Name: generating de novo antigen-specific human t cell receptors by retroviral transduction of centric hemichain
Uploaded: 2016-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain at JoVE.com

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

1.レトロウイルスは、利息のエンコーディングTCR Hemichainを構築する準備<ol><li>以降のTCR遺伝子の挿入を可能にするようにするpMXベクターを線状化。 3時間37℃（ 表1）にEcoRIおよびNotI制限酵素でプラスミドDNAを消化8。 </li><li> 1.2％アガロースゲル上で消化されたプラスミドの電気泳動を行います。物品は約4,500塩基対（BPS）のバンド、および市販のゲル抽出キット9を用いて、30μlの滅菌水に溶出します。 </li><li>設計5 &#39;および3&#39;にもそれぞれ8するpMXベクターのEcoRIおよびNotI消化部位と重複15-20 BPSをコードする目的のTCR遺伝子のためのプライマー。 </li><li>プライマーを用いてTCR遺伝子を増幅します。 PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように約1000 BPSのバンドを溶出させます。 </li><li>市販のプラスミドをそれぞれ線状断片を組み合わせて消化したベクターにクローンTCR遺伝子組立マスターミックス試薬と1時間50℃でインキュベートします。 注：各成分の相対ボリュームに対して、製造業者のプロトコルを参照してください。この組立方法は、もともとギブソンら 10によって記載された技術に基づいています。 </li><li>人間の神経成長因子受容体フリン切断部位、セリン-グリシンリンカー、および2Aシーケンス12,13によって分離された（ΔNGFR、アミノ酸1から277）11の切断型で形質導入された細胞をマークする（オプション）タグTCR遺伝子。断片の末端と重複し、工程1.3-1.5に記載されるようにプラスミドを組み立てる設計プライマーをコードする配列。 注：これらの配列は参考文献11-13に記載されています。 </li><li>化学的にコンピテントE.を変換製造業者のプロトコル14次の組み立てプラスミドで大腸菌 。種子は、寒天プレート上の細菌（20 mg / mlでLB培地（LB）、15 mg / mlで寒天とを1μg/ mlのアンピシリン）を形質転換し、18時間37℃でインキュベートします。 </l私&gt; <li>文化37℃、毎分200回の振とう培養器で16時間50 LB培地1ml（20 mg / mlとLBとを1μg/ mlアンピシリン）で単一の細菌コロニー。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、市販のミディプレップキットを使用してプラスミドを精製します。周りを1μg/μlの濃度にプラスミドを希釈します。 注：プラスミド精製プロトコルは、アルカリ抽出法15に基づいています。 </li></ol> 2.安定したパッケージング細胞株を生成します注：両方293GPGとPG13細胞が接着性です。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）および50μg/ mlのゲンタマイシンを補充しました。トランスフェクションの前に1μg/ mlのテトラサイクリンと文化293GPG細胞。すべてのステップの間、5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。 <ol><li>トランスフェクト293GPGは、ステップ1.9で得られたhemichainをコードするベクターでUSIを細胞T75フラスコ内で培養16をパッケージング製造者のプロトコル1 7以下の市販のトランスフェクション試薬をngの。注：50から60までパーセントの密集度でのトランスフェ293GPG細胞。 </li><li>吸引293GPG細胞用培地と新鮮なDMEM培地1日後、トランスフェクションの10ミリリットルを追加します。 </li><li>収穫は一過シリンジに培地を移し、0.45μmフィルターを通過させることにより2日ステップ2.2の後、トランスフェクト293GPG細胞からウイルスを産生しました。 注：ウイルスは、直ちに使用するか、または将来の使用のために-80℃で保存することができます。 </li><li> T25フラスコでの培養は、1×10 5 PG13細胞。血球計数器を用いて細胞を数えます。 1日、吸引培地とポリブレンの8 / mlのと一緒に、ステップ2.3および1.5ミリリットルDMEM培地から293GPG由来ウイルスの1.5ミリリットルを追加した後。 </li><li> 4日間1日1回のステップ2.4で説明したように、関心のTCRのhemichainをコードするレトロウイルスを産生する安定PG13パッケージング細胞株を確立するために、メディアを変更します。 </li><li>吸引し培地と交換してください24時間さらに培養のための最後の感染後PG13細胞株のための新鮮なDMEM培地で。 注：0.05％トリプシン-EDTA溶液で剥離することにより凍結またはサブ培養細胞。 </li><li>三日間細胞を播種した後、ステップ2.3に記載のように形質導入PG13細胞株からのウイルスを生成するために、T75培養における2×10 6個の細胞を10mlのDMEM培地、および収穫ウイルスフラスコ。 注：ウイルスは最高のすぐに使用されますが、2つまでの数ヶ月のために-80℃で保存することができます。 </li></ol> 3.アクティベーションおよび形質導入ヒトT細胞の注：ヒトサンプルを得て、機関の倫理委員会承認プロトコールに従って使用されます。ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）の代わりにFCSの10％ヒト血清を添加した培地および50μg/ mlのゲンタマイシンで培養初代ヒト細胞です。すべてのステップの間、5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。 <ol><li>密度によってヒト末梢血単核細胞（PBMC）を単離し製造業者のプロトコル18以下の勾配分離。 </li><li>レトロウイルス感染のために必要な増殖を誘導するためにT細胞を活性化。組換えヒトインターロイキン2抗CD3モノクローナル抗体の（のrhIL-2）および50 ng / mlでの100 IU / mlのRPMI培地5ml中の6ウェルプレート中のウェルあたり文化2×10 7新鮮なまたは解凍したPBMC、 （クローンOKT3）。 </li><li>三日は、刺激を投稿4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。上清を捨て、ステップ2.7からPG13ウイルスの1ミリリットル中に再懸濁し、24ウェルプレートにウェル当たり0.5〜1×10 6 T細胞を播種する、とのrhIL-2の200 IU / mlを添加したRPMI培地の1ミリリットル。 1時間1,000×gで32℃での遠心分離プレート。 </li><li> 24時間後、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。ステップ2.7からPG13ウイルスの1ミリリットルで上清と再懸濁細胞を捨てて、のrhIL-2の200 IU / mlを添加したRPMI培地の1ミリリットル。 6未感染の合計に対して、この手順を繰り返しイオン。 注：感染症の数は、細胞株をパッケージングすることにより産生されたウイルスの力価に応じて最適化する必要があります。必要に応じて、毎日の細胞の20-30％を除去することにより流路T細胞が異常増殖を防止します。 </li><li> 24時間最後の感染後、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。さらなる培養のためのrhIL-2の100 IU / mlのRPMI培地中で上清と再懸濁細胞を捨てます。 </li><li> 2~3日ステップ3.5、15分間、4℃で30分間、4℃でHLAマルチマーで染色T細胞は、抗ヒトCD3および共受容体モノクローナル抗体（mAb）の後。フローサイトメトリーによって分析します。 19 - （3 図1）陰性対照として無関係の多量体および/または非形質導入細胞を使用してください。 </li><li>導入された中心hemichainがTCRα鎖である場合は、20フローサイトメトリーにより、市販のVβ特異的抗体のパネルを使用してデノボ多量体陽性細胞のVβの使用状況を分析。 </li></ol> 4.クローニング・デ・ノボ TCRカウンターhemichains <ol><li>フロー支援細胞選別によって、ステップ3.6で新たに多量陽性集団をソートします。 </li><li>酸グアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法21,2 2を使用してソートT細胞からRNAを単離します。 