Questo lavoro è stato supportato da K12 HD068322 (SCM); CA179921 R01 e P51 OD011092 (AVM); e premio 14PRE20320014 da America Heart Association (SB).

Nota: tutte le procedure descritte in questo protocollo devono essere eseguite in condizioni di BSL-2.
 1. preparazione di KSHV Stock <ol><li>buffer di preparare TNE: sciogliere 292,24 mg di EDTA in ddH 2 O, portare a 225 mL e regolare a pH 8. Sciogliere mg 605,7 Tris in ddH 2 O portare a 225 mL e regolare a pH 8. EDTA e Tris soluzioni combinate, aggiungere 4,38 g NaCl, regolare il volume finale di 500 mL, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C .</li>
	<li>Cultura il KSHV-positivo, la linea EBV-negativi di cellule di linfoma primario di effusione BCBL-1 in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 in RPMI completato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e antimicrobici per circa 1 a 1.2 x 10 6 cellule per mL.</li>
	<li>Per indurre la produzione di KSHV, dividere Culture 1:2 con mezzo fresco e aggiungere Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) a una concentrazione finale di 20 ng/mL e incubare le colture per 5 giorni. In alternativa, trattare le cellule con butirrato del sodio (NaB; 0,1 mM) per 3 giorni per indurre la replicazione litica.</li>
	<li>Per raccogliere le particelle virali, prima di centrifugare il surnatante a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule e trasferire i surnatanti in provette di freschi della cultura.</li>
	<li>Per chiarire ulteriormente il supernatante in modo da evitare il trasferimento di detriti cellulari, centrifugare a 2.500 x g per 10 min a 4 ° C. 
	Nota: in alternativa alla centrifugazione ad alta velocità per la chiarifica dei surnatanti, filtrazione attraverso una sterile 0,45 µm filtro possa essere eseguita. Abbiamo osservato un calo significativo nel titolo mediante filtrazione; di conseguenza, eseguiamo regolarmente la seconda fase di centrifugazione invece.</li>
	<li>Successivamente, sovrapposizione di 5 mL di soluzione di saccarosio di 25% nel buffer di TNE con circa 30 mL di surnatante in 6 tubi di ultracentrifuga della cultura chiarificato.</li>
	<li>Centrifuga equilibrato tubi a 75.000 x g per 2 ore a 4 ° C sotto vuoto.</li>
	<li>Decantare il supernatante di coltura e macchia il bordo di ogni tubo per rimuovere quanto più soluzione supernatante e saccarosio come possibile, quindi risospendere il pellet di virus, che potrebbe non essere visibile, in 150 µ l di tampone TNE.</li>
	<li>Virus in piscina tutti risospesa, mescolare bene e congelare 25 aliquote di µ l a -80 ° C .</li>
</ol> 2. Trasduzione della CE con E6 ed E7 Papillomavirus Genes Nota: usiamo ordinariamente matracci di cultura del tessuto standard per la coltivazione EC. primaria Tuttavia, se insoddisfacente crescita della CE si ottengono quindi l'uso di matracci di cultura commerciale dovrebbe essere considerato.
<ol><li>Cultura primaria umana dermico microvascolare o linfatico CE in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 nel mezzo di crescita CE (EGM; contiene sostanza basale di CE [EBM] completato con EGM-2 BulletKit [contenente FBS, idrocortisone, fattore di crescita del fibroblasto umano-B, fattore di crescita vascolare CE, fattore di crescita insulino-simile-1, acido ascorbico, fattore di crescita epiteliale umano, antibiotici ed eparina]) in un matraccio di cultura cellulare T75 a circa 50% confluenza.</li>
	<li>Per trasduzione, cultura PA317 LXSN 16E6E7 cellule 24 , 35 in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 in DMEM completati con 10% FBS e antimicrobici in un Matraccio di cultura cellulare T150 fino a quando essi sono circa 90% confluenti. Quindi incubare per una notte in 16 mL di terreno.</li>
	<li>Chiarire il mezzo PA317 mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la EGM dalle cellule EC cultura e sovrapposizione con 12 mL di terreno PA317 chiarificato e incubare per 4 h. 
