当研究室では、キメラ抗原受容体のような人工免疫受容体を設計し、それらが制御性T細胞の生物学にどのような影響を与えるかを研究しています。新しいDNA配列を発明し、ヒト化マウスモデルを用いて、自己免疫疾患、移植拒絶反応、がん、老化に対する遺伝子組換え免疫細胞療法の創出を目指しています。制御性T細胞のキメラ抗原受容体を設計する際には、その強度を考慮することが重要です。
高親和性CAR制御性T細胞は、エフェクターT細胞のように振る舞い、炎症性サイトカインを増加させ、より大きな殺傷活性を示します。私たちの進行中の研究は、CAR親和性の低下がCAR制御性におけるサイトカインプロファイルと機能の改善につながることを示しています。CARトレグ分野は初期段階にあり、標準化されていません。
当社のプロトコルは、CAR制御性Tregの生成とテストのための堅牢で普遍的なアプローチを導入しています。これにより、再現性が向上し、イノベーションが加速すると同時に、特にTregの希少性と特殊な要件の課題を考えると、CAR Treg研究に不慣れなラボを指導します。私たちは、制御性T細胞が免疫バランスを維持し、組織治癒を促進するために使用するメカニズムを研究しています。
私たちの研究には、CAR Tregのシグナル伝達と機能の理解、およびCAR Treg療法が現在の戦略と比較して独自の利点を提供する可能性のある新しい疾患の状況の探索が含まれます。まず、ロイコパックの内容物を50ミリリットルの円錐管に移します。等量のDPBSを2%ウシ胎児血清と添加し、ピペットで穏やかに混合します。
チューブを300gで室温で10分間回転させます。上清が吸引されたら、細胞ペレットを2ミリリットルのDPBSに2%ウシ胎児血清で再構成します。.次に、細胞懸濁液に8ミリリットルの塩化アンモニウム溶液を加え、穏やかに反転させて混合します。
ブレークオフ時に、洗浄した細胞を室温で150gで10分間回転させます。上清を吸引した後、細胞ペレットを2%ウシ胎児血清を含む30ミリリットルのDPBSに再懸濁します。.次に、10を8の累乗から10の9つのPBMCの累乗にスピンダウンし、500gで室温で5分間待ちます。
そして、10の5倍10の濃度で細胞分離バッファーに再懸濁し、1ミリリットルあたり7細胞の累乗で行います。制御性T細胞の蛍光支援細胞選別では、CD4陽性細胞を500gで5分間スピンします。次に、200マイクロリットルのDPBSで細胞を再構成します。
100万個の細胞ごとに、1マイクロリットルの抗ヒトCD4 FITCを、1マイクロリットルの抗ヒトCD25 APC、および1マイクロリットルの抗ヒトCD127 PEを添加する。チューブを静かに渦巻いた後、摂氏4度の冷蔵庫に30分間置きます。細胞を2%ウシ胎児血清を含む10ミリリットルのDPBSで洗浄した後、500gで5分間紡糸し、染色した細胞を10の1.5倍で2%ウシ胎児血清を含むDPBSに1ミリリットルあたり7細胞の累乗で穏やかに再懸濁します。次に、染色した細胞懸濁液を40μmのフィルターキャップに通し、蛍光支援細胞ソーティングチューブに入れます。
15ミリリットルのRPMI10培地が入った10ミリリットルのコレクションチューブを準備し、氷の上に置きます。最後に、CD4陽性、CD25高、CD127陰性の制御性T細胞、およびCD4陽性、CD25低、CD127陽性の従来のT細胞を、蛍光支援細胞ソーティングを用いて選別する。まず、活性化から48時間後にヒト血液から分離された制御性T細胞を採取し、再懸濁します。
細胞をカウントした後、室温で500gで5分間遠心します。RPMI10の制御性T細胞を1.25×10で、インターロイキン-2の1ミリリットルあたり1,000国際単位/ミリリットルで6細胞の累乗に再懸濁します。次に、各レンチウイルスアリコートを2.5×10に10倍加え、微量遠心チューブ内の200マイクロリットルの5つの制御性T細胞の累乗を加えます。
摂氏32度で1時間、1, 000gで紡糸します。各200マイクロリットルの反応を24ウェルプレートに移します。形質導入した制御性T細胞とプレートを組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。
