This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citt&#224; della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

すべての手順は、イタリアの法律に従いました。マウスAFサンプルをGFPと呼ばれるC57BL / 6-Tgの（UBC-GFP）30Scha / Jマウスからの13.5日後交尾（DPC）で妊娠したマウスから採取しました。 1.トランスポゾン生産注：トランスポゾン発現ベクターは、標準的なクローニング手順を用いて作製しました。マウスAF細胞のトランスフェクション用のプラスミドDNAを、市販のキットを用いて調製しました。 <ol><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内DH5α細菌の50μlのプラスミドDNAの10 ngのを混ぜます。 20分間氷上でマイクロ遠心チューブをインキュベートします。 </li><li> 40秒間42℃でヒートショック。 </li><li> 2分間氷上でマイクロ遠心チューブを置きます。 </li><li>予め温めた（37℃）LB培地（LB）培養液250μlのを追加します。 37℃で30分間（300 rpm）を振ります。 </li><li> 0.1mg / mlのアンピシリンを含むLBプレート上に各形質転換30μlのスプレッド。プレートを乾燥し、37°C​​ OVで反転インキュベート許可ernight。 </li><li>次の日は、午後に、各形質転換から、無菌の200μlのヒントを使用して、3個のコロニーを選択し、0.1mg / mlのLBアンプに転送します。 </li><li> 37℃で一晩（300 rpm）した細菌を振ります。 </li><li>プラスミド精製のための市販のキットを使用します。 -20℃でストックのプラスミド。 </li></ol> 2.マウス胎児線維芽細胞（MEF）の文化<ol><li> 0.1％ゼラチンで6ウェルプレートのコーティング <ol><li>フードの下コートプレートは、6つの各ウェルに滅菌0.1％のゼラチンを1ml加えます。ゼラチンを1時間インキュベーター（37℃）で重合してみましょう。 </li><li>過剰を捨てて、1時間、プレートを乾燥させます。 </li><li>室温でプレートを密封して保存するためにパラフィルムを使用してください。 </li></ol></li><li> マイトマイシンCとのMEFの不活化 <ol><li> 37℃の浴を用いて4×10 6のMEF細胞のバイアルを解凍します。 </li><li> MEF媒体とペトリ皿（150ミリメートル）上のフードにMEFをシード。 </li><li> 37℃で細胞を培養し、5％CO 2。 </li><li> （注意）細胞がコンフルエントであるマイトマイシンC（5 mg / mlで）を追加します。 </li><li> 3時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）に入れる細胞。 </li><li>マイトマイシンCで洗浄細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回培地を除去します。 </li><li> 5分間37℃のインキュベーターに商業トリプシンと場所細胞の2ミリリットルを追加します。後、トリプシン反応を停止するためにメディアをブロックする18ミリリットルを追加します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってburkerチャンバーを用いて細胞を数えます。 </li><li> 5分間、145×gで遠心分離した細胞。上清を捨てます。 </li><li>シード0.1％ゼラチンコーティングしたプレート上の不活性化MEFの60,000細胞/ cm 2。 </li><li> AFおよび/またはIPS-AF細胞を播種する前に、37℃で24時間、5％CO 2の細胞を養います。 </li></ol></li></ol> 3.マウスのAF細胞の単離<ol><li>時限交配を設定し、膣のPLUをチェック共同住宅の24時間後にGS。 </li><li> 13.5 DPCまで観察し、頸椎脱臼を通して妊娠中のダムを生け贄に捧げます。 </li><li> 70％エタノールを用いて動物の腹壁を清掃してください。 </li><li>はさみを使用して、腹腔内へのアクセスを得るために腹壁の長さを切開正中開腹術を行います。 </li><li>鉗子を使用して子宮を公開します。はさみを使用して子宮を取り出して、滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に移す氷上に置きました。 </li><li> 10X倍率でAFを収集するために実体顕微鏡を使用してください。 </li><li>鉗子で子宮を持ち、はさみで子宮壁を取り除きます。胎児膜およびその結果としての羊水漏れへの損傷を避けるように注意してください。 </li><li>滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に胎児を収集し、氷上に置きます。 </li><li>きれいな100ミリメートルペトリ皿に細かい点鉗子と場所との1胎児の胎盤をつかみます。 </li><li>細かい点の鉗子を使用してSAC卵黄を削除してください。 </li><li&gt;は細かい点の鉗子を使用して羊膜を破砕し、15ミリリットルコニカルバイアルにインスリン注射器を使用して、各胎児のためにAFの30μLを集めます。 </li><li> AF収集した後、1％ウシ胎児血清（FBS）を補充した滅菌1×PBSで各胎児を洗い、そして15ml中にAFを含有する円錐管を集めます。 </li><li> 5分間、145×gで遠心分離AF。ボンネットの下に上清を除去し、ペレット化したAF細胞を播種します。 </li></ol> 4.マウスのAF細胞培養<ol><li> マウスAF細胞の播種 <ol><li>ある日播種の前に、マイトマイシンC処理MEF 0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートを準備します。 </li><li> AF収集後、AF用培地を用いて（約1×10 7細胞を6胎児から得た）分裂不活性化MEFに羊水穿刺から得られた細胞を播種します。 </li><li> 37℃で細胞を培養し、5％CO 2、一日おきに培地を変えます。 </li><li>培養7日後、トランス以下の手順でfect AF細胞。 </li></ol></li></ol> 5.トランスフェクション、IPS-AF細胞の生成と文化注：マウスAF細胞（PB-CAG-rtTAの）トランスポゾンプラスミドトランスポザーゼ発現プラスミド（mPBase）と一緒に、逆テトラサイクリントランスアクチベーターで、PB-tetO2-IRES-OKMSトランスポゾンプラスミドでトランスフェクトしました。全てのプラスミドは、教授アンドラーシュナジ33によって提供されました。 <ol><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに：mPBase0.5μgのとPB-CAG-rtTAの（2μgのトータルDNA）の0.5μgのでPB-tetO2-IRES-OKMS1μgのを混ぜます。 </li><li>無血清培地で100μL（ - DMEMダルベッコ改変イーグル培地）にDNAを希釈します。 </li><li> DNAを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに：トランスフェクション試薬の8μL（ 例えば 、FUGENE）（8μLのトランスフェクション剤に2μgの（DNA）のトランスフェクション剤のプラスミドDNAの比で）を追加します。 </li><li>室温で15分間トランスフェクション試薬/ DNA混合物をインキュベートします。 </li><li> /ウェル2 mLの最終容量で、マウスのAF細胞と6ウェルプレートにウェル当たりトランスフェクション試薬/ DNA混合物の100μLを滴下添加して、静かに旋回することにより配布します。 24時間放置。 </li><li>翌日は、ドキシサイクリンの1.5μgの/ mLの（各ウェルのメディアの2ミリリットル）を補充した新鮮なのiPS-AF培地で細胞を供給することにより、山中の要因（Oct4の、Klf4の、CMYC、Sox2の）の発現を誘導します。 </li><li>新鮮なDOX含有培地（ポイント5.13までドキシサイクリンを補充した培地中で細胞を維持する）で、通過することなく、毎日の細胞を養います。 </li><li> mCherryを発現のために24時間以内に、毎日のコロニー形成（コロニーは、典型的には、トランスフェクション後20〜30日の間に表示される）のための細胞を観察します。 </li><li>一日コロニーピッキングの前に、マイトマイシンC処理したMEF 96ウェル組織培養プレートを準備します。 </li><li>ボリュームusinの50μLに、単一のコロニーをピックアップGA 200μLピペット、および個々のウェルで96ウェルプレートに順次転送します。 </li><li>翌日、商業トリプシンを50μl添加することによって、単一細胞にすべてのコロニーを解離し、37℃で5分間インキュベートします。 </li><li>コロニーを脱凝集するために上下にピペット。 </li><li>ドキシサイクリンを補充した新鮮なのiPS-AF媒体の100μLを充填した96ウェルプレートコーティングされた0.1％ゼラチンで不活性化MEFで新しいウェルに解離したコロニーを含むトリプシンの譲渡50μL。 </li><li>細胞60〜70％コンフルエンスに達すると、24ウェルプレートのウェルに分割。 </li><li>コロニーはドキシサイクリンなしの状態でも表示されるかどうかを確認するために2つの井戸、ドキシサイクリンなしのドキシサイクリンとの1および他に2：細胞が60から70パーセントコンフルエンスに達したら、1を分割します。 </li><li> IPS-AF媒体に不活性化MEFに、ドキシサイクリンの独立したiPS-AFクローンを、維持し続けます。 </li><li> 37℃、5％CO 2、CHで細胞を培養毎日培地をanging。 </li></ol> 6.アルカリホスファターゼ染色<ol><li>ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、製造業者のプロトコルに従って、アルカリホスファターゼ染色を実行します。 </li></ol> 7.免疫蛍光<ol><li>ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、不活性化MEF 24ウェルプレートのウェルに15万細胞/ cm 2を播種し、37℃、5％CO 2で48時間、細胞を増殖させます。 </li><li> （注意）を室温で15分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）のウェルあたり300μLを加えることにより細胞を固定してください。 </li><li>細胞を透過性にするために、0.1％NP-40の300μLを加えます。 </li><li> 0.1％PBS-Tweenで20300μlで細胞を洗浄。 </li><li>室温で1時間ブロッキング緩衝液（1×PBS中の10％ウマ血清）の300μlのを追加します。 </li><li> （1:10のOct4（1:80）、Sox2の（1:80）、Klf4の（1:80）、Nanogの次の一次抗体を使用して、0）およびSSEA1（1:80）。 1％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清でSSEA1を希釈し、0.3Mグリシン0.1％PBS-Tween-20を含みます。 1×PBS中の10％ウマ血清を持つすべての他の抗体を希釈します。 </li><li> 4℃で一晩抗体をインキュベートします。 </li><li> 0.1％PBS-Tween-20での300μlですすいでください。 </li><li> Alexa594結合ヤギ抗マウスIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ヤギIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ウサギIgGを1×PBS中の10％ウマ血清で希釈した二次抗体を使用し（1：200）、Alexa568結合ヤギ抗マウスIgM（1：200）。室温で2時間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSですすいでください。 </li><li> 1×PBS中：ヘキスト溶液（万1）で染色核。 </li></ol> インビトロ細胞分化8. <ol><li>ハンギングドロップ胚様体（EB）を形成するために、分化培地を使用して、ペトリ皿の蓋の上に単一の滴（2,000細胞/ 20μl）を養います。 </li><li> 37℃で皿をインキュベート4日間、5％CO 2。 </li><li>分化培地中で3日間懸濁培養100mmの細菌等級皿にEBSを移します。 </li><li>別の14日間（DMEMで1:10に希釈した）基底膜マトリックスでコーティングされた24ウェルプレート中にプレートしたEB。 </li><li> T（1：100）、αFP（1：200）とTubb3（1：500）37免疫蛍光分析のために、一次抗体を使用しています。 </li></ol> 9. インビボテラトーマ形成<ol><li> - / - γC - / -マウスRAG2の後肢の筋肉に1×10 6のiPS-AF細胞を含有する1×100μlのPBSを注入します。 </li><li> 6週間細胞注射後に頸椎脱臼を通してマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>以下の分析のためのマウスの後肢から、その大きさによって区別、腫瘍塊を除去します。 </li><li>クライオスタットを用いて、イソペンタン、凍結腫瘍の7-10μmの厚さの横断切片をカットします。 </li><li> ヘマトキシリンANのためのdはエオシン（HE）染色： <ol><li>製造業者のプロトコールに従って、腫瘍組織の組成を評価するためにHEで染色。 </li></ol></li><li> 免疫染色のために： <ol><li>室温で15分間、4％PFAでテラトーマのセクションを修正しました。 </li><li> 0.1％トリトンX-100で透過性。 </li></ol></li><li>以下の抗体を用いてインキュベートする：Tubb3（1：100）、αFP（1：50）およびαSMA（1：100）は、1×PBS中の1％BSAで希釈しました。 1（Tubb3用）37℃で時間または4℃で一晩（他の抗体用）インキュベートします。 </li><li> 20分間、100％メタノールを用いてペルオキシダーゼを遮断します。 </li><li>二次抗体抗マウスHRPコンジュゲート（150 1）を用いて37℃で45分間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSですすいでください。 </li><li> 5分間ペルオキシダーゼ（HRP）基板（ 材料表を参照してください）でインキュベートします。 </li><li> 5分間水道水ですすいでください。 </li><li> 9秒間ヘマトキシリンQSで染色。 </li><li>水道水ですすいでください。 </li></オール&gt; 細胞からの10 RNA抽出<ol><li>製造業者の推奨プロトコルに従って、商業用のRNA抽出キットを使用してください。 </li></ol>奇形腫から11 RNA抽出<ol><li>サンプルを解凍避けるために、乳棒と乳鉢および液体窒素を使用して奇形腫を均質化。 </li><li>組織25mgを秤量します。 </li><li> RNA抽出のための市販試薬1mLのクロロホルムの200μLを追加します。 </li><li> 5分間、室温でインキュベートします。 </li><li> 13,000×gで遠心分離し、15分間、4°C。 </li><li>新しいチューブにクリアして上清を移します。 </li><li> RNAは、製造業者のプロトコルに従って商用のRNA抽出キットを使用して精製しました。 </li></ol> 12.逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応分析<ol><li>逆転写（RT） - ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびオリゴ（dT）アコーために逆転写酵素を用いて第一鎖cDNAを合成製造業者のプロトコルに丁は、50 ngの/ cDNAのμLを得ました。 10 ngの/μLの濃度でRNaseフリー水を用いてcDNAを希釈します。 </li><li> cDNAの1 ngの/μLを利用し、製造業者のプロトコルに従って、DNAポリメラーゼを用いてRT-PCRを行います。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

