The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. Estructura del ensayo <ol><li> requisitos insectarias <ol><li> Mantener toda C. la vida capitata etapas a 25 ° C, 65% de humedad y 12/12 horas de luz / oscuridad fotoperíodo. </li><li> Poner alrededor de 1.500-2.000 pupas mosca de la fruta en una jaula de 6 l. Utilice una jaula con un latón de malla en un lado con orificios lo suficientemente pequeños como para estimular la oviposición 42. Inserte una tira de esponja a través de una pequeña abertura en la base de la jaula para proporcionar moscas con agua por medio de la acción capilar. Usar una mezcla de levadura y azúcar (1:10) como fuente de alimento para los adultos (Figura 1A). Aumentar la cantidad de levadura (hasta 1: 3, levadura: azúcar) deben dejar de las hembras ponen huevos. </li><li> Coloque un plato lleno de agua debajo de la caja para recoger los huevos depositados a través de la malla. Como hembras vírgenes pueden poner huevos, espere hasta que las moscas son al menos 6-7 días antes de la recogida de los huevos para los experimentos de microinyección. Esto asegurará que las hembras se han apareadoy que habrán sido fertilizado los huevos. </li><li> Recoger los huevos filtrando el agua con un colador de red fina. La transferencia de los huevos del colador en una caja de plástico que contiene alimentos larval estándar (1,5 LH 2 O, 100 ml de HCl 1%, 5 g de agente antimicrobiano de amplio espectro disolvió en 50 ml de etanol, 400 g de azúcar, 175 g de levadura de cerveza desmineralizada, 1 kg de salvado de trigo blando) utilizando una pipeta Pasteur. </li><li> Coloque cada caja en un recipiente transparente cerrado con una tapa de red para permitir la circulación de aire y que contiene una capa de salvado para favorecer la pupación (Figura 1B). </li><li> Después de 10 días, comprobar si hay 3º estadio las larvas que emergen de la comida de larvas y saltar hacia abajo en la capa de salvado de la fase de pupa. </li><li> 24 horas más tarde, recoger las pupas en una taza pequeña con un cepillo suave y transferirlos a una nueva jaula para adultos. Los adultos emergen normalmente 10 días después de la fase de pupa. La mosca emergente utiliza el ptilino, una bolsa inflable situada en su cabeza por encima de THe base de las antenas, para forzar el extremo de la pupa. Después de la emergencia, la ptilino colapsa de forma permanente al interior de la cabeza. </li></ol></li><li> Preparación de alimentos para las larvas L 1 microinyectados <ol><li> Disolver 2,5 g de agar en 300 ml de H2O </li><li> Caliente 500 ml H 2 O en una placa de agitación caliente y disolver 4 g Benzoato de sodio, 4,5 ml 37% de HCl, 42 g de extracto de levadura y 115 g de polvo de zanahoria deshidratada. </li><li> Añadir a la mezcla una solución de 2,86 g de agente antimicrobiano de amplio espectro disuelto en 10 ml de etanol absoluto. </li><li> Distribuir el medio en 15 cm redondas placas de Petri y se deja enfriar. Si es necesario, se almacena a 4 ° C. </li></ol></li><li> preparación de los portaobjetos <ol><li> Coloque una tira de 2 cm de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de microscopio (75 x 26 mm 2) y marcar los bordes con un marcador de porcelana, para evitar la propagación del petróleo y la consiguiente desecación de los embriones inyectados. </li></ol></li><li><strong&gt; nucleicos Preparación de ácido <ol><li> Aislar el plásmido de ADN usando kits disponibles en el mercado 34. Precipitar el plásmido utilizando etanol y resuspender en tampón de inyección (0.1 mM de tampón de fosfato de pH 7,4, KCl 5 mM) a la concentración deseada. </li><li> Purificar sintetizado in vitro a largo dsRNA utilizando fenol-cloroformo, precipitado con isopropanol y volver a suspender en tampón de inyección 43. