The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. Experimenteller Aufbau <ol><li> Insectary Anforderungen <ol><li> Pflegen Sie alle C. capitata Lebensphasen bei 25 ° C, 65% Luftfeuchtigkeit und 12.12 h Hell / Dunkel - Lichtperiode. </li><li> Jeweils etwa 1.500-2.000 Mittelmeerfruchtfliege Puppen in einem 6 L Käfig. Verwenden Sie einen Käfig mit einem Messingnetz auf der einen Seite mit Löchern klein genug , um die Eiablage 42 zu stimulieren. Setzen Sie einen Schwamm Streifen durch eine kleine Öffnung in der Basis Käfig fliegt mit Wasser mittels Kapillarwirkung zu liefern. Verwenden Sie eine Mischung aus Hefe und Zucker (1:10) als Nahrungsquelle für die Erwachsenen (1A). Erhöhen Sie die Menge an Hefe (bis zu 1: 3, Hefe: Zucker) sollten die Weibchen nicht Eier zu legen. </li><li> Legen Sie eine Platte mit Wasser unter dem Käfig gefüllt, um die Eier zu sammeln durch das Sieb aufgebracht. Als jungfräulichen Weibchen Eiablage kann, warten Sie, bis die Fliegen mindestens 6-7 Tage alt sind, bevor Eier für die Mikroinjektionsexperimente zu sammeln. Dadurch wird sichergestellt, dass die Weibchen gepaart habenund dass die Eier befruchtet worden sind. </li><li> Sammeln Sie die Eier durch Filtern des Wassers mit einem feinen Netz Sieb. Übertragen Sie die Eier aus dem Sieb in einer Kunststoff - Box Standard Larvenfutter enthält (1,5 LH 2 O, 100 ml HCl 1%, 5 g Breitspektrum antimikrobielle Mittel in 50 ml Ethanol gelöst, 400 g Zucker, 175 g entmineralisiertes Bierhefe, 1 kg Weichweizenkleie) mit einer Pasteurpipette. </li><li> Legen Sie jedes Feld in einem transparenten Behälter mit einem Netto-Deckel geschlossen Luftzirkulation zu ermöglichen , und eine Schicht aus Kleie enthält , zu begünstigen Verpuppung (1B). </li><li> Nach etwa 10 Tagen, überprüfen 3. Larvenstadium , die aus der Larvenfutter entstehen und springen nach unten in die Kleie - Schicht für Verpuppung. </li><li> 24 Stunden später, sammeln die Puppen in einer kleinen Tasse mit einer weichen Bürste und sie zu einem neuen erwachsenen Käfig übertragen. Erwachsene entstehen normalerweise 10 Tage nach der Verpuppung. Die sich abzeichnende Fliege verwendet die ptilinum, eine aufblasbare Tasche befindet sich auf den Kopf über the Basis der Antennen, um das Ende des Puparium zu zwingen, aus. Nach dem Auftauchen kollabiert die ptilinum permanent im Inneren des Kopfes zurück. </li></ol></li><li> Herstellung von 1 L Nahrung für mikroinjizierten Larven <ol><li> Man löst 2,5 g Agar in 300 ml H 2 O. </li><li> Warm 500 ml H 2 O auf einer heißen Rührplatte und lösen 4 g Natriumbenzoat, 4,5 ml 37% HCl, 42 g Hefeextrakt und 115 g dehydrierte Karotten Pulver. </li><li> In dem Gemisch eine Lösung von 2,86 g Breitspektrum aufgelöst antimikrobielles Mittel in 10 ml absolutem Ethanol. </li><li> das Medium in 15 cm runden Petrischalen verteilen und abkühlen lassen. Falls erforderlich, lagern bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Slide Vorbereitung <ol><li> Legen Sie eine 2 cm Streifen doppelseitiges Klebeband auf einem Objektträger (75 x 26 mm 2) und die Ränder mit einem China - Marker markieren, um Öl Ausbreitung und die daraus folgende Austrocknung der injizierten Embryonen verhindern. </li></ol></li><li><strong&gt; Nukleinsäure-Vorbereitung <ol><li> Isolieren Plasmid - DNA im Handel erhältlichen Kits 34 verwendet wird . Auszufällen, das Plasmid unter Verwendung von Ethanol und resuspendieren in Injektionspuffer (0.1 mM Phosphatpuffer pH 7,4, 5 mM KCl) in der gewünschten Konzentration. </li><li> Reinige in vitro