RPMI10 培地で各ウェルを 2 ミリリットルに補充し、最終的なインターロイキン -2 濃度は 1 ミリリットルあたり 1 、 000 国際単位です。ここに示すように、フローサイトメトリーを使用して遺伝子修飾効率を評価します。まず、活性化後48時間後に、抗CD3、CD28ビーズを含む再懸濁制御性T細胞を15ミリリットルの円錐管に取ります。
細胞懸濁液を磁石で3分間インキュベートします。磁石の中にいる間に、培地中の細胞をピペットで新しいチューブに移します。ビーズ除去後、脱ビーズした制御性T細胞をRPMI10で2時間休ませます。
次に、制御性T細胞を500gで5分間スピンします。上清がデカントされたら、事前に温めた還元血清培地に細胞を10の4倍で再懸濁し、1ミリリットルあたり6細胞の累乗にします。低タンパク質結合性1.5ミリリットルの遠心分離チューブで100マイクロリットルの細胞を分注します。
キメラ抗原受容体アデノ随伴ウイルスを20, 000の感染の多様性で各サンプルに加え、再懸濁します。次に、反応チューブを組織培養インキュベーターで1時間インキュベートします。インキュベーション中に、トラック遺伝子座を標的として、8.3マイクロリットルのCas9タンパク質を2.5マイクロリットルのシングルガイドRNAに添加することにより、CRISPR-Cas9リボ核タンパク質複合体を調製します。
成分を十分に混合した後、組織培養インキュベーター内でリボ核タンパク質混合物を摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、新しいエレクトロポレーションチューブに3ミリリットルの高浸透圧エレクトロポレーションバッファーを充填します。充填されたエレクトロポレーションチューブをエレクトロポレーションシステムのピペットステーションにカチッという音がするまで挿入します。
エレクトロポレーション条件を 2 、 200 ボルト、20 ミリ秒、エレクトロポレーションシステムで 1 パルスに設定します。アデノ随伴ウイルスとの1時間のインキュベーションが完了したら、ウイルスを含む細胞を室温で300gで5分間遠心します。上清が吸引されたら、エレクトロポレーションシステムによって提供される細胞再懸濁緩衝液の100マイクロリットルに細胞ペレットを再懸濁します。
次に、サンプルあたり10.8マイクロリットルのリボ核タンパク質複合体を加え、泡を作らずにピペットでよく混ぜます。次に、ピペットを2番目のストップまで押してクランプを開くことにより、100マイクロリットルのエレクトロポレーションチップを挿入します。クランプがピストンの取り付けステムにしっかりとかみ合うまで、ピペットの上部ヘッドをエレクトロポレーションチップに配置します。
ピペットを下向きの圧力に保ちながらボタンを徐々に離し、チップが隙間なくぴったりと収まるようにします。次に、ピペットを最初のストップまで押し込み、エレクトロポレーションチップを細胞リボ核タンパク質混合物に浸します。サンプルを気泡が入らないようにピペットにそっと引き上げます。
サンプルが入ったエレクトロポレーションチップが取り付けられたピペットを、カチッという音が聞こえるまでEチューブに垂直に挿入します。ヒト制御性T細胞の最適な設定を確認した後、タッチスクリーンのStartを押して細胞をエレクトロポレートします。タッチスクリーンが完了するのを待ちます。
ピペットを静かに取り外し、すぐにサンプルを、ウェルあたり2.5ミリリットルの温めた抗生物質を含まないRPMI10培地とインターロイキン-2を含む準備済みの6ウェルプレートに移します。プレートを直線的に静かに揺さぶった後、組織培養インキュベーターに入れます。翌日、16〜18時間後に、培地を抗生物質含有培地と交換します。
エレクトロポレーションされた制御性T細胞を数え、インターロイキン-2の1ミリリットルあたり1,000国際単位を持つ1ミリリットルあたり6細胞の累乗で10で培養します。