多能性の誘導を得るために選択された方法は、長期移植に関して細胞臨床的安全性に関連します。今日では、再プログラミングに適したいくつかの方法があります。非組込み方法のうち、センダイウイルス（センダイウイルス）ベクターは、感染した細胞40の核内に統合することなく、タンパク質を大量に生産することができ、iPS細胞を得るための戦略であり得るRNAウイル?...

出生前診断は、遺伝性疾患（ すなわち染色体異常、単成または複成/多因子疾患）と先天性奇形（ すなわち先天性横隔膜ヘルニア、嚢胞性肺病変、臍帯ヘルニア、胃壁破裂）を評価するための重要な臨床的ツールです。羊水（AF）細胞（ すなわち 、羊水穿刺およびamnioreduction）または帝王切開1、2妊娠中期の間に定期的にスケジュールされた手順から取得するのは簡単です。出生前または新生児の患者からのAF細胞の利用可能性は、再生医療のためのこのソースを使用する可能性を提供し、いくつかの研究は、AF 3、4、5、6から単離された幹細胞集団を使用して、異なる組織の損傷または疾患を治療する可能性を検討しました、7、8、9、10、11、12。簡単に罹患した患者からのAF細胞を得る可能性は、疾患はしばしば静止している時間ウィンドウ内で、再プログラミングのために、この細胞源を使用するというアイデアに道を開きます。実際、AF細胞由来の人工多能性幹（iPS）細胞は、出産前の適切な患者特有の治療を製造するために、 インビトロでの薬物試験のために、または組織工学的アプローチのための目的の細胞に分化することができます。多くの研究は、既に細胞型13、14、15、16、17 &lt;広範囲に再プログラムと区別されるAF細胞の能力を実証しています/ SUP&gt;、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。 4転写因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）の強制発現を介して、再プログラミングされた体細胞の高橋と山中28によって発見されて以来、進展が再プログラミングの分野で行われています。異なる方法を考慮すると、我々は、ウイルスおよび非ウイルス性のアプローチを区別することができます。最初は、部分的に再プログラムされた細胞株の結果とのリスクの両方で、高効率レトロウイルス導入遺伝子の通常不完全なサイレンシングを有するウイルスベクター（レトロウイルスおよびレンチウイルス）の使用を想定し挿入突然変異29、30、31。 すなわちプラスミド、ベクター、mRNA、タンパク質、トランスポゾン：非ウイルス法は、異なる戦略を使用しています。トランスジェニック配列を含まiPS細胞の誘導は、漏出性導入遺伝子発現および挿入突然変異の潜在的に有害な影響を回避することを目指しています。上記の全ての非ウイルス戦略の中で、のpiggyBac（PB）トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは挿入または切除イベント32を触媒する導入遺伝子およびトランスポザーゼ酵素の一過性発現に隣接する唯一の逆方向末端反復を必要とします。 iPS細胞の生成のための他の方法を介してトランスポゾンを使用する利点は、レトロウイルスベクターの同じ効率を示す非ウイルスベクターアプローチとベクトルフリーiPS細胞を得る可能性があります。これはreprogrのための統合されたトランスポゾンエンコーディングのトレースレス切除することにより可能ですiPS細胞33内のトランスポザーゼの新たな一過性の発現以下の要因をamming。 PBは、異なる細胞型34、35、36、37に効率的であることを考えると、ウイルスベクターに対する臨床的アプローチに適している、および生体異物を使用し、現在のウイルス産生プロトコルに反して異種非含有のiPS細胞の産生を可能にします条件は、このシステムは、マウスAFからiPS細胞を得るために使用されます。 ここでは、マウスのAF細胞（IPS-AF細胞）38からの多能性のiPSクローンの生産を表示するには、すでに発表された研究を、以下の詳細なプロトコルを提案します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Bacterial-grade Petri Dishes&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>For in vitro differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21043</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21468</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21442</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11005</td>
			<td>Secondary antibody (immunofluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase kit&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85L1</td>
			<td>Alkaline Phosphatase&#160; staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>For bacterial selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DH5&#945; cells</td>
			<td rowspan="2">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">18265-017</td>
			<td rowspan="2">Bacteria for cloning procedure</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965039</td>
			<td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>For exogenous factors expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)&#160;</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>72.706</td>
			<td>For PB production&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES FBS&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10439024</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>For MEF medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>Dumont #5&#160;</td>
			<td>AF isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>131</td>
			<td>Used 0.1%, diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>For blocking solution. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin QS</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H3404</td>
			<td>Nuclei detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE&#160;</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>04-061010</td>
			<td>Histological analysis of teratoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nuclei detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc2005</td>
			<td>Secondary antibody (immunoperoxidase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT NovaRED&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4805</td>
			<td>Peroxidase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with needle (25G)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01H25161</td>
			<td>Amniocentesis procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klf4&#160;</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc-20691</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>For bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5158</td>
			<td>For mouse AF and iPS-AF cells medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>354234</td>