synthetisierte lange dsRNA Phenol-Chloroform, ausfällen Isopropanol und resuspendieren in Injektionspuffer 43. </li></ol></li></ol> 2. Embryo Vorbereitung <ol><li> Legen Sie ein Tablett mit Wasser unter einem Käfig gefüllt, die 6-7 Tage alte Erwachsene. </li><li> Lassen Sie die Frauen für 30 min bis Eiablage und dann die Embryonen sammeln durch Filtern des Wassers ein feines Sieb mit. Halten Sie das Sieb in Wasser Austrocknung der Embryonen zu vermeiden. </li><li> Dechorionate die Embryonen, die durch das Sieb für 5 Sekunden immerging in einer handelsüblichen 50% igen Bleichlösung. </li><li> Waschen Sie die Embryonen vorsichtig durch wiederholtes das Sieb in sauberen Reinstwasser immerging (zumindest4-5 mal). Schließlich legen Sie das Sieb in saubere Reinstwasser. Verwenden Sie die Embryonen innerhalb von maximal 2 Stunden. HINWEIS: Die Zeitsteuerung der Mikroinjektion ist die Notwendigkeit verwandten in vorge blastoderm Embryonen zu injizieren, während einer Phase der Kernteilungen vor Zellularisierung. Auf diese Weise können die injizierte DNA in die Kerne aufgewickelt zu werden, und zwar in die Ur-Keimzellkerne, die die Gameten stammen werden. In Drosophila beginnt Zellularisierung am Pol - Zellen bei etwa 90 min nach der Befruchtung (bei 25 ° C), mit blastoderm Bildung ca. 30 min später 44 auftritt, während in der Mittelmeerfruchtfliege Zellularisierung zwischen 9 und 12 Stunden 45,46 erfolgt. </li><li> Embryo Orientierung in Reihen <ol><li> Mit einem feinen Pinsel, sammeln etwa 50 Embryonen und legen Sie sie auf einer Platte aus schwarzem Filterpapier mit Wasser getränkt. </li><li> Unter einem Sezieren Stereomikroskop, ordnen Sie die Embryonen in einer Reihe auf der oberen Fläche des doppelseitigen Klebeband aufdas Mikroskop - Objektträger einen feinen Pinsel (000) (Abbildung 1C) verwendet wird . HINWEIS: Richten Sie die Embryonen alle in der gleichen Ausrichtung, wie Injektion in den hinteren Pol durchgeführt wird, wo Keimbahn entstehen wird; die hinteren Pol ist mit dem Mikropyle Bereich gegenüber. </li><li> Decken Sie die Embryonen mit einer Schicht aus Chlortrifluorethylen Öl, sicherzustellen, dass das Öl überschwappen nicht Porzellan Marker Grenzen (siehe 1.3). Hinweis: Vor dem Abdecken der Embryonen mit Öl, kann ein weiterer Schritt durchgeführt werden: die Embryonen können für ein paar Minuten getrocknet werden, um ihre Flüssigkeitsgehalt zu reduzieren und damit den Eintritt der injizierten DNA-Lösung erleichtern. Dies kann helfen, embryo Platzen während des Einspritzens oder übermäßiger Leckage des eingespritzten Lösung, als Folge des hohen Flüssigkeitsdruck vermeiden. </li></ol></li></ol> 3. Embryo Mikroinjektions <ol><li> Füllen Sie eine Nadel (1-2 ul) mit Plasmid-DNA oder dsRNA-Lösung (1-2 ug / ul) mit einer Mikropipette. </li><li&gt; Verbinden der Nadel mit dem Mikroinjektionsvorrichtung, die die Einspritzzeit (0,5 s) steuert, wobei der Druck (800 hPa) und der Gegendruck (150 hPa). </li><li> Führen Mikroinjektions unter einem Stereomikroskop, ein Mikromanipulator mit Hilfe der Bewegungen der Nadel (Figur 1D) zu steuern. Verwenden Sie den Mikroskoptisch, um den Schlitten zu bewegen. <ol><li> Platzieren Sie den Schieber auf der Bühne des Umfangs. </li><li> Legen Sie die Spitze der Nadel in den hinteren Pol des Embryos (Abbildung 1E). </li><li> Injizieren Sie die Lösung durch das Mikroinjektionssystem mit dem Pedal zu aktivieren. Die injizierte Flüssigkeit induziert einen Anstieg des Innendrucks, was zu einer leichten Bewegung des Embryos. </li><li> Lassen