The authors thank Bernd Krostitz for technical assistance, Radoslaw Kedzierski for initial contributions to the project, Erik Wade for proofreading and giving helpful comments, and Prof. Heike Walles for providing the bioreactor and sharing her valuable experience with organ decellularization. We are also thankful for funding of the project and publication by the Berlin University of Technology.

注：RLはLandesamtのfürお大事にウントSoziales（LaGeSo）からの器官の外植のための倫理的な承認を得ました。肝臓をウィスター系ラットから外植されました。下大静脈および肝臓の門脈は22 Gカニューレでカニューレを挿入しました。外植された肝臓の脱細胞化するための方法は、以前に記載されている。ここで使用される4,5、細胞外マトリックスは、1％デオキシコール酸ナトリウムでラット肝臓の過度の灌流により得ました。 ラット肝臓の細胞外マトリックス（ECM）の1.再細胞化<ol><li>肝細胞株HepG2の拡大<ol><li>培養ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）10％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、及びペニシリンの2mMのストレプトマイシン、それぞれを補充1640培地中で肝細胞癌細胞株HepG2。 </li><li> T175ボトル中1.5×10 7個の細胞を播種し、37℃、5％CO 2で細胞を成長させます</sub&gt;。 37℃、5％CO 2で5分間トリプシン処理により4日後に収穫細胞。 </li><li> 300×gで細胞をスピンダウンし、4 mlのPBSで再懸濁し、顕微鏡下でノイバウアー室で細胞を数えます。 One T175ボトルは、約4.5×10 7個の細胞が得られます。 注：文化はECMあたり6×10 8 HepG2細胞（4-5×10 8個の細胞それぞれに10×175cm 2の培養フラスコ）を持つラット肝臓ECMの再細胞化のために十分な細胞数が含まれていることを確認してください。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig1.jpg" /> 図1.バイオリアクターシステム。A）このバイオリアクターシステムは、カスタムメイドでした。これは、37℃、5％CO 2で、臓器モデルを維持します。蠕動ポンプの流量を個別に調整することができる。B）肝臓成長チャンバとの接続に配置されています蠕動ポンプ、媒体貯蔵、気泡トラップと圧力センサで構成されて灌流回路にエド。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li> ECMの再細胞化<ol><li>肝灌流チャンバー、灌流システム、媒体のリザーバと気泡トラップを含む、バイオリアクターシステムを設定します。バイオリアクターシステム（121℃、15分）を滅菌します。 </li><li>蠕動ポンプでバイオリアクターシステムを接続し、適切な条件（37℃、5％CO 2）を提供するインキュベーターに置き。バイオリアクターシステム（ 図1）の肝灌流チャンバー内の脱細胞化ラットの肝臓の足場8を配置します。 </li><li>灌流システムにチューブクリップを使用してカニューレを挿入し、門脈と大静脈を接続します 。 （1.1に記載のように）150 mlのRPMI培地で足場の平衡/分1.25ミリリットルの流量で5日間にわたって。 </li><li>メディア回路からの肝臓の足場を外し、5ミリリットルの注射器を使用して、門脈を経由して（5ミリリットル中）3×10 8 HepG2細胞と足場に接種、気泡の形成を回避し、細胞がためにそれらをインキュベートすることによって、ECMを再投入することを可能にしますポンプと足場で1時間はオフ。 </li><li>徐々に10分間1.25 ml /分で開始し、ポンプを調整することで流量を増加させます。 20分間、2.5ml /分、最後に3.75ミリリットル/ 30分間分。 </li><li>繰り返しは、6×10 8の全細胞数に到達するために1.2.4-1.2.5を繰り返します。 </li><li> /分3.75ミリリットルの流量でバイオリアクターシステムを実行します。文化2週間の再細胞化ラット肝。 注：一日おきに新鮮な培地（50ml）で媒体の三分の一を交換してください。このような乳酸デヒドロゲナーゼ活性、培地試料のpHおよびグルコースおよび乳酸の濃度などの生理学的パラメータを測定するための培地をサンプリングします。 </li></ol></li></ol>再細胞化ラット肝の2伝達<ol start="1"><li> AAVベクターの大規模生産<ol><li>前述のように、生成、精製、及びAAVベクターを定量：11 <ol><li>簡潔には、ローラーボトルにAAVベクターを生成し、イオジキサノール勾配遠心分離により、それらを精製します。 PD10ゲル濾過カラム上で濾過することにより、残留イオジキサノールを削除します。標準として、ゲノムのAAV DNAを用いて、qPCRによりAAVベクターの濃度を決定します。 注：本研究で使用される自己相補的、偽AAV2 / 6ベクターは、形質導入効率および内因的に発現する遺伝子のノックダウンのためのshRNA発現カセット（ ヒトシクロフィリンB（hCycB）、 図2）を実証するためのレポーターとしてEmGFPをコードしていました。血清型6（肝臓モデルあたり2.7×10 13 AAVベクター）の偽scAAVベクトルの十分な量を確保。 </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig2.jpg" /> 本研究で使用される自己相補的、偽AAV2 / 6ベクターの図2.地図。ゲノムはAAV2の逆方向末端反復（ITR）で構成され、同様に、CMVプロモーターの制御下EmGFPを符号化するshRNA制御下U6プロモーターの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li>肝臓モデルの導入<ol><li> PBSのそれぞれの容量を追加することで、5ミリリットル中に2.7×10 13ベクターゲノムの最終濃度までAAVベクター溶液を調整します。 </li><li>カニューレからチューブを除去することにより、メディア回路から肝臓を外します。門脈のカニューレに5ミリリットルの注射器を接続し、完全なAAVベクター溶液（5 ml）を注入します。 注：Optionallyは、肝臓全体のAAVベクター溶液の分布に従うようにフェノールレッド（5μg/ ml）を加えます。 </li><li>ポンプなしで1時間インキュベートします。徐々に10分間1.25 ml /分で開始し、流量を増加させます。 2.5ミリリットル/ 20分および30分間3.75はml /分分間。文化6日間の再細胞化ラット肝。 注：1.2.7下の注で与えられる媒体の三分の一を交換してください</li></ol></li></ol>再細胞化形質導入ラット肝臓の3評価<ol start="1"><li>ヘマトキシリンおよびエオシン（HE）染色および免疫組織化学的解析<ol><li>メスを用いて、各肝葉からのサンプル（0.5×0.5×1.5〜2センチメートル）を取ります。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド（PFA）に4℃で1.5時間、+ 4％スクロース溶液（3.1.1）からのサンプルをインキュベートします。 （ 注意 ：PFAは、必ず換気フード内でPFAを維持し、適切な防護服を着用し、有毒で発癌性である）洗浄PBSで3回（洗浄ステップあたり1分）および8％でインキュベート4℃でのスクロース一晩。 </li><li>プラスチックcryomoldsに培地を固定注ぎ、気泡を含まない培地中固定にサンプルを置きます。サンプルが十分に覆われるまで固定培地を追加します。ストアは、さらに使用するまで-80℃でサンプルを組み込み。 </li><li> cryotome 12で凍結切片（10μm）を準備します。ヘマトキシリン+エオシン染色8によって再細胞化を評価します。 （：EmGFPここでは）目的遺伝子のための免疫組織化学染色により形質導入効率を評価します。 </li></ol></li><li>分子生物学的サンプリング<ol><li>生検パンチ（直径4mm）で各肝葉をサンプリング。 EmGFPの導入遺伝子発現の評価のための製造元の指示に従って全RNA、DNAやタンパク質を単離、および8をノックダウンhCycB。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+and+spheroid+culture+of+human+liver+hepatocellular+carcinoma+cell+line+cells+demonstrate+distinct+global+gene+expression+patterns+and+functional+phenotypes.">Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).