Name: generating de novo antigen-specific human t cell receptors by retroviral transduction of centric hemichain
Uploaded: 2016-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain at JoVE.com

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

1. 레트로 바이러스가 관심의 인코딩 TCR Hemichain를 구축 준비 <ol><li> 후속 단계에서 TCR 유전자의 삽입을 허용하도록 PMX 벡터 선형화. 3 시간 동안 37 ° C (표 1)에 제한 효소 EcoRI과 NotI을 제한 효소로 플라스미드 DNA를 소화 8. </li><li> 1.2 % 아가 로스 겔에 소화 플라스미드의 전기 영동을 수행하십시오. 소비세 약 4,500 염기쌍 (BPS)의 밴드 및 용출은 30 ㎕의 멸균 수에 시판 겔 추출 키트 (9)를 사용. </li><li> 또한 PMX 벡터, 각각 8의를 EcoRI 및 NotI을 소화 사이트를 겹쳐 15 ~ 20 BPS를 인코딩 관심의 TCR 유전자 설계 5 &#39;및 3&#39;프라이머. </li><li> 프라이머와 TCR 유전자를 증폭. 단계 1.2에 설명 된대로 약 1,000 BPS의 PCR 제품 및 용출 밴드의 전기 영동을 수행하십시오. </li><li> 시판되는 플라스미드를 각각 선형 단편을 조합함으로써 소화 벡터에 TCR 유전자를 복제어셈블리 마스터 믹스 시약을 1 시간 동안 50 ° C에서 배양. 주 : 각 구성 요소의 상대적 볼륨에 대한 제조 업체의 프로토콜을 참조하십시오. 이 조립 방법은 원래 깁슨 외. (10)에 의해 기술 된 방법에 기초한다. </li><li> (선택 사항) 태그 TCR 유전자가 인간의 신경 성장 인자 수용체의 절단 된 형태로 세포를 형질 표시하려면 (ΔNGFR, 아미노산 1-277) (11)는 furin 분열 사이트, 세린 - 글리신 링커에 의해 분리하고, 2A는 12, 13을 시퀀스. 단편의 단부를 중첩 및 단계 1.3-1.5에 기재된 플라스미드를 조립 설계 프라이머 코딩 서열. 참고 :이 시퀀스는 참조 11-13에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 화학적으로 유능한 E. 변환 제조 업체의 프로토콜 (14) 다음 조립 플라스미드를 가진 대장균. 한천 접시에 씨앗 변형 박테리아 (20 ㎎ / ㎖ 원성 국물 (LB), 15 ㎎ / ㎖ 한천, 1 μg의 / ㎖ 암피실린), 18 시간 동안 37 ° C에서 품어. </l난&gt; <li> 문화 37 ° C 및 분 당 200 원에서 진탕 배양기에서 16 시간 동안 50 LB 배지 ㎖ (20 ㎎ / ㎖ LB 1 μg의 / ㎖ 암피실린)에서 하나의 박테리아 식민지. </li><li> 제조 업체의 프로토콜 시판 midiprep 키트를 사용하여 플라스미드를 정제. 약 1 μg의 / μL의 농도에 플라스미드를 희석. 주 : 플라스미드 정제 프로토콜은 알칼리 추출 방법 (15)에 기초한다. </li></ol> 2. 생성 안정 포장 세포주 참고 : 293GPG 및 PG13 두 세포가 부착된다. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 배양 된 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신으로 보충. 형질 전환 이전에 1 μg의 / ㎖ 테트라 사이클린과 문화 293GPG 세포. 모든 단계 사이의 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어. <ol><li> 단계 1.9, USI에서 얻은 hemichain 인코딩 벡터와 T75 플라스크에 16 배양 형질 293GPG 포장 세포제조사의 프로토콜 1~7 시판되는 형질 감염 시약 겨. 