肝外症におけるHBVウイルス複製は、肝外症候群の病因において重要な役割を果たす。現在、肝外HBV感染を開始するための細胞培養モデルは限定的である。HBV複製に影響を与える新しい宿主因子を同定し、HBV関連腎臓病を調査するために、インビトロ非肝感染モデルを発表する。
従来のHBV感染モデルと比較して、293T細胞株293T-NE-3NRを採用・設計し、HepG2.2.15と共同培養した。HBV感染は、バイオセーフティレベル2またはバイオセーフティレベル3の実験室で行われるべきである。実験室の安全慣行に従って、実験室の職員の安全を確保し、すべての研究者はHBV実験を行う前にワクチンを接種し、HBS抗体陽性を検出する必要があります。
まず、細胞上清ならびにHepG2.2.15に接触するすべての先端、フラスコ、プレート、チューブを処分前に一晩2%のビオチドに浸す必要があることを念頭に置いてHepG2.2.15細胞を培養します。液体窒素からHepG2.2.15細胞を含むバイアルを取り出し、37°Cの水浴で穏やかに渦巻いて解凍します。細胞を25センチメートル平方組織培養フラスコに移し、4ミリリットルの完全な培養培地を加える。
加湿インキュベーターでHepG2.2.15細胞を摂氏37度、炭酸ガス5%で培養します。3 日ごとにメディアを変更します。準備ができたら、50ミリリットルの遠心分離管に細胞上清を集める。
蓋をしっかり閉め、パラフィンフィルムで包みます。細胞断片を除去するには、ヘプG2.2.15上清を0.45マイクロメートルの膜で濾過し、新しい50ミリリットル遠心管に入れ替えます。その後、14ミリリットルのフィルターされた上清をウイルス濃縮器カラムに加え、蓋を閉じます。
縦棒を3,200回gで水平回転遠心分離機で35分間遠心し、HepG2.2.15上清濃縮物を1.5ミリリットルチューブに集めます。リアルタイムPCRを実行して、HepG2.2.15上清濃縮物中のHBV DNAが標準曲線範囲内にある場合の濃度を確認します。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに10マイクロリットルのDMEMを加えて濃縮物を20倍希釈します。
上清濃縮物と共に、負の対照、正の対照、および定量的基準の4つの希釈を調製する。各サンプルに450マイクロリットルのHBV DNA抽出バッファーを加え、室温で5分間12,000倍gで遠心分離します。27マイクロリットルのPCRマスターミックスと、氷上に配置されたPCRチューブのサンプルあたり3マイクロリットルのTaqポリメラーゼ酵素を組み合わせます。
次に、各チューブに20マイクロリットルの遠心サンプルを加えます。原稿の方向に従ってリアルタイムPCRを実行し、CT値をエクスポートして標準曲線を得ます。HepG2.2.15上清濃縮物をアリコートに分け、使用する準備ができるまでマイナス80度で保管します。
原稿の指示に従って感染媒体を準備する。次に、HepG2-NEを2つの井戸に播種し、2つのウェルに293T-NE-3NR細胞を、1つの井戸に293T-NEを播種します。加湿インキュベーターで37°C、炭酸ガス5%で細胞を24時間インキュベートします。
インキュベーション後、細胞を観察し、健康であれば感染を進める。各ウェルに500マイクロリットルの感染複合体を加え、さらに24時間細胞をインキュベートする。500マイクロリットルのPBSで細胞を2回洗います。
その後、各ウェルに媒体の1ミリリットルを追加します。2日ごとに穏やかに培地を交換してください。11日目に、500マイクロリットルのPBSで細胞を2回静かに洗浄し、免疫蛍光のために氷冷メタノールで細胞を固定します。
HepG-NEのウェルあたり100,000個の細胞を2つの井戸に、293T-NE-3ノールは2つの井戸に、293T-NE-NEはプレートの1つの井戸に入った。HepG2.2.15のウェルあたり100,000個の細胞を別の6ウェルプレートに5つの膜インサートにシードします。細胞を24時間インキュベートする。
インキュベーション後、細胞がすべて接着性があり、良好な状態であることを確認してください。6ウェルプレートと細胞膜の挿入物に媒体を捨てます。次に、HepG2.2.15で膜インサートをHepG-NE、293T-NE-3ノール、および293T-NEで播種した6ウェルプレートに挿入します。
加湿インキュベーターで37°C、炭酸ガス5%で細胞をインキュベートし、3~4日ごとに培地を交換します。10日後、膜インサートを取り除き、PBSで細胞を2回静かに洗浄し、細胞を氷冷メタノールで固定して免疫蛍光を求めます。HBcAg一次抗体およびDAPIによるインキュベーションは、蛍光反転顕微鏡上で10倍の目的で観察した場合に明確な染色をもたらした。
DAPIとNTCP-EGFP発現による染色により核局在化が確認され、緑色蛍光で同定された。HBcAgの発現部位は、赤色蛍光で位置した。DAPI、NTCP、および HBcAg が同じセル内にある場合、そのセルは HBV に正常に感染しています。
シクロスポリンA群は、NTCPを遮断してHBVが細胞に入るのを防ぐため、陰性対照であった。HBcAgは293T-NE-3RSで検出されたが、NTCPが293TのHBV感染に不可欠な唯一の因子ではないことを示す293T-NE細胞では検出されなかった。良好な細胞状態と効率的な操作は、成功した感染結果を得るための重要なポイントです。
優しい洗浄や感染後のメディアの交換も重要です。別の方法として、肝細胞ベースのHepG2-NE細胞を用いたHBV感染法は、この方法よりも感染効率が高く、抗HBV薬物スクリーニングに適している。293T-NE-3NRにおけるHBV感染のモデル化は、これらの細胞の非肝的背景による従来の細胞モデルに対する有用な賛辞である。
この方法は、非肝細胞におけるHBV感染の研究ならびにHBVの肝臓に必要な宿主因子の研究を促進する。