Sie das Pedal und sofort, aber vorsichtig, entfernen Sie die Nadel aus dem Embryo. </li><li> Beobachten etwas zytoplasmatischen Leckage an der Injektionsstelle. HINWEIS: Um zwischen potentiellen tödlichen Wirkungen von DNA / dsRNA / siRNA und Mortalität aufgrund der Mikroinjektions pro diskriminierenverfahren selbst müssen Kontrollexperimente durchgeführt werden. Diese umfassen die Injektion von Puffer allein, oder, im Fall der reversen Genetik Experimenten eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) abgeleitetes doppelsträngige RNA (dsRNA-GFP) oder siRNA. </li></ol></li><li> Nach der Injektion inkubieren die Embryonen bei 25 ° C. </li></ol> 4. Post-Injektionsverfahren <ol><li> Zwei Tage nach der Injektion, überprüfen Sie die Folien für geschlüpften Larven (1F) unter einem Stereomikroskop. Die Larven können in der Öl bewegen, aber so schnell wie möglich zu Larvenfutter übertragen werden müssen. Aus diesem Grund überprüfen Sie die Folien mehrmals täglich. </li><li> Mit einem feinen Pinsel (000), sanft übertragen die geschlüpften Larven auf die Karotte-basierte Larvenfutter. Übertragen Sie bis zu einem Maximum von 200 Larven pro jeder Petrischale. </li><li> Inkubiere die Larven bei 65% Luftfeuchtigkeit (25 ° C). Stellen Sie sicher, dass der Deckel nicht an der Schale kleben bleibt, beeinträchtigt den Luftaustausch. </li><li> Halten Sie die Petrischalen mit Deckelgeschlossen meist so, dass es noch den Luftstrom zu den Larven ist. Um eine übermäßige Trocknung zu vermeiden, überprüfen die Gerichte täglich und bei Bedarf, Wasser für die Verdunstung zu kompensieren. </li><li> Legen Sie die Petrischalen in einem durchsichtigen Behälter mit einem Netz-Deckel geschlossen und eine Schicht aus Kleie enthält Verpuppung zu begünstigen. Als für die Routine Insektarium Aufzucht, 3. Larvenstadium Sprung aus dem Larvenfutter und in der Kleie verpuppen. </li><li> Sammeln Sie die Puppen und legen Sie sie in einem kleinen Käfig für erwachsene Aufzucht und Screening (dies ist Generation 0, G0). Hinten die Nachkommen auf Standard-Larvenfutter. </li><li> Im Falle von Transformationsexperimente Keimbahn, überprüfen Sie mögliche transformierte Individuen in der nächsten Generation (G1), als Individuen in der Regel injiziert Chimären sind. Trans Ereignisse, ja vielleicht in einem der Kerne der embryonalen syncytium aufgetreten sind, die entweder die Keimbahn oder die soma bilden. <ol><li> Bald nach dem Auflaufen, CO 2 mit G1 Personen betäuben und prüfen , ob transformationen Veranstaltungen unter einem Epifluoreszenz-Stereomikroskop. Um auf das Vorhandensein von roten Fluoreszenz-Bildschirm, verwenden Sie einen DsRedwide Filter (Ext 546/12;.. Emm 605/75), während auf Bildschirm für grüne Fluoreszenz verwenden, um die EYFP Filter (Ext 500/20;.. Emm 535/30) . </li><li> Platzieren Sie verwandelt Menschen in einem kleinen Käfig mit Wildtyp Erwachsenen des anderen Geschlechts und ihren Ursprung einer neuen, zunächst heterozygot, Stamm. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Mikroinjektion von Nucleinsäuren in Insekten Embryonen ist ein universelles Verfahren, das sowohl die Analyse der Genfunktion und biotechnologischen Anwendungen erleichtert. Die jüngste Veröffentlichung der Genomsequenzen von einer zunehmenden Anzahl von Insektenarten führt zu einem dringenden Bedarf an Werkzeugen für die funktionelle Charakterisierung von Genen von noch unbekannter Funktion. RNA-Interferenz ist eine der wertvollsten Methoden erwiesen abzuleiten molekularen Funktionen <...