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de embriones <ol><li> Colocar una bandeja llena de agua bajo una jaula que contiene los adultos 6-7 días de edad. </li><li> Permitir que las hembras ovipositaran durante 30 min y a continuación recogen los embriones mediante el filtrado de agua utilizando un colador fino. Siempre mantenga el colador en agua para evitar la desecación de los embriones. </li><li> Dechorionate los embriones sumergiéndola el filtro durante 5 s en una solución comercial blanqueador 50%. </li><li> Lavar cuidadosamente los embriones sumergiéndola repetidamente el colador en agua ultrapura limpia (al menos4-5 veces). Por último, colocar el filtro en agua ultrapura limpia. Usa los embriones en un máximo de 2 horas. NOTA: El momento de la microinyección se relaciona con la necesidad de inyectar en embriones pre-blastodermo, durante una fase de divisiones nucleares antes de cellularization. Esto permite que el ADN inyectado a ser tomado arriba en los núcleos, especialmente en los núcleos de células germinales primordiales que originan los gametos. En Drosophila, cellularization en las células de polos comienza a alrededor de 90 min después de la fertilización (a 25 ° C), con la formación de blastodermo se producen alrededor de 30 min más tarde 44, mientras que en el cellularization moscamed tiene lugar entre 9 y 12 hr 45,46. </li><li> La orientación del embrión en filas <ol><li> El uso de un pincel fino, reunir a cerca de 50 embriones y colocarlos en un disco de papel de filtro negro empapado con agua. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico de disección, disponer los embriones en una fila en la superficie superior de la cinta de doble cara enel portaobjetos de microscopio utilizando un pincel fino (000) (Figura 1C). NOTA: Alinear los embriones en la misma orientación, como la inyección se realiza en el polo posterior, en donde la línea germinal se originará; el polo posterior es opuesta a la región micropilo. </li><li> Cubrir los embriones con una capa de aceite clorotrifluoroetileno asegurándose de que el aceite no se derrame sobre China bordes de los marcadores (véase 1.3). NOTA: Antes de cubrir los embriones con aceite, un paso más allá se puede realizar: los embriones pueden ser desecados durante unos minutos para reducir su contenido de líquido y de este modo facilitar la entrada de la solución de ADN inyectado. Esto puede ayudar a evitar la rotura del embrión durante la inyección o la fuga excesiva de la solución inyectada, como una consecuencia de la alta presión del líquido. </li></ol></li></ol> La microinyección de embriones 3. <ol><li> Llenar una aguja (1-2 l) con ADN de plásmido o solución dsRNA (1-2 mg / l) utilizando una micropipeta. </li><li&gt; Conectar la aguja al aparato de microinyección, que controla el tiempo de inyección (0,5 seg), la presión (800 hPa) y la contrapresión (150 hPa). </li><li> Realizar la microinyección en un estereomicroscopio, usando un micromanipulador para controlar los movimientos de la aguja (Figura 1D). Utilice la platina del microscopio para mover la corredera. <ol><li> Colocar el portaobjetos en el escenario del alcance. </li><li> Inserte la punta de la aguja en el polo posterior del embrión (Figura 1E). </li><li> Se inyecta la solución mediante la activación del sistema de microinyección con el pedal. El líquido inyectado induce un aumento de la presión interna, lo que resulta en un ligero movimiento del embrión. </li><li> Suelte el