</li><li>Butler, D., Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientists+in+the+dark+after+French+clinical+trial+proves+fatal.">Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal.</a> Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).</li><li>Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+penetrate+human+solid+tumor+tissue+in+vivo+more+effectively+than+adenoviral+vectors.">Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).</li><li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+Decellularization+of+Rat+Livers+in+an+Oscillating-pressure+Perfusion+Device.">Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device.</a> J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).</li><li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid.">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).</li><li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation:+a+regenerative+medicine+approach.">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).</li><li>Wagner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+three-dimensional+humanized+liver+model+for+the+study+of+viral+gene+vectors.">Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors.</a> J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).</li><li>Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+gene-based+therapies:+the+road+ahead.">State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).</li><li>Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endgame:+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union.">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li><li>Wagner, A., R&#246;hrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+quantification+of+adeno-associated+virus+vectors+for+RNA+interference+applications+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+and+purified+genomic+adeno-associated+virus+DNA+as+a+standard.">A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard.</a> Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).</li><li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissected+region-specific+gene+expression+analysis+with+methacarn-fixed,+paraffin-embedded+tissues+by+real-time+RT-PCR.">Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR.</a> J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで説明する再構成された3D肝臓はヒト化システムにウイルスベクターを研究するためのモデルを提供します。ヒト肝細胞癌細胞株とラットの肝臓のECMの再増殖は、大規模な生物製剤の研究を可能にする血管新生したシステムを生成します。これらの結果は、概念実証再構成された肝臓モデルを効率的にウイルスベクターを用いて形質導入することができます。 ここに示した実験では、肝臓の一人ひとりローブはAAVベクターによって形質導入されました。しかし、いくつかの予備実験では、単一のローブは、細胞を再増殖しませんでした。血管系の閉塞から細胞破片または他のコンポーネントを防止することが重要です。すべてのローブが灌流できるかどうかをテストするには、このようなフェノールレッドなどの非毒性色素が肝臓モデルを通してフラッシュすることができます。 もう一つの重要な問題は、無菌の肝臓の足場を保っています。エタノールまたは抗生物質による治療がdisadvですがantageous血管系のため、γ線と細胞外マトリックスの照射は、血管を保存し、サンプルを滅菌しました。 再細胞化手順および再増殖の時間に使用される細胞の数は、再現性のある結果が得られるように調整する必要ができるように、また、外植肝臓の大きさは、異なります。 本研究で使用したラットの肝臓は、比較的大きく、細胞および試験試薬（ 例えば、AAVベクター）を大量に必要とします。また、再増殖の手順は、二つ以上の週間かかりました。これは、合理的な努力で行うことができます反復の数を制限します。我々は現在、少数の細胞と少ないテスト試薬の使用を可能にする、ラットの肝臓のボリュームの唯一の約五分の一であり、マウスの肝臓、のためのモデルを確立しています。細胞数の比例スケールダウンが妥当と思われるが、正確な量はfurtで決定する必要があります彼女の実験。 本モデルの別の欠点は、肝細胞HepG2細胞株の使用です。実験は、生理学的に関連性の高いモデルを提供する人工多能性幹細胞から分化した肝細胞の使用を開発することが継続中です。さらに、肝臓は肝細胞、 例えば 、クッパー細胞とsinosoidsに加えて、複数の細胞型で構成されています。私たちは、ECMが複数の細胞型で再細胞化されたときに異なる種類の細胞は、それらの自然環境を再投入することを前提としています。 3D肝モデルは、いくつかの利点を組み合わせます。 in vivoモデル従来の主な欠点は、動物生理学は人間の生理と実質的に異なるということです。ヒト患者の治療の毒性副作用は、したがって検出されないままであってもよいです。この欠点は、より密接にHUの生物学を反映するヒト細胞と3D肝臓モデルを再構成することによって克服することができます男性患者。 肝臓モデルの第2の利点は、動物福祉への貢献です。動物成分を再構成実験のために必要とされるが、余剰動物はそれはすなわち 、追加の動物が必要とされない、他の動物実験のために屠殺し、使用することができるように、このアプローチは依然として、3R原則（置換、還元、改良）の目的を以下アプローチは完全に頻繁にin vivo実験に関連している動物の苦しみを避けることができます。スフェロイドは、3Dシステムで細胞プロセスを研究するための代替ツールです。大規模な物質や生物製剤は、構造体の内側の部分に深く浸透しないように、しかし、スフェロイドは、血管新生されていません。これらの問題は、血管新生した3D肝臓モデルで克服されました。 彼らは、遺伝子治療のための最も有望な候補の一つであるので、ここで説明した実験では、AAVベクターは、調査しましたアプリケーション。以下のような多数の遺伝子治療アプローチが、肝炎ウイルスによるまたはα-1アンチトリプシン欠損症の感染の治療のため、例えば 、肝臓を標的とすることを目指し、3D肝臓はこれらのAAVベクターの開発の過程で使用することができます。また、当然のことながら、他の肝親和性ウイルスベクター、 例えば 、アデノウイルスベクターの研究に適しています。また、例えば、B型またはC型肝炎ウイルスなどの感染性肝炎ウイルスを研究するために使用することができます。例えば、新たな抗ウイルス戦略を設計するために使用することができます。また、3次元臓器モデルは、癌を治療するため、および毒性試験を実施するために新しい細胞増殖抑制治療薬を開発するための有望なツールを表します。長期的には、人工肝臓を移植などの再生医療で使用することができます。まとめると、3D肝臓モデルは、感染生物学および生物医学研究の他の分野でのアプリケーションの広い範囲を提供しています。