Die Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis) Ceratitis capitata ist eine kosmopolitische Arten , die ausgiebig Schäden Früchte und Kulturpflanzen. Es gehört zur Familie Tephritidae, die zu den Gattungen Bactrocera und Anastrepha gehör mehrere Schädlingsarten, wie diejenigen einschließt. Die Mittelmeerfruchtfliege ist die am meisten untersuchten Arten dieser Familie, und es hat sich zu einem Modell nicht nur für die Untersuchung von Insekten Invasionen 1, aber auch 2 für die Optimierung von Pflanzenschutzstrategien geworden. Die Mittelmeerfruchtfliege ist ein multivoltine Arten , die mehr als 300 Arten von Wild angreifen kann und Kulturpflanzen 3,4. Der Schaden wird sowohl durch die Erwachsenen und die Larvenstadien: begattete durchdringen die Oberfläche der Frucht für die Eiablage, so dass Mikroorganismen ihre Handelsqualität zu beeinflussen, während die Larven ernähren sich von dem Fruchtfleisch. Nach drei Larvenstadien, Larven aus dem Wirt entstehen und in den Boden verpuppen. Ceratitiscapitata zeigt eine nahezu weltweite Verbreitung, einschließlich Afrika, dem Nahen Osten, Westaustralien, Mittel- und Südamerika, Europa und Gebieten der Vereinigten Staaten von Amerika 5. Die am häufigsten verwendeten Strategien Mittelmeerfruchtfliege parasitäre Erkrankungen zu begrenzen , die Verwendung von Insektiziden (zB Malathion, Spinosad) und die umweltfreundliche Sterile Insect Technique (SIT) 6 beinhalten. Der zweite Ansatz beinhaltet die Freisetzung in die Wildnis von Hunderttausenden von Männern gegenüber ionisierender Bestrahlung steril durch Belichtung gemacht. Die Paarung solcher sterilisierten Männchen zu wilden Weibchen führt zu keiner Nachkommen, eine Verringerung der Bevölkerungsgröße zu verursachen, was schließlich zu Ausrottung führen. Obwohl hat SIT weltweit in mehreren Kampagnen bewährt, sind seine größten Nachteile die hohen Kosten für die Aufzucht und Millionen von Insekten Sterilisation freigesetzt werden. Kennzeichnung von freigesetzten Individuen zu unterscheiden, steril von wilden Insekten im Bereich nicht erfasst währendÜberwachung der Aktivitäten und wird derzeit unter Verwendung von fluoreszierenden Pulver erreicht. Diese Verfahren sind teuer und haben unerwünschte Nebenwirkungen 7. Um zu optimieren und / oder wirksamer Ansätze für die Kontrolle dieses Schädlings, der Mittelmeerfruchtfliege Biologie und Genetik zu entwickeln, wurde von zahlreichen Forschern weltweit weit erforscht. Die Verfügbarkeit der Mittelmeerfruchtfliege Genomsequenz 8,9, werden neue Untersuchungen an Genfunktionen erleichtern. RNA-Interferenz ist ein leistungsfähiges Werkzeug für solche Studien, und es kann durch die Mikroinjektion von dsRNA (doppelsträngige RNA) oder siRNA (small interfering RNA) erreicht werden. Diese Technik ist verwendet worden, zum Beispiel, dass die Geschlechtsbestimmung Molekular