pedal y de inmediato, pero con cuidado, retire la aguja del embrión. </li><li> Observar un derrame citoplasmática en el lugar de la inyección. NOTA: Para discriminar entre los posibles efectos letales de ADN / ARN de doble cadena / siRNA y la mortalidad debido a la pro microinyecciónprocedimiento en sí, los experimentos de control se deben realizar. Estos comprenden la inyección de tampón solamente, o, en el caso de experimentos de genética inversa, de una proteína verde fluorescente (GFP) -derivado ARN de doble cadena (dsRNA-GFP), o siRNA. </li></ol></li><li> Después de la inyección incubar los embriones a 25 ° C. </li></ol> 4. Procedimientos posteriores a la inyección <ol><li> Dos días después de la inyección, compruebe las diapositivas para la eclosión de larvas (Figura 1F) bajo un microscopio estereoscópico. Las larvas pueden mover en el aceite pero necesitan ser transferidos a la alimentación de las larvas tan pronto como sea posible. Por esta razón, comprobar las diapositivas varias veces al día. </li><li> El uso de un pincel fino (000), transferir suavemente la eclosión de larvas al alimento de las larvas a base de zanahoria. Transferir hasta un máximo de 200 larvas por cada placa de Petri. </li><li> Incubar las larvas en 65% de humedad (25 ° C). Asegúrese de que la tapa no se pega a la placa, impidiendo el intercambio de aire. </li><li> Mantener las placas de Petri con la tapaprincipalmente cerrado, así que todavía hay flujo de aire para las larvas. Para evitar el secado excesivo, revise los platos todos los días y, si es necesario, añadir agua para compensar la evaporación. </li><li> Colocar las placas de Petri en un recipiente transparente cerrado por una tapa de red y que contiene una capa de salvado para favorecer la pupación. En cuanto a la crianza de insectario rutina, 3 º estadio las larvas de saltar de la comida de larvas se transforman en crisálidas y en el salvado. </li><li> Recoger las pupas y colocarlos en una pequeña jaula para la cría de adultos y cribado (esto es la generación 0, G0). Trasera de la progenie alimento larval estándar. </li><li> En el caso de los experimentos de transformación de línea germinal, la verificación de posibles individuos transformados en la próxima generación (G1), como individuos inyectados por lo general son quimeras. eventos de transposición, de hecho, podrían haber ocurrido en cualquiera de los núcleos del sincitio embrionaria, que formarán ya sea la línea germinal o el soma. <ol><li> Poco después de la emergencia, anestesiar a los individuos G1 usando CO2 y comprobar si hay transformación eventos bajo un microscopio estereoscópico de epifluorescencia. Para detectar la presencia de fluorescencia roja, utilizar un filtro DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), mientras que para la detección de fluorescencia verde utilizar el filtro EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) . </li><li> Coloque individuos transformados en una pequeña jaula con los de tipo salvaje adultos del sexo opuesto y originar una nueva, en un principio heterocigóticos, cepa. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La microinyección de ácidos nucleicos en embriones de insectos es una técnica universal que facilita tanto el análisis de la función génica y aplicaciones biotecnológicas. La reciente publicación de las secuencias del genoma de un número creciente de especies de insectos conduce a una necesidad urgente de herramientas para la caracterización funcional de los genes de función aún desconocida. La interferencia del ARN ha demostrado ser uno de los métodos más valiosos para inferir...

