E型肝炎ウイルスの研究は、効率的な細胞培養システムの欠如によって妨げられてきた。私たちの技術は、これらの制限を克服し、薬物設計とワクチン開発への道を開きます。このプロトコルにより、非エンベロープおよびエンベロープHEV粒子の両方の感染性高力素ウイルスを産生し、様々な細胞の感染を促進することができる。
このプロトコルを実行するには、BSA-2施設へのアクセスと基本的な細胞培養技術の経験が必要です。プラスミドDNAを直線化するには、テンプレートDNAの10マイクログラムを10マイクロリットルのバッファーと2マイクロコッカス・ルテウス制限酵素の2マイクロリットルと混合し、最終的な体積を水で100マイクロリットルに調整します。その後、摂氏37度で1時間溶液をインキュベートし、標準的なプロトコルに従ってアガロースゲル電気泳動によるプラスミドの直線化を確認します。
プラスミドDNAの単離および直線化後、ゲル電気泳動による非消化プラスミドDNAと消化されたプラスミドDNAを比較することにより、線形化の成功を検証することができます。精製された全長型E型肝炎ウイルスDNAのインビトロ転写については、線形化DNAテンプレートの2マイクログラムを適切な試薬と混合し、核フリー水を使用して溶液の最終体積を100マイクロリットルにします。完全に混合した後、37°Cで2時間の溶液をインキュベートします。
2時間後、チューブにT7 RNAポリメラーゼを2マイクロリットル追加します。その後、反応を混合し、さらに2時間摂氏37度でチューブをインキュベートします。インキュベーションの最後に、7.5マイクロリットルのDNAを徹底的に混合して初期DNAテンプレートを消化し、37°Cの30分間インキュベートします。
抽出後、標準的なプロトコルに従ってアガロースゲル電気泳動によるRNAの完全性と収率を注意深く確認してください。低RNA帯の場合、ぼやけた塗りつぶしではなく、異なるバンドが観察されるべきである。一部の手順では、迅速な実行と徹底的な準備が必要です。
また、RNAの完全性と細胞の生存率にも特に注意してください。細胞培養由来のE型肝炎ウイルス産生のためにヒト肝癌細胞を調製するために、完全なDMEMの20ミリリットルで細胞を15センチメートルのコラーゲンコーティングされた培養皿に播種し、90%の合流に達するまで摂氏37度でインキュベートする。培養終了時に、細胞を10ミリリットルのPBSで洗浄してから、37°Cで0.05%トリプシン-EDTAの3ミリリットルの細胞培養プレートから取り外します。
完全なDMEMの10ミリリットルで剥離した細胞を再懸濁し、カウントのための50ミリリットルの円錐管に細胞を移す。新しい50ミリリットルチューブに6つの細胞に5回10を移し、洗浄ごとに35ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、上清を取り除かずに細胞を氷の上に置きます。
標的細胞のエレクトロポレーションの場合、2つのミリモルATPと5ミリモルグルタチオンで384マイクロリットルのサイトミックスを補い、その後さらに使用されるまで氷の上に保存する。上清を400マイクロリットルの溶液全体に慎重に交換してください。精製されたウイルスゲノムRNAを5マイクログラム加え、細胞懸濁液を4ミリメートルキュベットに移し、975マイクロファラドでエレクトロポレーションし、20ミリ秒で270ボルトを送ります。
エレクトロポレーション後、パスツールピペットを使用して、完全なDMEMの11ミリリットルに細胞をできるだけ早く移し、10ミリリットルの電気ポレート細胞をコラーゲンでコーティングした10センチメートルの培養皿に入れます。次に、300マイクロリットルの培地中の5番目の細胞に1.3倍の10を加え、コラーゲンコーティングされた24マイクロタイタープレートの1つのウェルのカバースリップに均等に加え、プレートと皿を細胞培養インキュベーターに24時間置きます。翌日、皿の上清を新鮮なDMEMの10ミリリットルに置き換え、さらに6日間培養インキュベーターに皿を戻します。