cascade in C. demonstrieren capitata nur teilweise gegenüber derjenigen von 10 Drosophila konserviert. Die Entwicklung von Protokollen Mittelmeerfruchtfliege Embryonen microinject C erlaubt capitata die erste nicht zu sein-Drosophilid Fliegenarten genetisch modifiziert werden. Als seine Eier ähnlich denen von Drosophila, sowohl in Bezug auf Morphologie und Widerstand sind 11 bis Desikkation, um das Protokoll Plasmid DNA in vorge blastoderm Embryonen liefern zunächst D. entwickelt melanogaster 12,13 zunächst wurde für den Einsatz in C angepasst capitata. Diese ersten Experimente Mittelmeerfruchtfliege Keimbahntransformation erlaubt basierend auf dem Transposon - Element Minos 11. Unter Verwendung anderer Transposon-basierte Ansätze Anschließend wurde das ursprüngliche System 14 modifiziert. Dies ist der Fall von piggyBac aus der Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Das Protokoll wurde seit weiter optimiert und dadurch die Transformation anderer Tephritiden Spezies 16-21 und auch von vielen anderen Diptera 22-31 erlaubt hat. Alle diese Systeme beruhen auf der Verwendung eines typischen binären Vektor / Helferplasmid Transformationssystem: artificial, defekte transpoSöhne gewünschten Gene enthalten , werden in das Plasmid DNA zusammengesetzt und in das Genom des Insekten integriert , indem das Transposase - Enzym 32 liefert. Eine Reihe von transgenen Mittelmeerfruchtfliege Linien wurden mit mehreren Funktionen, einschließlich Stämmen erzeugt, eine bedingte dominant-letale Gen trägt, die Letalität induziert, Stämme produzieren nur für Männer Nachkommen und erfordern somit keine zusätzlichen sexing Strategien und Stämme mit fluoreszierenden Spermien, was die Genauigkeit verbessern kann der SIT Überwachungsphase 33-37. Obwohl die Freisetzung in der Wildnis von transgenen Organismen in Pilotversuchen gegen Mücken aufgetreten ist nur 38,39 mindestens ein Unternehmen im Bereich 40 eine Reihe von transgenen Mittelmeerfruchtfliege Stämme für ihre Verwendung zu bewerten. Embryo Mikroinjektions kann auch die Entwicklung von neuen genom Editing-Tools, wie zum Beispiel Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens), gruppierten regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom wiederholt (CR favorisierenISPR) / CRISPR associated protein 9 Nuklease (Cas9) und Homing-Endonukleasen Gene (HEG), die neue evolutionäre und Entwicklungsstudien ermöglichen wird, sowie die zur Verfügung stehende biotechnologische Toolbox erweitert. Genom-Bearbeitung Ansätze erlaubt bereits die Erzeugung von Gen-Antriebssysteme in Stechmücken 41, und deren Übertragung auf die Mittelmeerfruchtfliege steht unmittelbar bevor. Hier beschreiben wir ein universelles Protokoll für Mikroinjizierung Nukleinsäuren in der Mittelmeerfruchtfliege Embryonen, die nützlich für alle Anwendungen der oben genannten sein kann.