			<td>For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>Peroxidase blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTIWELL 24 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>For in vitro differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTIWELL 6 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog&#160;</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCAB0002P-F</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S2000</td>
			<td>For blocking solution. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12087-87-0</td>
			<td>For cell permeabilization. Diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Oct4</td>
			<td rowspan="2">SantaCruz</td>
			<td rowspan="2">sc-5279</td>
			<td rowspan="2">Mouse monoclonal IgG2b</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18418012</td>
			<td>For RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244</td>
			<td>PFA, fixative, diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14200-067</td>
			<td>D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150mm)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353025</td>
			<td>For MEF culture, tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiggyBac transposase expression plasmid&#160;</td>
			<td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td>mPBase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid</td>
			<td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td>PB-tetO2-IRES-OKMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12663</td>
			<td>For plasmids purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>For plasmids purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid&#160;</td>
			<td>Provided by professor Andras Nagy laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td>rtTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2&#160;</td>
			<td>SantaCruz</td>
			<td>sc-17320</td>
			<td>Goat polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16285</td>
			<td>Mouse monoclonal IgM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>For RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab20680</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10342020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Cell culture passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-047</td>
			<td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">TRIzol Reagent</td>
			<td rowspan="2">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">15596-026</td>
			<td rowspan="2">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Tubb3&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2">Promega&#160;</td>
			<td rowspan="2">G712A</td>
			<td rowspan="2">Mouse monoclonal IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>For cell permeabilization, diluted in PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;fp&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Mouse Monoclonal IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">&#945;SMA&#160;</td>
			<td rowspan="2">Abcam</td>
			<td rowspan="2">ab7817</td>
			<td rowspan="2">Mouse Monoclonal IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (FuGENE HD)</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>E2311</td>
			<td>For AF cells transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SM2645</td>
			<td>To perform amniocentesis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>70.760012</td>
			<td>To pick bacteria colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11 stainless 25U</td>
			<td>To perform amniocentesis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td>To clean the abdominal wall of the pregnant dam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture petri dish (150 mm)&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353025</td>
			<td>For MEF expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4287-2MG</td>
			<td>For MEF inactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULTIWELL 96 well plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353071</td>
			<td>For iPS-AF culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the production of pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells using a transposon system

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

再プログラミングの能力を評価するために、マウスAF細胞をGFPマウスの胎児から採取しました。細胞は、PB-（ドキシサイクリン誘導方法でmCherryを蛍光タンパク質に連結山中因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）を発現円形トランスポゾンプラスミドPB-tetO2-IRES-OKMSでトランスフェクション、およびテトラサイクリントランスを逆にしました。 CAG-のrtTA）トランスポザー...

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The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K ビュー.  Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza. In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. 

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Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

発生生物学

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...