	Nota: Centrifugazione 16 mL di medium condizionato a 300 x g per 5 min risultati in una compatta a pellet che non è disturbato dalla successiva rimozione accurata di 12 mL di surnatante chiarificato. Tuttavia, se il trasferimento delle PA317 LXSN 16E6E7 cellule di colture primarie di CE è una preoccupazione (la linea cellulare di imballaggio rapidamente diventerà troppo grande per CE), filtrazione del surnatante condizionato attraverso un filtro da 0,45 µm prima del trasferimento può eseguire.</li>
	<li>Sostituire 6 mL di terreno PA317 con EGM fresco e incubare per una notte.</li>
	<li>Refeed CE con 12 mL EGM fresco e incubare un ulteriore 48 h.</li>
	<li>Per sub-cultura della CE, rimuovere il mezzo e lavare con 12 mL di PBS senza cationi e aggiungere 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica commerciale (ad esempio, TrypLE) di e incubare a 37 ° C per 3 min.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare risultante in EGM fresco e dividere in modo uniforme in 3 x T75 boccette con un volume finale di 12 mL EGM per fiaschetta.</li>
	<li>Per selezionare per CE trasformata con E6 ed E7, aggiungere G418 ad una concentrazione finale di 200 µ g/mL per due passaggi, dopo il quale la CE trasdotte può essere placcata per infezione o congelata in azoto liquido.</li>
</ol> 3. Infezione della CE trasdotte con KSHV <ol><li>il giorno prima dell'infezione vendemmia CE a digestione enzimatica utilizzando la soluzione di dissociazione enzimatica commerciale come descritto sopra. Risospendere le cellule in 1 mL di EGM. Utilizzare 5 µ l di cellule per preparare una diluizione 1/10 in blu di Trypan. Contare celle in tensione utilizzando un emocitometro e seme 2,5 x 10 5 cellule vive in 2 mL di EGM per pozzetto in piastre a pozzetti 6.</li>
	<li>Il giorno di infezione, EGM di rimuovere e lavare le cellule con 3 mL di PBS con calcio e magnesio per pozzetto e quindi aggiungere 2 mL EBM. 
	Nota: È indispensabile utilizzare EBM anziché EGM durante l'infezione, poiché l'eparina in EGM inibiscono la associazione di particelle virali per e successiva infezione di destinazione EC.</li>
	<li>Di infettare le cellule con KSHV, aggiungere brodo di virus di 5 a 20 µ l a ciascun pozzetto e ricciolo piatto per mescolare. Per cellule infettate da mock, aggiungere un volume equivalente di tampone TNE in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Centrifugare le piastre a 400 x g per 30 min a temperatura ambiente e poi incubare le piastre a 37 ° C per 90 min.</li>
	<li>Se l'obiettivo dello studio è di indagare gli eventi iniziali che richiedono un'infezione virale sincrona, ad esempio, eventi precoci nell'infezione de novo, rimuovere l'inoculo virale a questo punto. Sciacquare e le cellule con 2 mL di refeed EGM fresco. In caso contrario, aggiungere 2 mL EGM e incubare le colture durante la notte.</li>
	<li>Refeed cellule con 2 mL EGM il giorno dopo l'infezione e quindi ogni altro giorno.</li>
	<li>Quando le cellule sono circa 90% confluenti, vendemmia a digestione enzimatica con soluzione di dissociazione enzimatica commerciale come descritto sopra, quindi le cellule da tre pozzi in un T75, rilevando il numero di passaggio totale e il passaggio della piscina post-infezione.</li>
	<li>Espandere mock - e KSHV-infettato CE 1:3 divisioni per almeno due passaggi ulteriori, momento in cui le cellule possono essere utilizzate in esperimenti o congelate in azoto liquido. 
	Nota: Come con la scissione della CE trasformata con E6 ed E7, culture di manutenzione delle cellule infettate di derisione e KSHV dovrebbero essere diviso prima di raggiungere la confluenza (~ 85-90%).</li></ol>
 4. confermando l'infezione con KSHV dall'immunofluorescenza Nota: rilevamento di KSHV latenza-collegata nucleare antigene (LANA-1/ORF73) fornisce una misura quantitativa affidabile di infezione. Gli anticorpi anti-LANA sono disponibili in commercio.