참고 : 50-60%의 포화 상태에서의 형질 293GPG 세포. </li><li> 대기음 293GPG 세포 매체와 신선한 DMEM 매체 일일 포스트 형질 10 ㎖를 추가합니다. </li><li> 수확은 일시적으로 이일 주사기에 배지를 전달하고 0.45 μm의 필터를 통과하여 단계 2.2 이후 형질 293GPG 세포로부터 바이러스를 생산했다. 참고 : 바이러스는 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> T25 플라스크 문화는 1 × 10 5 PG13 세포. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 어느 날 기음 문화 매체와 폴리 브렌 8 μg의 / ㎖와 함께, 단계 2.3 및 1.5 ml의 DMEM 매체로부터 293GPG 유래 바이러스의 1.5 ml를 추가 한 후. </li><li> 4 일 동안 하루에 한 번 단계 2.4에 설명 된대로 관심의 TCR의 hemichain를 인코딩 안정 PG13 포장 세포주 생산 레트로 바이러스를 설정, 매체를 변경합니다. </li><li> 대기음 매체 및 교체24 시간 더 배양을위한 마지막 감염 후 PG13 세포주에 대한 신선한 DMEM 매체와. 주 : 0.05 % 트립신 EDTA 용액으로 분리하여 냉동 또는 하위 문화 세포. </li><li> 세포를 시딩 한 후 단계 2.3 사흘 바와 같이 형질 도입 PG13 세포주에서 바이러스 T75에서 2 × 106 세포를 10 mL의 DMEM 배지로 플라스크 배양 및 수확 바이러스를 생성한다. 주 : 바이러스 가장 즉시 사용되지만, 최대 두 달 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 3. 활성화 및 형질 인간 T 세포 참고 : 인간의 샘플을 얻을 및 기관 윤리위원회의 승인을 프로토콜에 따라 사용됩니다. 로스웰 파크 메모리얼 연구소 문화의 기본 인간의 세포 (RPMI) 매체는 10 % 인간 혈청 대신 FCS 및 50 μg의 / ㎖ 겐타 마이신으로 보충. 모든 단계 사이의 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어. <ol><li> 밀도 분리 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)제조 업체의 프로토콜 (18) 다음 그라데이션 분리. </li><li> 레트로 바이러스 감염에 필요한 증식을 유도하는 T 세포를 활성화. 재조합 인간 인터루킨 2 항 CD3 단클론 항체 (rhIL-2) 및 50 ng를 / ㎖의 100 IU / ㎖와 RPMI 배지 5 ㎖ 6 웰 플레이트에 웰 당 문화 2 × 10 7 신선한 또는 해동 PBMC, (클론 OKT3). </li><li> 세 일, 자극을 게시 4 분 동안 350 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 T 세포를 수집합니다. 상청액을 폐기하고, 단계 270에서 PG13 바이러스 1 ㎖에 재현 탁하고, 24 웰 플레이트에 웰 당 0.5 × 106 T 세포를 시드와 rhIL-2, 200 IU / ㎖로 보충 된 RPMI 배지 1 ㎖. 원심 분리기 1000 XG에 접시와 1 시간 동안 32 ° C. </li><li> 24 시간 후, 4 분 동안 350 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 T 세포를 수집합니다. 단계 2.7에서 PG13 바이러스 상등액 1 ㎖에 재현 탁하고 세포를 폐기하고, rhIL-2, 200 IU / ㎖로 보충 된 RPMI 배지 1 ㎖. (6)을 감염의 총에 대해이 단계를 반복합니다이온. 참고 : 감염의 수 세포주 포장에 의해 생성 된 바이러스의 역가에 따라 최적화되어야한다. 