La mosca mediterránea de la fruta (mosca de la fruta) Ceratitis capitata es una especie cosmopolita que daña ampliamente frutas y cultivos. Pertenece a la familia Tephritidae, que incluye varias especies de plagas, tales como los pertenecientes a los géneros Bactrocera y Anastrepha. La mosca de la fruta es la especie más estudiada de esta familia, y se ha convertido en un modelo no sólo para el estudio de las invasiones de insectos 1, sino también para la optimización de las estrategias de control de plagas 2. La mosca de la fruta es una especie multivoltina que pueden atacar a más de 300 especies de plantas silvestres y cultivadas 3,4. El daño es causado tanto por los adultos y los estadios larvarios: hembras apareadas perforan la superficie de la fruta para la oviposición, permitiendo que los microorganismos que afectan su calidad comercial, mientras que las larvas se alimentan de la pulpa de la fruta. Después de tres etapas larvales, las larvas emergen desde el host y se transforman en crisálidas en el suelo. Ceratitiscapitata muestra una distribución casi todo el mundo, incluyendo África, Oriente Medio, Australia Occidental, América Central y del Sur, Europa, y las áreas de los Estados Unidos 5. Las estrategias más comunes para limitar las infestaciones de mosca mediterránea implican el uso de insecticidas (por ejemplo, malatión, Spinosad) y la técnica del insecto estéril con el medio ambiente (SIT) 6. El último enfoque implica la liberación en el medio natural de cientos de miles de machos estériles prestados por la exposición a la radiación ionizante. El acoplamiento de tales machos esterilizados a hembras silvestres da lugar a ninguna progenie, causando una reducción en tamaño de la población, llevando eventualmente a la erradicación. Aunque SIT ha demostrado su eficacia en múltiples campañas en todo el mundo, sus principales desventajas incluyen los altos costos de la crianza y la esterilización de millones de insectos para ser lanzado. Marcado de los individuos liberados es necesario distinguir estéril de los insectos salvajes capturados en el campo duranteseguimiento de las actividades y en la actualidad se consigue utilizando polvos fluorescentes. Estos procedimientos son costosos y tienen efectos secundarios indeseables 7. Con el fin de optimizar y / o para desarrollar enfoques más eficaces para el control de esta plaga, la biología y la genética mosca de la fruta han sido ampliamente explorado por numerosos investigadores de todo el mundo. La disponibilidad de la secuencia del genoma de moscamed 8,9, facilitará nuevas investigaciones sobre funciones de genes. La interferencia de ARN es una poderosa herramienta para tales estudios y se puede lograr a través de la microinyección de dsRNA (RNA de doble cadena) o siRNA (ARN interferente pequeño). Esta técnica se ha utilizado, por ejemplo, para demostrar que la cascada molecular determinación del sexo en C. capitata se conserva sólo en parte con respecto a la de Drosophila 10. El desarrollo de protocolos para microinyectar embriones de mosca mediterránea permitidos C. capitata para ser el primer noespecies de moscas -Drosophilid a ser modificados genéticamente. Como sus huevos son similares a las de Drosophila, tanto en términos de morfología y la resistencia a la desecación 11, el protocolo para administrar ADN de plásmido en los embriones pre-blastoderm desarrollados primero por D. 12,13 melanogaster fue adaptado inicialmente para su uso en C. capitata. Estos primeros experimentos permitieron la transformación de la línea germinal mosca mediterránea basada en el elemento de transposición Minos 11. Posteriormente, el sistema original fue modificado 14 usando otros enfoques basados en transposón. Este es el caso de piggyBac de los lepidópteros Trichoplusia ni 15. El protocolo ya ha sido optimizado, lo que ha permitido la transformación de otras especies -tephritidae- 16-21 y también de muchos otros dípteros 22-31. Todos estos sistemas se basan en el uso de un sistema de transformación de plásmido binario típico vector / ayudante: artificial, transpo defectuosohijos que contienen los genes deseados se ensamblan en el ADN plásmido y se integran en el genoma del insecto mediante el suministro de la enzima transposasa 32. Una serie de líneas de mosca mediterránea transgénicas se han generado, con múltiples funciones que incluyen cepas que portan un gen letal dominante condicional que induce letalidad, cepas que producen sólo para hombres progenie y lo que no requiere de estrategias de sexado adicionales, y las cepas con espermatozoides fluorescente, lo que puede aumentar la precisión de la fase de seguimiento SIT 33-37. A pesar de la liberación en el medio natural de los organismos transgénicos se ha producido en las pruebas piloto contra los mosquitos solamente 38,39, al menos una compañía está evaluando una serie de cepas de mosca mediterránea transgénicos para su uso en el campo 40. microinyección de embriones también puede favorecer el desarrollo de nuevas herramientas de edición de genoma, tales como nucleasas de transcripción activador de efectores (Talens), agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / CRISPR proteína asociada 9 nucleasa (Cas9) y la vivienda de endonucleasas genes (HEGs), lo que permitirá nuevos estudios evolutivos y de desarrollo, así como la expansión de la caja de herramientas biotecnológicas disponibles. Enfoques de edición de genoma que ya permitió la generación de sistemas de genes sin conductor en mosquitos 41, y su transferencia a la mosca de la fruta es inminente. Aquí se describe un protocolo universal para la microinyección de ácidos nucleicos en embriones de mosca mediterránea que pueden ser útiles para todas las aplicaciones antes mencionadas.