注：RNAを-80℃で保存することができるが、できるだけ早くのcDNAを生成するために使用されるべきです。 </li><li>製造業者のプロトコル23,24以下の市販の逆転写酵素PCRキットを用いて抽出したRNAからcDNAライブラリーを合成します。 </li><li> TCRβカウンター鎖をクローニングした場合、ステップ3.7で決定されるように、Vβ遺伝子とTCRβ定常領域特異的なプライマーを設計し、ステップ1.3から1.9に記載されているように、全長TCRβ遺伝子をクローニングします。カウンターチェーンがTCRαであればそうでない場合は5.1に進み、ステップ4.5を参照してください。 </li><li>市販のVα特異的抗体が限られている、したがって、Vα遺伝子の使用はできませんフローサイトメトリーによって決定されます。市販の5 &#39;RACEキット6を用いて、cDNA末端の5&#39;迅速増幅（RACE）25を介してクローンTCRαカウンター鎖、。 <ol><li>製造業者のプロトコルに従ってステップ4.2で抽出されたRNAから5 &#39;RACE互換性のcDNAを合成。 </li><li> 表2に記載したように第1ラウンドのPCRを行います。 </li><li> PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように、1,100 bpsのバンドを溶出します。 </li><li>テンプレートとして第1回目のPCR産物を使用して、 表3に記載されているように第2ラウンドのPCRを行います。 注： 表3の下に示すプライマー配列をEcoRIおよびNotIにクローニングするために設計されたのPMXベクターを消化しました。 </li><li> PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように、約1000 BPSのバンドを溶出します。 </li><li> EcoRIとNotIにクローンTCRα遺伝子をするpMXベクターおよびプリ消化しましたステップ1.5から1.9に記載されているように年度のプラスミド。 </li></ol></li></ol> 5.再構成新規抗原特異的TCRクローン注：培養ジャーカット細胞を76及び10％のFCSおよび50μg/ mlのゲンタマイシンを補充したRPMI培地中でその後の細胞株。すべてのステップの間、5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。 <ol><li>ステップ2.3で作製293GPGウイルスを使用して中心のTCR hemichainと（ - / -ヒトT細胞株または同等TCR）ジャーカット76セル26に伝達します。ジャーカット76、シードRPMI培地の1ウイルスのミリリットルと1ミリリットルで24ウェルプレート中のウェルあたり5×10 4細胞について。 1時間1,000×gで32℃での遠心分離プレート。 </li><li>感染後24時間は、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離によってhemichain形質導入されたジャーカット76細胞を収集します。さらなる培養のための新鮮なRPMI培地で上清と再懸濁を捨てます。 </li><li> hemichainは2-3日ステップ5.2後にタグ付けされた分子である場合に染色することによって、形質導入された細胞を精製流れアシストまたは磁気アシストセル（オプション）27をソートすることによって、その後抗NGFRモノクローナル抗体コンジュゲート蛍光体でる。 </li><li>ステップ2.1〜2.3に続いて、293GPGウイルスはステップ4.4または4.5からクローン化TCRを反鎖をコード生成します。 </li><li>完全にTCRを再構成するには、安定的にステップ5.4からウイルスを用いて、ステップ5.1から5.3で生成された中心のTCRのhemichainを発現するT細胞株を形質導入します。ステップ5.1から5.2に記載されているように形質導入を行います。 </li><li> 2-3日ステップ5.5 27の後に、製造業者のプロトコルに従って抗CD3磁気補助セルソーティングを使用して、CD3 +トランスフェを精製します。 </li><li> 、抗原特異性を検証し、抗CD3および/またはコレセプターモノクローナル抗体、およびHLA多量で、様々なカウンター鎖と対をなす中心のTCRのhemichainで構成されるクロノタイプTCRを発現するトランスフェクタントを染色するために、3~5日は、CD3精製を投稿してください。 19 -フローサイトメトリーによる細胞（5 図4）を分析します。 </li></ol>