Most current biomedical research relies on one of two approaches, either two-dimensional (2D) cell culture experiments or animal models, which are three-dimensional (3D) by their very nature. However, these approaches have some severe drawbacks. Cells grown in 2D culture have been shown to differ in gene expression patterns and cell physiology from those cultivated under 3D conditions.1 Animal models, in addition to being associated with ethical concerns, often do not model human physiology well. Although the lack of obvious toxic effects of a compound must be confirmed in animal models prior to the first dosing in humans, multiple cases have been documented in which severe, sometimes fatal, adverse effects have occurred in clinical trials.2
To overcome these shortcomings, humanized 3D ex vivo organ models have become important research tools. When cultivated under suitable conditions, cells self-assemble into 3D structures known as spheroids. However, these spheroids lack a vascular system, which limits the distribution of small molecular compounds, large biologics and viral vectors alike. For example, adenoviral vectors only transduced the outer cell layers of spheroids prepared from human glioblastomas.3 A solution to this problem is the use of an organ model containing a vascular system. To this end, the organ of interest can be explanted from an animal, and the animal cells can be replaced by human cells. Various methods for decellularization of animal livers by treatment with detergents or sodium cholate have been described.4-6 The resulting extracellular matrix (ECM) harbors cytokines and growth factors which regulate various cellular processes.7 It can be used as a scaffold for recellularization with human cells to obtain a functional organ model.
In a recent study, we used a humanized 3D liver model to study distribution and transgene expression of an adeno-associated virus (AAV) vector.8 AAV vectors belong to the most promising viral vectors for gene therapeutic applications.9 The first, and to date only, approved gene therapeutic intervention in the Western world uses an AAV vector for the transfer of lipoprotein lipase.10