<table><tbody><tr><td>1 x injection Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5&amp;nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Phenol-Chloroform purified</td></tr><tr><td>Standard Larval food</td><td></td><td></td><td>1.5 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50&amp;nbsp;ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#039;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td></tr><tr><td>Carrot Larval Food</td><td></td><td></td><td>2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86&amp;nbsp;g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L</td></tr><tr><td>Adult Food</td><td></td><td></td><td>yeast extract and sugar (1:10)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Injection needles&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Double slided tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Black circle paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 before use</td></tr><tr><td>Paintbrush (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Adult cages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrifluoroethylene oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ceratitis capitata&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The strain used is ISPRA</td></tr></tbody></table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

Die Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) ist eine Schädlingsarten mit extrem hohen landwirtschaftlichen Relevanz. Dies ist aufgrund seiner Fortpflanzungsverhalten: Frauen die äußere Oberfläche von Obst und Gemüse beschädigen, wenn sie Eier und die geschlüpften Larven ernähren sich von ihren Zellstoff lag. Wilde C. capitata Populationen werden traditionell durch Insektizid kontrolliert Spritzen und / oder umweltfreundliche Ansätze, die erfolgreichste ist die Sterile Insect Technique (SIT). Die SIT setzt auf Massenerziehung, strahlungsbasierte Sterilisation und Feld Freisetzung von Männern, die ihre Fähigkeit behalten, sich zu paaren, sind aber nicht in der Lage fruchtbare Nachkommen zu erzeugen. Das Aufkommen und die anschließende rasante Entwicklung biotechnologischer Werkzeuge, zusammen mit der Verfügbarkeit der Mittelmeerfruchtfliege Genomsequenz hat verstärkt unser Verständnis der Biologie dieser Spezies. Dies begünstigt die Verbreitung von neuen Strategien für die Genom Manipulation, die can Bevölkerungskontrolle angewendet werden. In diesem Zusammenhang spielt Embryo Mikroinjektions eine doppelte Rolle in der Toolbox für Mittelmeerfruchtfliege Steuerung erweitert. Die Fähigkeit, mit der Funktion von Genen zu stören, die wichtige biologische Prozesse regulieren, in der Tat, erweitert unser Verständnis der molekularen Maschinen der Mittelmeerfruchtfliege Invasivität zugrunde liegen. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit Keimbahntransformation zu erreichen, um die Produktion von mehreren transgenen Stämme, die für zukünftige Anwendungen im Bereich neuen SIT Einstellungen getestet werden können. Tatsächlich kann die genetische Manipulation verwendet werden, um gewünschte Eigenschaften zu verleihen, die können zum Beispiel verwendet werden, sterile männliche Leistung auf dem Gebiet zu überwachen, oder dass in frühen Lebensphasen Letalität führen kann. Hier beschreiben wir eine Methode Nukleinsäuren in der Mittelmeerfruchtfliege Embryonen microinject diese beiden Hauptziele zu erreichen.

Hier berichten wir über zwei Anwendungen von Embryo Mikroinjektions an der funktionellen Charakterisierung eines Gens von Interesse (Fall 1) gerichtet ist, und bei der Erzeugung transgener Stämme (Fall 2) sind. Lieferung von dsRNA in Embryonen Genfunktion zu entwirren. Das innexin-5 - Gen kodiert für ein Spalt-Übergang, die in Insekten, exprimiert wird ...

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K Aufrufe.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Forschung

Genetik

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Entwicklungsbiologie

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

RNA-Interferenz in Wasserkäfern als leistungsstarkes Werkzeug zur Manipulation der Genexpression an bestimmten Entwicklungszeitpunkten

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Umwelt

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Biotechnik

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Biologie

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,

Zusammenfassung

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