このプロトコルは、候補抗HBV化合物が、特にNTCP結合をブロックすることによってウイルスの侵入を阻害するかどうかを検証するように設計されています。この技術は、HBVの侵入または感染の初期ステップが候補化合物によって中断される可能性があるかどうかを調査することを目的としています。手順を実演するのは、私の研究室のPSPの学生であるピヤノット・トンスリです。
タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド(NTCP)の測定を開始するには、成熟肝細胞を8ミル以上のエチレンジアミン四酢酸またはEDTAで15分間インキュベートします。細胞ペレットを収集し、PBSに300マイクロリットルの3.7%パラホルムアルデヒドを15分間加えて肝細胞を固定します。次に、細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、300 G、摂氏25度で10分間遠心分離します。
1%ウシ胎児血清またはFBSを含む700マイクロリットルのPBSを遠心分離機で10分間使用して細胞を2回洗浄します。次に、PBS中の300マイクロリットルの0.05%Triton X 100で室温で20分間細胞を透過処理します。遠心分離後、1%FBSを含む700マイクロリットルのPBSを用いてそれぞれ1分間の洗浄を3回行う。
NTCPに対する一次抗体を1対100の比率で使用して、細胞を摂氏4度で30分間インキュベートし、続いてパーマ洗浄バッファーで3回洗浄し、遠心分離します。Alexa Fluor 488に結合した二次抗体で細胞を摂氏4度で30分間染色し、パーマ洗浄バッファーの洗浄をそれぞれ1分間3回繰り返します。300Gで遠心分離した後、細胞ペレットを1%FBSを含む200マイクロリットルのPBSで再懸濁します。
ソフトウェアで、FSC、SSC、FITC、PEなどのフローサイトメトリー分析の測定パラメータを選択します。自動補正調整を設定し、原稿で説明されているように補正コントロールを含めます。次に、染色されていないサンプルを毎分60マイクロリットルの中程度の流体流量で実行します。前方散乱と側方散乱のしきい値を、目的のセル集団をカバーするまで調整します。
この領域のゲート領域をマークし、すべての補正コントロールに適用します。無染色コントロールを使用して光電子増倍管またはPMT蛍光を設定し、負の象限でFITCまたはPEのPMT電圧を調整します。陽性染色サンプルを実行し、正の象限スケールでFITCまたはPEを調整します。
染色されていないコントロール、FITC染色コントロール、またはPEコントロールを実行し、補正を計算してサンプル設定に適用します。次に、肝細胞サンプルを実行してNTCPレベルを測定します。次に、BD FACSuiteウィンドウ、コントロールチューブ、データソースタブの順に連続して選択して、染色された肝細胞の分析を開始します。
生データが表示されるのを待ちます。次に、右側のワークシートタブで楕円ゲートボタンをクリックし、マウスカーソルを使用して細胞集団とSSCおよびFSCドットプロットを選択します。次に、円P1が表示されるのを待ちます。
インターバルゲートボタンをクリックして、フルオレセインイソチオシアネート染色ヒストグラムの領域をマークします。最も高い蛍光強度値から右側に向かって開始します。行 P2 が画面に表示されます。
実験チューブをクリックして、ワークシートタブのデータが変更されることを確認します。統計ボタンをクリックしてから、空のスペースとワークシートをクリックします。次に、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド集団の統計値を観察する。
100%コンフルエントMHCウェルプレートから培地を吸引し、ウィリアムズE培地で希釈した4マイクロモルのシクロスポリンAを2時間加えます。次に、候補のB型肝炎ウイルス侵入阻害剤を吸引して、4%ポリエチレングリコールを含む1ミリリットルのウィリアムズE培地と交換します。次に、培養液とB型肝炎ウイルス粒子を1ウェルあたり100の感染多重度で摂氏37度で18時間インキュベートします。
次に、上清を2ミリリットルの冷たいPBSで廃棄し、穏やかに渦巻いて、結合していないB型肝炎ウイルスで古い培地を洗い流します。細胞を2ミリリットルの完全ウィリアムE培地で7日間培養した後、細胞をPBSで洗浄し、3.7%パラホルムアルデヒドとPBSで室温で15分間固定します。感染細胞をIFブロッキング溶液で室温で60分間、一次抗体を1〜200倍のブロッキング溶液で摂氏4度で一晩インキュベートする。