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:233px;">Fraunhofer</td>
			<td style="width:119px;">/</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic Pump</td>
			<td>Fraunhofer</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flange with groove</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2439454</td>
			<td>modified by gaffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">O-Ring Transparent</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2922551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quick Release Clamp</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2907151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flat Flange Lid</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2429857</td>
			<td>modified by gaffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screw thread Tube</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2483802</td>
			<td>modified by gaffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screw thread Tube</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2483602</td>
			<td>modified by gaffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicone sealing Ring</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2862012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screw Cap</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2924013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screw Cap</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2924008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screw Cap with aperture</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2922709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screw Cap with aperture</td>
			<td>Duran</td>
			<td>2922705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicone Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube connector</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM556A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biocompatible Tubing</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">T175 culture flasks</td>
			<td style="width:233px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">660 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td>
			<td>L0501-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glutamine</td>
			<td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td>
			<td>X0551-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td>
			<td>L0940-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin/ streptomycin</td>
			<td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:233px;">cc pro</td>
			<td style="width:119px;">S-10-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td style="width:233px;">Weckert-Labortechnik</td>
			<td style="width:119px;">600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HepG2</td>
			<td style="width:233px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">ACC 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryomold 15x15x5mm</td>
			<td style="width:233px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Biopsy punch 4mm</td>
			<td style="width:233px;">pfm medical</td>
			<td style="width:119px;">48401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Nucleospin miRNA</td>
			<td style="width:233px;">Macherey &#38; Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740971.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Nucleospin RNA/DNA Buffer Set</td>
			<td style="width:233px;">Macherey &#38; Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740944</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of viral vectors in a three-dimensional liver model repopulated with the human hepatocellular carcinoma cell line hepg2