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The University Health Network has filed a patent related to this methodology on which N.H., M.N., and T.O. are named as inventors. The other authors have no financial conflicts of interest.

この方法の成功した適用のための最初の要件は、関心のhemichain一次T細胞の十分な変換効率を達成することです。我々の経験、ヒト一次T細胞における導入遺伝子の安定的かつ効率的な発現のレトロウイルスベクターの結果として、パッケージング細胞株とするpMXとしてPG13を用いて組み合わせました。 PG13パッケージング細胞を形質導入効率を向上させるために高力価のパッケージング細胞を?...

T細胞受容体（TCR）は、TCRαおよびTCRβ鎖からなるTリンパ球によって発現されるヘテロ二適応免疫受容体です。これらは、HLA /ペプチド複合体の実質的に無制限の構成を認識することができる非常に多様なレパートリーを産生するV（D）J遺伝子セグメントの体細胞再編成によって生成されます。臨床的には、腫瘍関連抗原に特異的なクローン型TCRを発現するように操作されたT細胞は癌1の様々な有効性が実証されています。しかし、この目的のためにクローニングされた多くのTCRは、それらの治療的適用を制限する目的の抗原に対して十分な親和性を欠いています。 ここでは、チェーン中心主義を利用することにより、既存のTCRのためにこの制限を克服する方法を説明します。それは1のTCR hemichainは、標的抗原2の認識で、より支配的な役割を果たし得ることが報告されている、ここでは中心主義と呼ばれます。結晶構造解析は、その1中心を示していますTCRのhemichainは3,4 MHC /ペプチド複合体上のフットプリントの大部分を占める可能性があります。この概念を使用して、我々は以前にSIG35αTCRαがTCRβ鎖の多様なレパートリーと対HLA-A2 5により提示MART1 27-35ペプチドに対する反応性を維持することができることを実証しました。同様の結果が中心TCRβのhemichainは、様々なTCRα鎖と対にし、HLA-A24 6により提示WT1 235-243ペプチドについて反応性を維持しTAK1 TCRで得られました。 MART1およびWT1の両方が腫瘍関連抗原です。チェーン中心主義は、異なるVβ11TCRβ鎖7を有するヒトのiNKT TCRの不変Vα24-Jα18（Vα24i）TCRα鎖を組み合わせることで、CD1d拘束不変ナチュラルキラー（iNKT細胞）TCRの抗原認識を研究するために適用されました。 全ての場合において、我々は、トランスによってTCRのデノボレパートリーを生成することができました導入hemichainが内因性TCRαまたはTCRβカウンター鎖と対になった末梢血T細胞、に中心のTCRのhemichainをducing。本質的には、中心hemichainは一緒に対に適切なカウンタ鎖を同定するために用いることができるベイトとして機能まだ親和性が異なる、目的の抗原特異性を維持するTCRを形成します。これらの新規レパートリーから、我々は既存のTCRと比較して、標的抗原に対する改善された相互作用の強度を有するクローン型TCRを単離することができました。したがって、我々は、この方法は、臨床応用のための最適なTCRを特定のパイプラインを加速すると考えています。

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>293GPG cells</td><td>Generated by Ory &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (ref 8)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-010-CG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-015-CG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>400-110-IG</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>BioShop</td><td>CCL402</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit</td><td>BS353</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>0.45 mm pore SFCA membrane</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb</td><td>Biolegend</td><td>345104</td><td>clone ME20.4</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-human CD3 mAb</td><td>Biolegend</td><td>300440</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611L</td><td>used for multi-piece DNA assembly</td></tr><tr><td>HLA-A2 pentamer</td><td>Proimmune</td><td>depends on antigenic peptide</td><td>HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune</td></tr><tr><td>HLA/CD1d monomers</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td></td><td>multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility</td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>human CD3 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-101</td><td></td></tr><tr><td>IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3497</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 76 cells</td><td>Generated by Heemskerk &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (ref 10)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-060-LG</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td>used for EcoRI and NotI digestion</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td>used for plasmid purification</td></tr><tr><td>PC5-conjugated anti-human CD8 mAb</td><td>Beckman Coulter</td><td>B21205</td><td>clone B9.11</td></tr><tr><td>PG13 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-10686</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF Buffer Pack</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&amp;nbsp;High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>pMX retroviral vector</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-010</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-9268</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin (recombinant human interleukin-2)</td><td>Novartis</td><td>by Rx only</td><td>equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Purified anti-human CD3 antibody</td><td>Biolegend</td><td>317301</td><td>clone OKT3, used for T cell stimulation</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Life Technologies</td><td>S866</td><td>used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility</td></tr><tr><td>SMARTer RACE 5&#039;/3&#039;&amp;nbsp; Kit</td><td>Clontech</td><td>634858</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-LL</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>for cDNA synthesis</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>301604</td><td>10 ml, slip tip</td></tr><tr><td>Tetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>used to transfect 293GPG cells</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