<ol><li>Il giorno prima della colorazione, piastra due pozzetti ciascuna con mock - o KSHV-infettati CE su una piastra a 24 pozzetti a 1 x 10 5 cellule per bene in 1 mL EGM e incubare per una notte.</li>
	<li>Cellule di lavare due volte con 500 µ l di PBS più calcio e magniseum. Lavare per 30 s su una piattaforma oscillante.</li>
	<li>In un di cappa esternamente-Refriggerato, fissare le cellule con 500 µ l di paraformaldeide al 4% per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 plus siero di capra 0,02% in PBS più cationi).</li>
	<li>Bloccare le cellule con 500 µ l di siero di capra del 2% in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Etichetta un pozzetto di mock - o KSHV-infettati CE con 200 µ l di anticorpo primario diluito 01:100 in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente su un rocker. Incubare i rimanenti due pozzi a 200 µ l di tampone di lavaggio solo.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Etichetta tutti i quattro pozzi con 200 µ l di anticorpo secondario diluito 1: 100 in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente su un rocker.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Ad ogni pozzetto applicare 20 µ l di montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti e valutare che macchia usando un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
	<li>Determinare l'infezione percentuale di cellule infettate da KSHV contando il numero di nuclei di LANA-positivi in almeno 200 cellule. Infezione con ricombinante KSHV-Bac16 può essere monitorato anche tramite osservazione di culture per l'espressione della GFP.</li>
</ol>

Oncogenesi sono un processo multifasico che aggira precauzioni importanti all'interno di un organismo36. Come lesione KS esistano lungo uno spettro di infiammazione cronica al veri sarcomi, delucidazione di alcuni processi patofisiologici mediata da KSHV richiede che alcuni studi condotti in modelli di coltura cellulare che supportano la trasformazione9. Va notato che la perdita di inibizione da contatto e la crescita ancoraggio-dipendente, fenotipi indicativi di trasformazione cellulare, non si sviluppano prontamente dopo l'infezione primaria CE o CE immortalata dall'espressione esogena della telomerasi. Pertanto, mentre il modello in vitro di KS qui descritto non ricapitolare tutti gli aspetti del microambiente tumorale KS o il comportamento di cellule KS espiantate, è specificatamente concepita per studiare i cambiamenti nell'host cella espressione genica indotta tramite l'infezione con KSHV che contribuiscono al tumorigenesis KS.
Il primo ha segnalato l'espressione genica Studio utilizzando il sistema di cultura descritto nel presente documento identificato il recettore tirosina chinasi c-Kit come collaboratore per il fenotipo trasformato di cellule infettate KSHV25. Abbattere di espressione di c-Kit utilizzando siRNA o inibizione di c-Kit segnalazione utilizzando che un dominante negativo costrutto o tirosina chinasi inibitore STI 571 (Imatinib) ha interferito con la capacità trasforma del manifesto KSHV da perdita di formazione di fuochi dopo prolungato cultura delle cellule infettate. Successiva valutazione clinica dell'Imatinib ha dimostrato l'efficacia di questo farmaco in pazienti con epidemia KS47,48,49. Altri potenziali obiettivi di trattamento inoltre sono state identificate, compreso del heme oxygenase-126,50, CXCR727e la beta adrenergici28, che svolgono un ruolo nella crescita o trasformazione di CE in vitro. Conferma di questi pattern di espressione genica in primaria CE così come il tessuto di biopsia KS conferma la rilevanza fisiologica di questo sistema e sottolinea il suo valore come un modello pre-clinico per KS terapeutica25,26, 51,52,53,54,55.
Altro punto di forza del sistema di trasduzione E6/E7 è che la durata di vita estesa immortalato rispetto al primario CE consente il mantenimento a lungo termine di età e cellule di passaggio-abbinati di controllo mock-infettati per valutazione comparativa dei risultati di KSHV infezione. È fondamentale notare che, al fine di massimizzare il numero di passaggi della CE trasformata con E6 ed E7 è fondamentale per dividere culture prima di raggiungere la confluenza (~ 85-90%). Inoltre, queste cellule tollerano condizioni privo di siero per periodi prolungati di tempo. CE primario rapidamente subire la morte programmata delle cellule al momento del ritiro del fattore di crescita e pertanto non può essere colta per lunghi periodi senza siero o fattori di crescita ricombinanti56,57. Questa dipendenza rende autocrino indotte tramite l'infezione con KSHV difficili da identificare e studiare, come prima della completa trasformazione cellule infettate da KSHV anche subirà la morte programmata delle cellule al momento del ritiro del fattore di crescita (dati non pubblicato di vie di segnalazione osservazione). La presenza delle proteine E6 ed E7 in questo modello, tuttavia, impedire la morte programmata delle cellule dopo ritiro di fattore di crescita e consentire per prolungato (ad es., 48h) cultura in basso del siero o del siero libero medio25,26 , 28.