このプロトコルは、3次元（3D）の生成ex vivoで肝臓モデルおよびウイルスベクター系の研究・開発への応用について説明します。モデルは、ヒト肝細胞系と脱細胞化ラット肝臓の細胞外マトリックスを再構築することによって得られます。モデルは、生きている動物と潜在的に有害な実験を交換し、血管新生した3Dセルシステムの研究を可能にします。別の利点は、動物モデルよりも、ヒトの生理に近いモデルのヒト化性質です。 本研究では、アデノ随伴ウイルス（AAVベクター）に由来するウイルスベクターを使用してこの肝臓モデルの伝達​​を実証します。メディアと3D肝モデルを供給する灌流回路は、ベクトルを適用するための簡単な手段を提供します。システムは、肝臓の主要な代謝パラメータのモニタリングを可能にします。最終的な分析のために、組織試料はrecellularizaの程度を決定するために撮影することができ組織学的技術によってます。送達導入遺伝子のウイルスベクターおよび発現の分布は、定量的PCR（定量PCR）、ウェスタンブロット法および免疫組織化学によって分析することができます。基礎研究における遺伝子治療用途の開発のベクトルモデルの多数のアプリケーションでは、新規の抗ウイルス治療薬の開発、癌研究、およびウイルスベクターの研究とその潜在的な副作用を含め、想定することができます。

再細胞化の程度の評価のために、凍結切片を各再細胞化肝臓モデルの各葉から調製しました。切片を次にヘマトキシリンおよびエオシン染色によって分析しました。 図3に見られるように、TLM1、TLM2（形質導入された肝モデル1 +2）とCtrl（形質再細胞化された肝臓モデルの制御ではなく）として示される3つの肝臓モデルの各ローブは、HepG2細胞で再増殖しました。この肝細胞癌細胞株は、15歳のアルゼンチン人の少年の腫瘍組織から確立されました。肝臓モデルの一部の地域では、より集中的に他のものよりも再細胞化されました。これらの変化の原因を決定することが残っています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig3.jpg" /> 図 3分析肝臓モデルの各ローブの 3 ヘマトキシリンおよびエオシン染色 TLM1 + 2：形質導入された肝臓モデル1および2;再細胞化が、形質導入されていなかったのCtrl：制御肝臓モデル。スケールバー：200μmです。 （参考文献からの許可を得て再印刷。8.） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 次のステップでは、肝臓のモデルの導入を評価しました。この目的のために、DNAは、肝臓モデルのそれぞれの28のパンチ生検から調製し、ベクターの力価は、qPCRにより定量しました。平均して、セル当たり55および90に内在ベクターゲノム（VG /セル）は、2つの形質導入された肝臓モデルを測定しました。 2D細胞培養における実験は、30 VG /セルを示している強力なトランスジーン発現およびRNAi媒介性サイレンシングのために十分です。 EmGFPの製造は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングによって分析しました。実際には、レポーターの発現は、それぞれ、mRNAおよびタンパク質レベルに対する生検の80〜90％で検出されました。8形質導入効率の全体像を得るために、凍結切片を免疫組織学的に分析しました。 図4に見られるように、DAPI染色により可視化に成功し、再細胞化された肝臓モデルの領域は、また、EmGFP発現の免疫組織化学的分析に強い蛍光シグナルが得られました。予想されるように、AAVベクターで処理されていない対照肝臓モデルは、任意のEmGFP発現を示しませんでした。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig4.jpg" /> EmGFP式図 4. 免疫組織化学的分析の肝臓モデルを再増殖細胞をDAPI染色（青色）によって可視化しました。 EmGFP発現は免疫化学染色（赤色）で可視化しました。 TLM1 + 2：形質肝臓モデル1及び2を、再細胞化が、形質導入されていなかったのCtrl：制御肝臓モデル。スケールバー：200μmです。 （許可を得て再印刷文献から。 8.） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 最後の試験では、hCycBのAAV媒介性ノックダウンは、定量RT-PCRによって分析しました。 hCycBのノックダウンは、70〜90％であることがわかっ2形質導入された肝臓モデル（ 図5）のすべてのローブを渡って平均しました。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig5.jpg" /> AAV-形質導入した3D肝臓モデルでhCycBの図5. RNAi仲介ノックダウン。hCycBのサイレンシングは、定量RT-PCRによって決定しました。平均値と標準偏差（SD）は、（それぞれ、TLM1及び2）各形質導入された3D肝臓モデルの全てのサンプルについて計算し、非形質導入コントロールの平均値に標準化した（Ctrlキー。）。 （Rからの許可を得て再印刷エフ。 8.） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.0K ビュー.  Institute of Biotechnology, Berlin University of Technology. The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