5~7日目には、細胞密度に応じて、対象タンパク質を発現する細胞数を細胞総数に正規化して発現させるトランスフェクション制御の免疫蛍光染色を行う。成功したエレクトロポレーションは、トランスフェクションコントロールの免疫蛍光染色によって監視することができます。トランスフェクション効率は、40%Aを超える必要がある複製欠損変異体は、染色の特異性を確認する陰性制御として機能することができる。
細胞外細胞培養由来のE型肝炎ウイルス粒子を採取するには、6日目に0.45マイクロリットルメッシュを通して上澄みを濾過し、細胞の破片を除去し、採取した細胞外細胞培養由来のE型肝炎ウイルスを摂氏4度で保存します。細胞内細胞培養由来のE型肝炎ウイルス粒子採取の場合、PBSで細胞を洗浄し、摂氏37度で0.05%トリプシン-EDTAの1.5ミリリットルで細胞を取り外す。細胞が剥離したら、DMEMの8.5ミリリットルで反応を停止し、遠心分離のために50ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を移す。
個々の2ミリリットル反応チューブにエレクトロポレーションごとに1.6ミリリットルのDMEM完全培地を加え、800マイクロリットルの培地を使用して細胞を再懸濁し、細胞をチューブに移します。液体窒素で細胞を凍結し、その後、高速遠心分離する前に氷上の細胞を10,000倍gで10分間解凍します。その後、マイナス80°Cの貯蔵のための細胞の破片ペレットを乱すことなく、新しいチューブに上澄み物を転送します。
新たに産生された細胞内および細胞外E型肝炎ウイルスストックの抗体を評価するために、コラーゲンコーティングされた96ウェルマイクロタイタープレートの60センターウェルに1ウェル当たりMEMの100マイクロリットル当たり4細胞に10倍の10を播種し、最も外側の井戸を1ウェルあたり100マイクロリットルのPBSで満たす。摂氏37度で24時間後、細胞の最初の行に50マイクロリットルの細胞外ウイルス粒子上清を加える。完全に混合した後、前の細胞から次の行に50マイクロリットルの上澄み物を重複して細胞の最後の行まで移すことによって、ウェル当たり1〜3濃度でウェル内容物を6回連続希釈する。
細胞内細胞培養由来のE型肝炎ウイルス粒子に感染するには、細胞の最上列に25マイクロリットルの細胞内ウイルス粒子上清を加え、25マイクロリットルの希釈を伴う1~5倍の比率で細胞を連続希釈する前に十分に混合する。次に、原稿のプロトコルに従って免疫蛍光染色する前に、細胞培養インキュベーターにプレートを7日間入れる。インキュベーションおよび免疫染色に続いて、プレートは免疫蛍光顕微鏡を用いて分析することができる。
細胞内および細胞外粒子の最終用の抗体を免疫染色した後、示されたとおりに適切な式を用いて計算することができる。連続希釈による細胞培養由来Eウイルス粒子による標的細胞感染後、1ミリリットル当たり10~5~3倍の10~3倍の焦点形成単位の間の力価は、非包絡細胞培養由来のE型肝炎ウイルス粒子に感染した細胞培養物から期待できる。細胞外培養由来E型肝炎ウイルス粒子を包絡させた培養物では、10~2番目の10倍から10倍の間の力素がミリリットル当たり4番目の焦点形成単位に期待されている。
また、ゲノムコピーと非エンベロープ細胞内感染性ウイルス粒子との比は、細胞外細胞由来E型肝炎ウイルス粒子感染培養物に対して観察される比よりも一般的に低く、非エンベロープE型肝炎ウイルス種のより高い特異的感染性を示唆している。ウイルス粒子産生および標的細胞感染は完全なウイルスのライフサイクルを必要とし、ウイルスと宿主の相互作用に関する新しい洞察を提供することができる。このプロトコルは、複製の運動を行うか、または感染アッセイに使用することができる粒子を生成するために変更することができる。
私たちの研究のほとんどは現在、エンベロープと非エンベロープHEVの両方で感染性粒子に依存しています。そして、私たちの技術を使用した記事は現在公開されています。