KS è una malattia complessa e insolita con le caratteristiche di infiammazione cronica e di trasformazione cellulare. La necessità clinica di nuove strategie terapeutiche è ottima, e il modello della coltura cellulare qui descritto ha proprietà uniche che consentono la valutazione del candidato bersagli farmacologici.

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore di angioproliferative multi-focale che interessano siti cutanei, mucosi e viscerali che si sviluppa più comunemente nella cornice di soppressione immune avanzata1. Sono state descritte quattro forme epidemiologiche: classic, una forma indolent che colpisce in genere persone anziane del patrimonio Mediterraneo e del Medio Oriente; iatrogena, derivando dal trattamento con farmaci immunosoppressori dopo trapianto dell'organo; epidemia, un cancro didefinizione; ed endemiche, una forma di HIV-indipendente comune nei bambini nelle regioni endemiche in Africa. Con l'avvento dei regimi della droga anti-retrovirale combinazione efficace per il trattamento dell'HIV, KS epidemica è molto meno comunemente diagnosticato in paesi in via di sviluppo. Tuttavia, le forme clinicamente aggressive endemiche ed epidemiche rimangono tra i più comunemente cancri diagnosticati in molti paesi africani2,3,4. Pertanto, l'identificazione di farmaci mirati a patogenesi efficaci per il trattamento di KS è una priorità di ricerca.
Istologicamente, KS lesioni sono caratterizzate da neovascolarizzazione abbondante ma anormali, per cui le cellule dell'alberino di origine CE formano reti vascolari discontinuo5. Questi vasi anomali ("fessure vascolari") consentono lo stravaso di eritrociti, che danno lesioni loro colore caratteristico. Inoltre, le lesioni contengono numerosi leucociti che caratterizzano l'infiammazione cronica (cioè, linfociti, macrofagi e plasmacellule). Regressione delle lesioni KS dopo ricostituzione immunitaria è stata descritta, suggerendo che KS ha caratteristiche di una lesione iper-proliferative sia un vero tumore6,7,8,9.
Il herpesvirus KS (KSHV), l'agente causativo di KS, è stato identificato nel 199410. Da allora molti in vitro coltura cellulare sono stati sviluppati modelli per attivare studi di patogenesi, comprese le cellule espiantati da materiale di biopsia del tumore e primaria o CE esprimendo la telomerasi è infettato da KSHV in vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. nessuno dei modelli attualmente disponibili completamente ricapitola il microambiente tumorale di KS, ma tutti hanno contribuito conoscenze preziose per la nostra comprensione del pathobiology dell'infezione di KSHV. A differenza del altri noto cancerogeno herpesvirus umano virus di Epstein - Barr (EBV), KSHV non prontamente trasforma le cellule in cultura seguendo de novo infezione19,20,21, 22. Tuttavia, questa limitazione è stata superata da transducing CE primaria umana del mescolato origine microvascolare o linfatico con la E6 ed E7 geni da papillomavirus umano tipo 16 prima dell'infezione con KSHV23,24 . Espressione di questi oncogeni esogeni aumenta notevolmente il potenziale trasforma di KSHV in vitro in parte fornendo ulteriore inibizione del retinoblastoma proteina e p5323,24. Questo metodo di trasduzione CE ha permesso più laboratori di identificare le alterazioni chiave nell'host espressione genica delle cellule che sono indotte dall'infezione di KSHV e che sembrano facilitare KS cella sopravvivenza e proliferazione25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. i protocolli descritti nel presente documento sono semplici e altamente riproducibile e comporterà la generazione di pari età e passaggio CE KSHV-infettati e controlli mock-infettati che possono essere coltivati per lontano più di cellule primarie e saranno consentire per l'indagine sui meccanismi oncogenici impiegato da KSHV. Anche se il protocollo include un metodo per la produzione di tipo selvaggio KSHV dalla linea cellulare linfoma primario di effusione BCBL-1, CE