J.O.B. and A.M.R. were supported by predoctoral fellowships from the National Science Foundation.

注：このプロトコルのために、我々はNの表皮にストロミュール周波数を測定することに焦点を当てていますベンタミアナの葉。 FNRtp：EGFP 13とNRIP1：セルリアン 6いくつかの安定したトランスジェニック系統は、PRO 35Sを含め、この目的のために使用することができる生成されています。これらの線の両方が広範囲の条件の下で成長した葉の葉緑体ストロマにおける蛍光体の強い発現を示しました。また、葉緑体を標的とするフルオロフォアは一過Nに表現することができますアグロバクテリウムを使用してベンタミアナは 13を変換します。 アグロバクテリウム浸潤がNでいくつかの基礎的な防御反応を誘発するので、これは、トランスジェニック株未満理想的ですアグロバクテリウム ベンタミアナとの相互作用は、潜在的に結果の解釈を複雑にし、葉14にストロミュール周波数を変更することができます。最後に、in vitroでストロミュール形成を可視化し、以下のセクション5で説明したように葉緑体は、遺伝的にコードされたフルオロフォアまたは蛍光色素のいずれかを使用して、任意の植物種から抽出することができる。9,15 注：植物栽培のための詳細な方法は、以前に記載されている16簡単に言えば、Nを育てます良好な排水を提供する任意のプロの土壌混合物を充填した4 &quot;ポットでbenthamiana植物。。発芽のための湿潤環境を提供する最初の10-14日のための明確なプラスチック製のドームで苗をカバー14-に、製造元の指示に従って、任意の標準的な肥料ミックスを追加します。日齢の植物。〜100マイクロモル光子メートル-2秒-1の光強度を用いて、白色光の下で植物を育てる。水植物定期的に。 可視化のための1.準備葉試料注：ストロミュールダイナミクスは8を負傷の影響を受けているので、組織標本は、ストロミュールを可視化する直前に行われるべきです共焦点蛍光顕微鏡によってS。理想的には、サンプルは、植物から取り出した後15分で可視化する必要があります。 <ol><li>非常に鋭いカミソリの刃を使用して、葉の小さな部分をカット。常に一貫性のために、葉の同じ領域を使用し、全ての実験において（向軸または背軸）と同じ面を視覚化するようにしてください。 </li><li>すぐに水で満たされた5ミリリットル無針注射器で葉の部分を水没、葉の部分を切断した後、注射器から空気を除去し、指で注射器のオリフィスをカバーし、プランジャーを引くことにより真空を適用します。 <ol><li>葉の部分を損傷しないように静かにプランジャーを解放します。この2〜3回繰り返して、または空気の大部分が除去されているまで、葉は、深い緑であるように見えます。 注：この手順はstromulesの正確な可視化を妨害する可能性が葉内の空気を除去します。 </li></ol></li><li>スライドに一滴の水を追加し、このドロップ上の葉の部分を配置します。その後、別のDRを追加葉の上部に水のオペアンプ、および葉の上にカバースリップを配置。気泡がある場合、それらが削除されるまで、静かにカバースリップをタップします。スライドは現在、顕微鏡検査のために準備ができて、すぐに可視化する必要があります。 </li></ol>共焦点蛍光顕微鏡2.可視化Stromules <ol><li>透過光では、（離れてかみそりの刃により損傷を受けた細胞からの）葉部の中心付近の視野に焦点を当てます。多くの葉緑体を同時に可視化することができるように、20X対物レンズを使用してください。細胞型は、後で識別できるように、必要に応じて、透過光で画像を保存します。 </li><li>使用している蛍光団のために適切な励起及び発光フィルターをレーザーに照明源を切り替えます。例えば、488nmのレーザーでGFPを励起し、500 nmから525 nmの間の排出量を収集します。 <ol><li>顕微鏡のソフトウェアを使用して、GFPのチャンネルを選択し、1愛にピンホール開口を調整するためにクリックRYユニット。 、レーザ走査を選択し、サンプルを可視化を開始し、その後、まだ明確stromulesを可視化しながら、レーザーパワーを最小化するために、レーザー強度および検出器の利得を調整するためにGFPチャンネルをクリックします。これらの設定が決定されると、それらはすべての実験を通じて、可能な限り一貫しておきます。 </li></ol></li><li>視野内の葉の表皮を通過した一連の画像を収集するのz -stack実験を準備します。 <ol><li> z -stackについては、（葉の表面付近の葉緑体は、試験した条件の下でより多くのstromulesを持っている場合、たとえば）のバイアスを回避するために、視野内のすべての表皮葉緑体が含まれます。 </li><li>すべてstromulesを含みますが、zの -stackに必要な時間を最小限に抑えることができますその最大間隔可能で画像を取ります。例えば、もし1エアリーユニットは、すべての2ミクロンの可能性が高い理想的な画像を撮影、2μmの深さでの合焦共焦点部分に相当します。 注：葉epidermisが凹凸面であるので、サンプルによって異なります-stack のzの合計深さ;ほとんどのz -stacksは10月20日の画像が必要になりますが、それ以上を含むことができます。 </li><li>走査速度と（可能ならば、通常5〜10分以内） のz -stackを迅速に収集されていることを確認するために、必要に応じて画像の解像度を調整します。後の分析のためのz -stackを保存します。 </li></ol></li></ol> 3.画像処理<ol><li>任意の画像解析ソフトウェアを使用してストロミュール周波数を決定します。このプロトコルのために、我々は、国立衛生研究所（http://imagej.nih.gov/ij/）、またはImageJを、フィジーの人気のアップグレードから公的に入手可能であるImageJを、（http://fiji.scを使用することをお勧めします/フィジー）。 </li><li>ソフトウェアにおける最大値投影を使用して、単一の画像へのz -stackをマージします。 </li><li>特定し、手動でイメージ内のすべての葉緑体を数えます。 </li><li>各葉緑体について、目視か一つ以上のstromulesを決定マージされたZ -stack画像内の葉緑体から伸びる見られています。例については、 図1を参照してください。 注：stromulesの生物学的機能が知られていないので、葉緑体から任意の薄い、間質で満たされた、管状延長が長さに関係なく、「ストロミュール」と考えることができます。それは約1μm、長さ7の大部分に沿って直径よりも小さい場合、原則として、葉緑体から間質で満たされた拡張子はストロミュールです。 1人が葉緑体がストロミュールを持っているかどうかを決定する際の主観的な差異を制御するために、すべての画像を分析していることを確認してください。第二の研究者は、独立して、さらに主観的な偏りを減らすためにストロミュール周波数を確認する必要があります。 </li></ol> 4.実験計画およびサンプリング注：ストロミュール周波数は葉の間に非常に可変であるが、いくつかの報告がINDIVI内ストロミュール周波数でほとんど変化があることを示唆していますデュアル葉9,17。 <ol><li> 1つのリーフの1つの視野からのリーフストロミュール周波数を計算します。葉を捨てて、この独立したサンプルを検討してください。独立したサンプルのように1つのリーフからの眺めの別々のフィールドを考慮していません。 注：そこストロミュール活動のどのように最良の指標の変化には強いコンセンサスがなく、stromulesの機能をより明確に定義されるまで、研究者はストロミュールダイナミクスを定量化することで創造的であり続けなければなりません。文学全体の比較のために、しかし、報告の一般的な基準は、より創造的なアプローチに加えて使用する必要があります。最低でも、必ず一つ以上のstromulesを持っている葉緑体の頻度を報告しています。 </li><li>視野内のstromulesを持っている葉緑体の頻度を決定します。視野内の全ての葉緑体を識別するためのImageJを使用してください。その後、各葉緑体のために、葉緑体は、少なくとも1ストロミュールを形成しているかどうかを判断します。 percentaとしてストロミュール周波数を報告ストロミュールと葉緑体のGE。 注：一部の研究者は、ストロミュール周波数を報告する前に、アークサイン変換を持つ例えば、パーセンテージを変換します。これは統計分析のためのオプションであるが、ストロミュール周波数のアークサインは、直感的な値ではなく、研究の主なテキストまたは数値で報告する必要はありません。 <ol><li>別のアプローチとして、stromulesの合計数をカウントし、葉緑体の合計数で割り。 注：ほとんどの状況下では、これは4.2に近づくように、同様の結果が得られます。単一葉緑体は多くstromulesを形成した場合には、しかしながら、ストロミュール頻度を過大評価することができます。代表的な結果の下に示す例では、例えば、いくつかの葉緑体は（87分の33のストロミュール対周波数）87分の40に葉緑体当たりstromules数を上げ、二つ以上のstromulesを持っています。 </li><li>また、代わりにストロミュール周波数のストロミュールの長さを決定します。長さを測定することができます。ImageJの中のフリーハンドラインツールでストロミュールをトレースすることもできます。 注：stromulesの生物学的役割は不明のままであるので、それはストロミュール長さは、その機能に影響を与えることは明らかではありません。 （4.2に記載されているように）、それらが認められた場合ストロミュール長さに有意差を報告するだけでなく、ストロミュール周波数を報告しています。 注：ストロミュール周波数が同じ成長条件下での異なる葉の間で高度に可変することができます。したがって、時間のかかることがストロミュール周波数を決定するが、実験は慎重に大きなサンプルサイズを含むように設計されるべきです。我々の研究室からのデータセットを用いて、標準で（各処置について少なくとも16の植物のサンプルサイズは、2つの条件の間でストロミュール周波数の少なくとも1.5倍の変化の統計的有意差があるかどうかを決定するために、通常は十分に強力であると判断しα= 0.05、β= 0.80）。 </li></ol></li><li>結果の統計的分析。 <ol><li>私を比較するために、2つの治療のストロミュール周波数、（また、異分散t検定または不等分散を仮定し、t検定として知られている） ウェルチのt検定を使用します。 