次いで、細胞と二次抗体を1〜500希釈液で室温で1時間インキュベートする前に、洗浄液を用いてそれぞれ1分間の洗浄を3回行う。3回洗浄した後、DAPIでサンプルを退色防止封入剤でマウントし、ガラスカバースリップで覆います。DAPIフィルターとPEフィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いて、20倍の対物レンズで蛍光シグナルを検出し、候補化合物の抗HBV侵入活性を測定しました。
細胞結合アッセイでは、前に示したように細胞を準備し、B型肝炎ウイルス粒子とともに摂氏4度で2時間インキュベートします。培地を廃棄した後、穏やかな渦巻きで2ミリリットルの冷たいPBSで細胞を洗い流します。次に、セルスクレーパーを使用して感染細胞を回収し、溶解バッファーで細胞を破壊します。
細胞ライセートを収集チューブに移し、原稿に記載の温度条件を用いてポリメラーゼ連鎖反応で全DNAを抽出した。前に示したように細胞を調製した後、肝細胞をタウロコール酸ナトリウム溶液と共に室温で15分間インキュベートし、溶液を吸引し、冷たいHEPESで細胞を3回洗浄する。次に、300〜500マイクロリットルの冷たいHEPESを加えて、氷上でセルスクレーパーで細胞を収穫します。
20秒間20キロヘルツで超音波処理によって細胞を均質化し、5分間氷上でインキュベートする。10, 000Gで遠心分離後、上清を採取し、タウロコール酸ELISAアッセイキットを用いて細胞内タウロコール酸濃度を評価した。等温滴定熱量測定またはITC装置で細胞とシリンジを洗浄するには、ITCソフトウェアを起動します。
[実験の実行の強調表示] タブで、19 インジェクションドット ITCM のマイクロカル法を選択し、[開く] をクリックします。新しいウィンドウが開いたら、[クリーニング]タブをクリックし、クリーニング方法ウィンドウで、細胞洗浄方法の洗浄ボタンとシリンジ洗浄方法のすすぎボタンを選択します。[次へ]をクリックして、画面の指示に従います。
サンプルをITCにロードした後、実験の実行タブの下にあるロードボタンをクリックします。次に、[次へ]をクリックし、この読み込み手順が完了するまでビデオの指示に従います。シリンジを使用して、サンプルセル内の溶液バッファーで参照セルを満たし、バッファーに15マイクロモルNTCPを入れます。
余分な溶液を取り除き、気泡を避けてシリンジに150マイクロモルのクルクミンリガンド溶液を満たします。[実験の実行] タブの下にある実行ボタンをクリックして、サンプルを実行します。実験情報と設定は左側に表示されます。
リガンドタンパク質の濃度と温度の詳細を入力します。開始をクリックして、注入プロセスを実行します。タンパク質リガンド相互作用が完了するまで1.4時間待ちます。
注入が完了したら、強調表示された分析ボタンを選択し、分析ソフトウェアを使用して生データを分析します。次に、概要をクリックして生データを表示し、結合部位の1つのセットとしてフィットモデルを選択します。肝成熟の特徴は、特にMHCの分化段階で、二核細胞や多角形の形態を含む観察されました。
NTCP発現の大幅な増加は、分化したHepaRGおよび分化したMHCで観察されました。NTCPの高度にグリコシル化された形態は、分化したHepaRGよりも分化したMHCでより多く検出されました。NTCPレベルは、未分化細胞よりも分化したMHC細胞で高かった。
ウイルス免疫蛍光染色は、感染後7日目の抗HBV侵入活性を評価し、細胞表面受容体へのウイルス結合のレベルをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって評価しました。タウロコール酸取り込み解析の結果,候補化合物の懲罰的阻害活性はNTCPを介したB型肝炎ウイルス結合を減少させることが示唆された。比色変化は、サンプルセルへの連続注入で検出されました。
標準的な非線形最小二乗回帰を、データによく適合した1つの結合部位に基づいてプロットしました。実線は、SBB結合について、細胞およびB型肝炎ウイルス粒子が摂氏4度でインキュベートされることについての実験値に最も適合することを示した。タウロコール酸の更新は、放射性技術を用いて評価することができる。
放射性タウロコール酸のレベルは、液体シミュレーションカウンターを使用して定量化できます。この技術は、感染または再感染のいずれかを防ぐのに役立つ抗ウイルスレジメンの問い合わせ活動におけるウイルス侵入を簡単かつ迅速にスクリーニングします。