필요한 경우 매일 세포의 20 ~ 30 %를 제거하여 통로 T 세포 과증식을 방지 할 수있다. </li><li> 24 시간 마지막 감염 후 4 분 동안 350 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 T 세포를 수집합니다. 또한 문화 rhIL-2의 100 IU / ㎖와 RPMI 배지에서 뜨는에 resuspend 세포를 폐기하십시오. </li><li> 2-3일 단계 3.5, 15 분 동안 4 ° C에서 30 분 동안 4 ° C, 다음 항 인간 CD3에서 HLA의 다량 체와 공동 수용체 단클론 항체 (단클론 항체)와 얼룩 T 세포 후. 유동 세포 계측법에 의해 분석합니다. 19 - 관련성이 다량 체 및 / 또는 음성 대조군 (3 그림 1)과 같은 untransduced 세포를 사용합니다. </li><li> 도입 중심 hemichain가 TCRα 체인 경우 20 유세포 시판 Vβ 특정 항체의 패널을 사용하여 새로이 합체 양성 세포 Vβ 사용을 분석한다. </li></ol> 4. 복제 드 노보 TCR 카운터 hemichains <ol><li> 흐름 이용한 세포 분류에 의해 단계 3.6 정렬 드 노보 다량 체 긍정적 인 인구. </li><li> 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출법 21,2 (2)를 사용하여 정렬 T 세포로부터 RNA를 분리. 주 : RNA는 -80 ℃에서 저장 될 수 있지만, 가능한 한 빨리의 cDNA를 생성하는데 사용되어야한다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜 23, 24 다음 시중에서 판매하는 역전사 효소-PCR 키트를 사용하여 추출 된 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 합성. </li><li> TCRβ 카운터 - 체인을 복제하는 경우, 전체 길이를 단계 3.7에서의 결정에 따라, Vβ 유전자와 TCRβ 불변 영역 특정 프라이머를 설계하고, 복제 TCRβ 단계 1.3-1.9에서 설명하는 유전자있다. 그렇지 않으면 5.1 단계로 진행 단계 카운터 체인 TCRα 경우 4.5를 참조하십시오. </li><li> 시판 Vα 특정 항체가 제한된다, 따라서 Vα 유전자의 사용은 할 수 없습니다유동 세포 계측법에 의해 결정된다. cDNA를 종료 (RACE) 25 5&#39;-빠른 증폭을 통해 복제 TCRα 카운터 - 체인, 5 &#39;RACE 키트 (6) 시판 사용. <ol><li> 제조 업체의 프로토콜 다음 단계 4.2에서 추출 RNA의 5 &#39;RACE 호환의 cDNA를 합성. </li><li> 표 2에 기술 된 바와 같이 1 차 라운드 PCR을 수행합니다. </li><li> PCR 산물의 전기 영동을 수행하여 단계 1.2에 기재된 바와 같이, 약 1,100의 BPS 밴드를 용출. </li><li> 주형으로서 1 차 라운드 PCR 생성물을 사용하여, 표 3에 기재된 바와 같이 2 차 라운드 PCR을 수행한다. 참고 : 표 3에서 나타낸 프라이머 시퀀스를 EcoRI 및 NotI에에 복제를 위해 설계되었습니다는 PMX 벡터를 소화. </li><li> PCR 산물의 전기 영동을 수행하여 단계 1.2에 기재된 바와 같이, 약 1,000의 BPS 밴드를 용출. </li><li> 를 EcoRI 및 NotI에로 복제 TCRα 유전자 PMX 벡터와 푸리을 소화같은 년도 플라스미드 단계 1.5-1.9에 설명. </li></ol></li></ol> 5. 재구성 소설 항원 특이 적 TCR 클론 주 : RPMI 배지에서 배양 된 Jurkat 세포 (76) 및 후속 세포주는 10 % FCS, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신으로 보충. 