注：このテストは、従来のスチューデントのt検定ほど強力ではありませんが、それはストロミュール頻度分布の分散は、治療間類似していることを想定していないので、 ウェルチのt検定が有利です。 注：ストロミュール周波数が「割合」であるので、その標本分布は、理論的にスキュー統計分析を、サンプルサイズが非常に低い場合、またはストロミュール周波数（近い0％に）または非常に非常に低い場合に可能性があり、二項はなく正常であると予測されます高い（100％に近いです）。いくつかのレポートは、正規分布に二項分布を変換し、したがって、 スチューデントt検定またはANOVAの標準的な要件を満たすように意図されている統計的分析の前にアークサイン変換を使用しています。実際には、しかしながら、rcsine変換は、統計分析にほとんどまたは全く影響を持っているので、お勧めできません。代わりに、統計的検出力を増加させ、データの解釈の誤りを減少させるサンプルサイズを増加させるために実験を繰り返します。 </li><li>統計的手法が使用されているものは何でも、慎重にサンプリング戦略、サンプルサイズ、統計的検定、および各実験のためのp値を報告してください。 注：研究者は確実に得る正確なp値を報告する必要がありますが、生物学の他の分野と同様に、0.05未満のp値は、「統計的に有意な」と考えることができます。 Pは、2つまたは3つの実験でサンプルサイズを増加させる、わずかに0.05を超える場合観察された差は、再現性と統計的に有意であるかどうかを明確にするために役立つことができます。 </li></ol></li></ol> 5.ストロミュールダイナミクスを可視化するために無傷葉緑体の抽出注：いくつかの方法試験管 15 内ストロミュール形成に関する最近の研究では、わずかに異なるプロトコルを含む、葉から葉緑体を単離するために使用されてきました。以下に詳述するプロトコルは、生化学的に純粋な葉緑体のサンプルが得られない、比較的簡単な方法を使用しますが、その代わりに、無傷の、健全な葉緑体9,18の大量を分離ありません。 <ol><li> 50mMのヘペスのNaOH、330 mMのソルビトール、2mMのEDTA、1.0のMgCl 2、および1.0mMののMnCl 2：コールド抽出緩衝液を準備します。使用前のNaOHとHCl、および冷蔵で6.9にpHを調整します。 注：冷たいバッファを使用し、可能なが無傷の葉緑体の高い比率をもたらすときにサンプルを氷上で維持し、必要ではないが。 </li><li> 50mMのヘペスのNaOH、330 mMのソルビトール、2mMのEDTA、1.0mMののMnCl 2、1.0のMgCl 2、10mMのKClと1.0のNaCl：分離バッファを準備します。使用前にNaOHおよびHClおよび冷蔵で7.6にpHを調整します。 </li><li>葉がない場合はジメチルスルホキシド（DMSO）中の50mM CFDAストック溶液（1.0ミリリットルDMSOあたり2.3ミリグラムのCFDA）：遺伝的にエンコードされた間質蛍光団を発現している、カルボキシフルオレセインジアセテート（CFDA）溶液を調製。 注：正確な濃度は重要ではありません。すべての回で暗所にCFDA在庫を保管してください。 -20℃で50 mMのCFDAの少量のアリコートを保管してください。 </li><li>葉緑体を単離するために、いくつかの植物から〜5〜10グラムの葉を除去し、簡単に冷たい水ですすいでください。すぐに50ミリリットルの冷抽出緩衝液に移します。いくつかの短いパルスでブレンダーを使用して葉を挽きます。 （50ml×2回）遠心管に抽出葉緑体を分割し、葉の破片を除去するために、チーズクロスの二、三の層を通して濾過し、750×gで1分間遠心。 </li><li>上清を捨て、10mlの単離緩衝液中で緑の葉緑体を懸濁します。 750×gで1分間再び遠心分離し、上清を捨て、そして5ミリリットルに最終容量をもたらすために分離バッファに葉緑体を懸濁します。 </li><li>転送201;スライドに葉緑体のlは、カバーガラスでカバーし、顕微鏡検査を開始します。 注：プラスチド標的蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック植物からの葉緑体は現在、共焦点蛍光顕微鏡による可視化のための準備が整いました。 </li><li> stromulesを可視化するためにプラスチド標的に蛍光タンパク質を発現していない植物から葉緑体を染色します。 <ol><li> 5ミリリットル単離緩衝液中に葉緑体懸濁に50 mMのCFDAの株式の5μlを添加します。 50μMに最終濃度を持参してください。 </li><li>葉緑体を5分間インキュベートし、その後、スライドに少量（〜50μl）を転送し、カバースリップでカバーし、顕微鏡検査を開始することを許可します。 </li><li> FITCまたはGFPフィルターセットを使用してください。単一の孤立した葉緑体を可視化するために、同時に多くの葉緑体を可視化する20Xの目的、またはより高い目標を使用します。 注：CFDAは無傷の葉緑体のストロマ内部に蛍光を発します。 </li><li>強いバックグラウンドの蛍光が存在する場合、chloを洗いますCFDA、750×gで1分間遠心分離器で5分間のインキュベーション後に10ミリリットル単離緩衝液中で再びroplasts、上清を捨て、そして5ミリリットル単離緩衝液中に再懸濁。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

