿度チャンバーに入れます。6日後、きれいな水と細かいブラシを使用して、生き残った胚を水で湿らせたろ紙を含む35 x 10ミリメートルのペトリ皿に移します。ペトリ皿をプラスチックパラフィンワックスフィルムで密封し、孵化室を摂氏25度のインキュベーターに入れます。
6〜8日後、細いブラシを使用して、出現した最初の齢のニンフを葉の切り抜きのペトリ皿に移し、プラスチックパラフィンワックスフィルムで皿を密封します。摂氏25度で48時間後、細いブラシを使用して、生後2日齢のすべてのニンフをトウモロコシの飼育ケージに移します。目に見える表現型を持つ注射者が十分な数で回収された場合、これらの昆虫を別々にケージに入れて、次世代の標的形質の回復を最大化します。
必要に応じて新鮮なトウモロコシ植物に定期的に移して適切な温度と湿度の条件下で昆虫を飼育し、予想される表現型について子孫を定期的にスクリーニングし、目的の表現型を示す個体を自分のケージに入れてホモ接合系統を確立します。この代表的な分析では、4週間で合計645人の雌から合計6, 483個の卵子が採取されました。雌は通常、2日後に産卵を開始し、4日目から6日目にほとんどの卵子を提供し、産卵活動は9日目までに遅くなります。
Cas99インジェクションは、インジェクションバッファー、Cas9を添加したインジェクションバッファー、Cas9および3つのガイドRNAを添加したインジェクションバッファーで処理した胚の発生率が類似しているため、P.maidisの発生に影響を与えません。バッファ コントロールと Cas9 コントロールのハッチング レートも同様です。ただし、3つのガイドミックスを受けている個人の孵化率は、通常、比較的低くなります。
この代表的な実験では、発症した71人のガイド注射個体のうち、23人がある程度の色素喪失を示し、9人が孵化し、ノックアウト率が約30%になり、注射された個体から単離されたゲノムDNAから増幅されたPCR産物で観察されるように、3ガイドミックスは白い遺伝子座から約180塩基対を除去すると予想され、 また、それらの製品から生成された関連するシーケンスデータも含まれます。注射の外傷を最小限に抑えるために、斜めの針を使用することをお勧めします。注射後に胚が漏れているように見える場合は、より良い結果を得るために針先を調べてください。
継続的な練習は胚の生存率を高めます。今日まで、半翅目の生殖細胞系列の形質転換を説明する出版物はありません。しかし、我々はこのプロトコルを使用してCas9発現ウンカを作製した。
全体として、半翅目で生殖細胞系形質転換を行う能力は、幅広い遺伝的害虫管理戦略への扉を開き、それによって殺虫剤の使用を減らします。