generating de novo antigen-specific human t cell receptors by retroviral transduction of centric hemichain

T細胞受容体（TCR）は、免疫療法の有望なモダリティとして腫瘍を標的とするT細胞の特異性を指示するために臨床的に使用されます。そのため、様々な腫瘍関連抗原に特異的なTCRをクローニングすることは、多くの研究の目標でした。効果的なT細胞応答を誘発するために、TCRは、最適な親和性で標的抗原を認識しなければなりません。しかし、このようなTCRをクローニングすることが課題と多くの利用可能なのTCR同族抗原に対する準最適な親和性を有するとなっています。このプロトコルでは、我々はhemichain中心主義を利用することによって、既存のTCRを使用してデノボ高親和性抗原特異的TCRをクローン化する方法について説明します。いくつかのTCRのために、それぞれのTCRα又はTCRβのhemichainは抗原認識に等しく寄与しないことが知られており、ドミナントhemichainを中心hemichainと呼ばれます。我々はオリジナルのカウンターチェーンは異なるカウンター鎖を有する中心のhemichainを組み合わせることで、我々は抗原秒を維持することが可能であることが示されていますpecificity、同族抗原に対するその相互作用の強度を変調しながら。したがって、所与のTCRの治療可能性を中心とカウンタhemichains間の対形成を最適化することによって改善することができます。

チェーン中心であるhemichainの予備知識なしに、TCRα及びTCRβ鎖を別々にクローン化されるべきであり、HLA-A24 / WT1反応TAK1 TCR（ 図1）の場合に行われた末梢血T細胞への形質導入します。 TAK1βの形質導入は、抗原特異的T細胞の顕著に高い頻度が得られました。逆に、非中心hemichainの形質導入は、TAK1α鎖（ 図1）で見られるように、 デノボ多...

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Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

generating-de-novo-antigen-specific-human-t-cell-receptors-retroviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

8.4K ビュー.  University of Toronto. 本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

免疫・感染学

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

<meta charset="utf8"></head><body>免疫制御療法のためのヒトCAR制御細胞の工学と拡大

Generation of Human Chimeric Antigen Receptor Regulatory T Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable hematological cancers. These successes have spurred interest in adapting the CAR platform to a small yet pivotal subset of CD4+ T cells primarily responsible for regulating and inhibiting the immune response, regulatory T cells (Tregs). The ability to redirect Tregs&#39; immunosuppressive activity to any extracellular target has enormous implications for creating cell therapies for autoimmune disease, organ transplant rejection, and graft-versus-host disease. Here, we describe in detail methodologies for bona fide Treg isolation from human peripheral blood, genetic modification of human Tregs utilizing either lentivirus or CRISPR/Cas9-aided knock-in using adeno-associated virus-mediated homologous directed repair (HDR) template delivery, and ex vivo expansion of stable human CAR Tregs. Lastly, we describe the assessment of human CAR Treg phenotypic stability and in vitro suppressive function, which provides insights into how the human CAR Tregs will behave in preclinical and clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

This protocol provides a streamlined workflow to generate and test human chimeric antigen receptor regulatory T cells (CAR Tregs).

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable ...

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