<table><tbody><tr><td>1 x injection Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5&amp;nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Phenol-Chloroform purified</td></tr><tr><td>Standard Larval food</td><td></td><td></td><td>1.5 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50&amp;nbsp;ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#039;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td></tr><tr><td>Carrot Larval Food</td><td></td><td></td><td>2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86&amp;nbsp;g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L</td></tr><tr><td>Adult Food</td><td></td><td></td><td>yeast extract and sugar (1:10)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Injection needles&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Double slided tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Black circle paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 before use</td></tr><tr><td>Paintbrush (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Adult cages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrifluoroethylene oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ceratitis capitata&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The strain used is ISPRA</td></tr></tbody></table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

La mosca mediterránea de la fruta (mosca de la fruta) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) es una especie de plaga con extremadamente alta relevancia agrícola. Esto es debido a su comportamiento reproductivo: las hembras dañan la superficie externa de las frutas y verduras cuando se ponen los huevos y las larvas se alimentan tramado en su pulpa. Salvaje C. poblaciones capitata se controlan tradicionalmente a través de la aplicación de insecticidas y / o enfoques ecológicos, siendo el más exitoso de la técnica del insecto estéril (TIE). El SIT se basa en la cría en masa, la esterilización basada en la radiación y la liberación campo de los hombres que retienen su capacidad para aparearse pero no son capaces de generar progenie fértil. El advenimiento y la subsiguiente rápido desarrollo de herramientas biotecnológicas, junto con la disponibilidad de la secuencia del genoma de la mosca mediterránea, ha impulsado en gran medida nuestra comprensión de la biología de esta especie. Esto favoreció la proliferación de nuevas estrategias para la manipulación del genoma, que can aplicarse a control de la población. En este contexto, la microinyección de embriones juega un doble papel en la expansión de la caja de herramientas para el control de la mosca mediterránea. La capacidad de interferir con la función de los genes que regulan los procesos biológicos claves, en efecto, expande nuestra comprensión de la maquinaria molecular que subyace a la invasividad de moscamed. Además, la capacidad para lograr la transformación de la línea germinal facilita la producción de múltiples cepas transgénicas que pueden ser probados para futuras aplicaciones en el campo de nuevos ajustes SIT. De hecho, la manipulación genética se puede utilizar para conferir rasgos deseables que pueden, por ejemplo, ser utilizados para monitorear el desempeño de los machos estériles en el campo, o que puede dar lugar a letalidad primeras fases de vida. Aquí se describe un método para microinyectar ácidos nucleicos en embriones de mosca mediterránea de alcanzar estos dos objetivos principales.

Aquí mostramos dos aplicaciones de la microinyección de embriones dirigida a la caracterización funcional de un gen de interés (caso 1), y en la generación de cepas transgénicas (Caso 2), respectivamente. Entrega de ARN de doble cadena en embriones de desentrañar la función de genes. El gen innexin-5 codifica una brecha de unión que, en los insecto...

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K vistas.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Asistida por láser citoplasmática microinyección en el ganado cigotos

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Investigación

Genética

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Biología del Desarrollo

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Medio ambiente

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bioingeniería

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Microinyección de saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, embriones para la edición del genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Un método para la microinyección de<em&gt; Patiria minata</em&gt; Los cigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Biología

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,

Resumen

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