모든 단계 사이의 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어. <ol><li> 단계 230에서 생성 293GPG 바이러스를 이용하여 중심의 TCR hemichain으로 (사람 T 세포주 - - / 또는 등가 TCR)는 Jurkat 세포 76 (26) 형질 도입. 주르 케트 (76) 씨 RPMI 매체의 1 바이러스 mL 및 1 ml의 24 웰 플레이트에 웰 당 5 × 10 4 세포하십시오. 원심 분리기 1000 XG에 접시와 1 시간 동안 32 ° C. </li><li> 24 시간 감염 후 4 분 동안 350 XG에 hemichain 형질 도입 된 Jurkat에게 피펫과 원심 분리기 76 세포를 수집합니다. 또한 문화에 대한 신선한 RPMI 매체에 뜨는 및에 resuspend 폐기하십시오. </li><li> hemichain이 2-3일 단계 5.2 이후 태그 분자의 경우 얼룩에 의해, 형질 세포를 정화흐름 보조 또는 자기 보조 세포 (옵션) (27)를 정렬 한 다음 반 NGFR 단클론 항체 결합 형광으로 보내고. </li><li> 단계 2.1 2.3에 따라, 293GPG 바이러스가 단계 4.4 또는 4.5에서 클로닝 TCR 카운터 체인을 인코딩 생산하고 있습니다. </li><li> TCR을 완전히 재구성 안정적으로 단계 5.4로부터의 바이러스를 사용하는 단계 5.1-5.3에서 생성 중심의 hemichain TCR을 발현하는 T 세포주를 형질 도입. 단계 5.1-5.2에 설명 된대로 전달을 수행합니다. </li><li> 2~3일 단계 5.5 27 후, 제조 업체의 프로토콜 다음 항 CD3에게 자기를 이용한 세포 정렬을 사용하여 CD3 + 형질을 정화. </li><li> 항원 특이성을 확인하려면, 항 CD3 및 / 또는 공동 수용체 단클론 항체, 및 HLA의 다량 체와 다양한 반 사슬과 쌍을 이루는 중심 TCR의 hemichain 구성 clonotypic TCR도를 발현하는 형질 얼룩 3-5 일 CD3 정화를 게시합니다. 19 - 유동 세포 계측법 (5 그림 4)에 의한 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).</li><li>Padovan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+T+cell+receptor+alpha+chains:+dual+receptor+T+cells.">Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells.</a> Science. 262 (5132), 422-424 (1993).</li><li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+of+tumor-reactive+TCR+confers+both+high+avidity+and+tumor+reactivity+to+nonreactive+peripheral+blood+mononuclear+cells+and+tumor-infiltrating+lymphocytes.">transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes.</a> J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).</li><li>Chinnasamy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TCR+targeting+the+HLA-A*0201-restricted+epitope+of+MAGE-A3+recognizes+multiple+epitopes+of+the+MAGE-A+antigen+superfamily+in+several+types+of+cancer.">A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer.</a> J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).</li></ol>