ビデオ: Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

大腸-26癌腫瘍を有するがん悪液質の研究のためのモデルとしてマウスを

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

がん研究

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by introducing specific mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, using clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-based genome editing technology in mice. This technology allows us to accurately mimic the genetic changes that occur in human cancers using mice. By genetically transforming murine primary cells, we can better study cancer development, progression, treatment, and diagnosis. In this study, we used Cre-inducible Cas9 mouse tongue epithelial cells to enable genome editing using adeno-associated virus (AAV) in vitro. Specifically, by altering KRAS, p53, and APC in normal tongue epithelial cells, we generated a murine head and neck cancer (HNC) cell line in vitro,which is tumorigenic in syngeneic mice. The method presented here describes in detail how to generate HNC cell lines with specific genomic alterations and explains their suitability for predicting tumor progression in syngeneic mice. We envision that this promising method will be informative and useful to study tumor biology and therapy of HNC.

Development of murine models with specific genes mutated in head and neck cancer patients is required for understanding of neoplasia. Here, we present a protocol for in vitro transformation of primary murine tongue cells using an adeno-associated virus-Cas9 system to generate murine HNC cell lines with specific genomic alterations.

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is typically performed via transfemoral access (TFA). However, transradial access (TRA) is preferred in coronary artery interventions due to decreased complications and mortality. Whether the advantages of TRA can be applied to TACE required investigation.
Patients receiving TRA TACE at a single center were retrospectively enrolled for study. Procedural details, technical success, radial artery occlusion (RAO) rate, and access site-related bleeding complications were evaluated. From October 2017 to October 2018, 112 patients underwent 160 TRA TACE procedures. The overall technical success rate was 95.0% (152/160). The rate of crossover from TRA to TFA was 1.9%. No access site-related bleeding complications were found in any cases. Asymptomatic RA occlusion occurred in three patients (2.7%). Compared with TFA, TRA can increase safety and patient satisfaction while decreasing access site-related bleeding complications. Moreover, TRA interventions can benefit patients with advanced age, obesity, or a high risk of bleeding complications.

Transarterial chemoembolization (TACE) is the standard therapy for patients in the intermediate stage of hepatocellular carcinoma and is typically performed through femoral artery access. Compared with transfemoral access, transradial access (TRA) can decrease the rate of bleeding complications and improve patient tolerance. A method is presented here to perform transarterial chemoembolization via radial artery access.

肝細胞癌患者に対する経放射型アクセスケミオボリ

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

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A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

神経癌の生物模倣モデルが、調整可能な生体特性を有する3D環境における腫瘍-ストロマ相互作用を研究する

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for tumor development, maintenance, and resistance to drugs. A better understanding of CSC properties for their specific targeting is, therefore, a pre-requisite for effective therapy. However, there is a paucity of suitable preclinical models for in-depth investigations. Although in vitro two-dimensional (2D) cancer cell lines provide valuable insights into tumor biology, they do not replicate the phenotypic and genetic tumor heterogeneity. In contrast, three-dimensional (3D) models address and reproduce near-physiological cancer complexity and cell heterogeneity. The aim of this work was to design a robust and reproducible 3D culture system to study CSC biology. The present methodology describes the development and optimization of conditions to generate 3D spheroids, which are homogenous in size, from Caco2 colon adenocarcinoma cells, a model that can be used for long-term culture. Importantly, within the spheroids, the cells which were organized around lumen-like structures, were characterized by differential cell proliferation patterns and by the presence of CSCs expressing a panel of markers. These results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this 3D approach to study cell heterogeneity and CSC biology, including the response to chemotherapy.

This protocol presents a novel, robust, and reproducible culture system to generate and grow three-dimensional spheroids from Caco2 colon adenocarcinoma cells. The results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this approach to study cancer stem cell biology, including the response to chemotherapy.

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...