stromulesを調査すると、三つの重要な要因は全体で考えなければならない：植物組織の（ⅰ）操作は最小限に抑える必要があり、（ii）の実験システムの一貫性が保たれなければならない、および（iii）サンプリング戦略は慎重に計画する必要があります堅牢な、再現性のあるデータが分析されていることを確認します。 Stromulesが著しく動的である：彼らは拡張し、顕微?...

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast7.
The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles6. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.
Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts10. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana9.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer-Biotech</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Model: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring blender</td><td>Waring&amp;nbsp;</td><td>Model: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>fiji.sc</td><td></td><td>Open-source software for analyzing biological images</td></tr></tbody></table>

visualizing stromule frequency with fluorescence microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

このプロトコルは、若いNの子葉に一日で、夜はストロミュール周波数を視覚化するために使用されましたベンサミアナタバコの苗。 Z-スタックからのスライスは、単一の画像（ 図1A）に併合されました。間質が（ 図1B）、黒表示されるように、視覚的な目的のために、その画像は彩度と反転しました。葉緑体は全くstromule...

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Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

visualizing-stromule-frequency-with-fluorescence-microscopy

Research

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Biology

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ビデオ: Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

遺伝学

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

免疫・感染学

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

生化学

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

生物学

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング<em&gt; S。ベネズエラ</emマイクロ流体デバイスの使用&gt;ライフサイクル

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

生物工学

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

要約

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微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

要約

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微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法