The University Health Network has filed a patent related to this methodology on which N.H., M.N., and T.O. are named as inventors. The other authors have no financial conflicts of interest.

이 방법을 성공적으로 적용하는 첫 번째 요건은 관심 hemichain 일차 T 세포의 충분한 전달 효율을 달성한다. 경험 인간 T 세포 주에서 도입 유전자의 안정하고 효율적인 발현 레트로 바이러스 벡터의 결과로서 패키징 세포주와 PMX로서 PG13를 사용하는 조합. PG13 패키징 세포는 형질 도입 효율을 향상시키는 고역가 포장 셀 선택 클로닝 단일 셀 수있다. 또한, T 세포 증식은 또한 레트로 바이러스에 의?...

T 세포 수용체 (TCR도)는 TCRα 및 TCRβ 쇄로 이루어지는 T 림프구에 의해 발현 이종 적응 면역 수용체이다. 그들은 HLA / 펩타이드 복합체의 거의 무한대의 구성을 인식 할 수있는 매우 다양한 레퍼토리를 생산 V (D) J 유전자 세그먼트의 체세포 재 배열을 통해 생성된다. 임상 종양 관련 항원에 대한 clonotypic TCR도의 특정을 발현하도록 유전자 조작 된 T 세포는 암 (1)의 다양한 효능을 증명하고있다. 그러나, 이러한 목적을 위해 많은 클론 TCR도 그들의 치료 학적 적용을 제한 관심있는 항원에 충분한 친 화성이 부족하다. 여기서는 체인 중심성을 이용하여 기존의 TCR도이 제한을 극복하는 방법을 설명한다. 그것은 하나의 TCR의 hemichain는 표적 항원이 인식에서 더 지배적 인 역할을 할 수 있다고보고되고있다, 여기 중심성 불린다. 크리스탈 구조 분석은 하나의 중심을 보여 주었다TCR의 hemichain는 3,4 복잡 MHC / 펩타이드의 공간의 대부분을 설명 할 수있다. 이 개념을 사용하여, 우리는 이전에 SIG35α TCRα가 TCRβ 체인의 다양한 레퍼토리와 페어링 및 HLA-A2 (5)에 의해 제시된 MART1 27-35 펩타이드에 대한 반응성을 유지할 수 있음을 증명하고있다. 유사한 결과는 중심 TCRβ의 hemichain 다양한 TCRα 사슬과 페어링 및 HLA-A24 (6)에 의해 제공되는 WT1 펩티드 235-243 반응성을 유지 TAK1 TCR로 얻었다. MART1 및 WT1 모두 종양 관련 항원이다. 체인 중심성은 다른 Vβ11 TCRβ 체인 (7) 인간하여 iNKT TCR도의 불변 Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα 체인을 페어링하여, CD1d 제한 불변 자연 살해 (인 iNKT) TCR도의 항원 인식을 연구하기 위해 적용되었다. 모든 경우에서는 트랜스로 TCR도의 드 노보 레퍼토리를 생성 할 수 있었다도입 hemichain이 내생 TCRα 또는 TCRβ 카운터 사슬와 결합 말초 혈액 T 세포에 중심 TCR의 hemichain를으로 줄. 본질적으로, 중심 hemichain 함께 쌍으로 관심의 항원 특이성을 유지 TCR도 형성하면서도 친 화성 변화 적절한 이의 사슬을 식별하는데 사용될 수있는 미끼로서 기능한다. 이러한 신규 레퍼토리에서, 우리는 기존에 비하여 TCR도 표적 항원에 대해 향상된 상호 작용 강도 clonotypic TCR도를 분리 할 수 ​​있었다. 따라서, 우리는이 방법이 임상 응용 프로그램에 대한 최적의 TCR도를 식별하는 파이프 라인을 가속화 할 전망이다.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>293GPG cells</td><td>Generated by Ory &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (ref 8)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-010-CG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-015-CG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>400-110-IG</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>BioShop</td><td>CCL402</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit</td><td>BS353</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>0.45 mm pore SFCA membrane</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb</td><td>Biolegend</td><td>345104</td><td>clone ME20.4</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-human CD3 mAb</td><td>Biolegend</td><td>300440</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611L</td><td>used for multi-piece DNA assembly</td></tr><tr><td>HLA-A2 pentamer</td><td>Proimmune</td><td>depends on antigenic peptide</td><td>HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune</td></tr><tr><td>HLA/CD1d monomers</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td></td><td>multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility</td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>human CD3 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-101</td><td></td></tr><tr><td>IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3497</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 76 cells</td><td>Generated by Heemskerk &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (ref 10)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-060-LG</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td>used for EcoRI and NotI digestion</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td>used for plasmid purification</td></tr><tr><td>PC5-conjugated anti-human CD8 mAb</td><td>Beckman Coulter</td><td>B21205</td><td>clone B9.11</td></tr><tr><td>PG13 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-10686</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF Buffer Pack</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&amp;nbsp;High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>pMX retroviral vector</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-010</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-9268</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin (recombinant human interleukin-2)</td><td>Novartis</td><td>by Rx only</td><td>equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Purified anti-human CD3 antibody</td><td>Biolegend</td><td>317301</td><td>clone OKT3, used for T cell stimulation</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Life Technologies</td><td>S866</td><td>used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility</td></tr><tr><td>SMARTer RACE 5&#039;/3&#039;&amp;nbsp; Kit</td><td>Clontech</td><td>634858</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-LL</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>for cDNA synthesis</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>301604</td><td>10 ml, slip tip</td></tr><tr><td>Tetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>used to transfect 293GPG cells</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

generating de novo antigen-specific human t cell receptors by retroviral transduction of centric hemichain

T 세포 수용체 (TCR도)의 면역 요법의 유망 양상으로 종양 타겟팅 T 세포의 특이성을 직접 임상 사용된다. 따라서, 다양한 종양 관련 항원에 대한 특정 복제 TCR도 많은 연구의 목표였다. 효과적인 T 세포 반응을 유도하기 위해, TCR 최적 친화력 표적 항원을 인식해야한다. 그러나, 복제 등의 TCR도는 도전과 많은 사용할 수 TCR도하고 동족 항원에 대한 차선의 친 화성을 가지고있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 hemichain의 중심성을 이용하여 기존 TCR도를 사용하여 드 노보 선호도가 높은 항원 특이 TCR도를 복제하는 방법을 설명합니다. 이는 일부 TCR도, 각 TCRα 또는 TCRβ hemichain의 항원 인식에 동일하게 기여하지 않는 것으로 알려져 있으며, 지배적 hemichain는 중심 hemichain로 지칭된다. 우리는 원래 반 체인에서 다른 반 체인으로 중심 hemichain 페어링하여, 우리는 항원의를 유지할 수 있음을 보여 주었다pecificity, 동족 항원 상호 작용의 강도를 조절하면서. 따라서, 주어진 TCR의 치료 가능성은 중심과 대향 hemichains 사이의 페어링을 최적화함으로써 개선 될 수있다.

사전 지식없이하는 hemichain의 TCRα 및 TCRβ 체인은 별도 복제 및 HLA-A24 / WT1 반응 TAK1 TCR (그림 1)의 경우에 이루어졌다 말초 혈액 T 세포에 형질 도입해야 체인 중심이다. TAK1β의 전달은 항원 특이 적 T 세포의 현저히 더 높은 주파수를 수득 하였다. 반대로, 비 중심 hemichain의 전달은 드 노보 합체 양성 T 세포 TAK1α 체인 것과 같이 (도 1)를 산출하...

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Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

여기서 우리는, 기존 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 페어링 말초 T 세포 수용체 레퍼토리 상보 hemichain으로 관심 항원 특이성을 보유하여 항원 특이 적 T 세포 수용체 (TCR도)을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 드 노보 생성 TCR도 선호도 변화와 항원 특이성을 유지한다.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

generating-de-novo-antigen-specific-human-t-cell-receptors-retroviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

8.4K 조회수.  University of Toronto.  여기서 우리는, 기존 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 페어링 말초 T 세포 수용체 레퍼토리 상보 hemichain으로 관심 항원 특이성을 보유하여 항원 특이 적 T 세포 수용체 (TCR도)을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 드 노보 생성 TCR도 선호도 변화와 항원 특이성을 유지한다. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

공동-agonism 인간 CD8 + T 세포 활성화에 조사를 단일 체인 MHC 기술의 사용

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

<meta charset="utf8"></head><body>면역 조절 요법을 위한 인간 CAR Tregs의 엔지니어링 및 확장

Generation of Human Chimeric Antigen Receptor Regulatory T Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable hematological cancers. These successes have spurred interest in adapting the CAR platform to a small yet pivotal subset of CD4+ T cells primarily responsible for regulating and inhibiting the immune response, regulatory T cells (Tregs). The ability to redirect Tregs&#39; immunosuppressive activity to any extracellular target has enormous implications for creating cell therapies for autoimmune disease, organ transplant rejection, and graft-versus-host disease. Here, we describe in detail methodologies for bona fide Treg isolation from human peripheral blood, genetic modification of human Tregs utilizing either lentivirus or CRISPR/Cas9-aided knock-in using adeno-associated virus-mediated homologous directed repair (HDR) template delivery, and ex vivo expansion of stable human CAR Tregs. Lastly, we describe the assessment of human CAR Treg phenotypic stability and in vitro suppressive function, which provides insights into how the human CAR Tregs will behave in preclinical and clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

This protocol provides a streamlined workflow to generate and test human chimeric antigen receptor regulatory T cells (CAR Tregs).

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable ...

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