E6/E7-immortalata anche sono altamente suscettibili di infezione con BACmid ricombinante derivato KSHV-BAC1630. Protocolli per la preparazione di BAC16 sono descritti altrove33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore insolito composto di proliferazione delle cellule dell'alberino che è iniziato da infezione delle cellule endoteliali (CE) con KSHV e si sviluppa più spesso nella regolazione di immunosoppressione. Nonostante decenni di ricerca, il trattamento ottimale di KS rimane definito male e gli esiti clinici sono particolarmente sfavorevoli nelle impostazioni di risorse limitate. Le lesioni KS sono guidate da angiogenesi patologica, infiammazione cronica e oncogenesi e vari in vitro modelli di coltura cellulare sono stati sviluppati per studiare questi processi. KS deriva dalle cellule di KSHV-infettati di origine endoteliale, così le cellule CE-stirpe di fornire i più appropriati in vitro surrogati del precursore delle cellule dell'alberino. Tuttavia, perché CE hanno una durata limitata in vitro , e come i meccanismi oncogenici impiegati da KSHV sono meno efficaci di quelli di altri virus cancerogeno, è stato difficile valutare i processi di trasformazione primaria o telomerase-immortalized EC. Di conseguenza, è stato sviluppato un modello di romanzo cultura basata su CE che prontamente supporta la trasformazione dopo l'infezione con KSHV. Espressione ectopica dei geni E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 consente estesa cultura di pari età e passaggio mock - e KSHV-infettati CE e supporta lo sviluppo di un veramente trasformato (cioè, cancerogeno) fenotipo in colture di cellule infette . Questo modello altamente riproducibile e trattabile di KS ha facilitato la scoperta di diverse vie di segnalazione essenziale ad alto potenziale per la traduzione in contesti clinici.

La morfologia della primaria CE è classicamente descritto come "ciottoli", e questa morfologia non è alterata dall'espressione del papillomavirus E6 ed E7 geni (Figura 1A). Espressione dei geni E6 ed E7 da solo non induce un fenotipo trasformato; così, le cellule sono suscettibili di contattare inibizione e cesseranno dividendo dopo aver raggiunto la confluenza nella cultura. Le cellule saranno tuttavia proliferare e ricrescere alla confluenza su trypsinization e ricromatura ad una densità inferiore, consentendo per il mantenimento delle culture di passaggio-abbinato e dell'età per l'uso come controlli mock-infettati.
Infezione della CE E6/E7-trasdotte con KSHV causa drammatici cambiamenti morfologici nella cultura che ricordano il "delle cellule dell'alberino" fenotipo osservato nelle lesioni KS (Figura 1B). Un fenotipo trasformato è anche indotto a seguito di infezione con KSHV, che si manifesta in parte dalla perdita di inibizione da contatto quando le cellule sono coltivata post-confluenza (Figura 1) e la crescita ancoraggio-indipendente in agar molle (Figura 2). Perdita di inibizione da contatto e la dipendenza delle interazioni matrice extra-cellulare (ancoraggio) durante oncogenesi sono due delle caratteristiche di trasformazione cellulare36. È importante notare che il primario CE sono anche suscettibili di infezione con KSHV e sistemi primari CE sono stati estremamente utili per chiarire diversi aspetti dell'interazione virus-ospite e le sue conseguenze. Tali studi sono ben rappresentati nella letteratura e diversi esempi sono citati nel presente documento37,38,39,40,41,42,43 ,44.
Macchiatura immunofluorescente dimostra che la morfologia dell'alberino di cellule infettate da KSHV è associata con l'espressione della proteina virale LANA-1/ORF73 (Figura 3A e 3B, rosso). Come la concentrazione di virus nelle scorte varierà tra le preparazioni, il volume del virus aggiunto per pozzetto deve essere regolato in modo che raggiungono culture KSHV-infettati &#62; 90% infezione entro uno o due passaggi. Con passaggio seriale la percentuale di infezione si avvicinerà a 100% e verrà mantenuta per tutta la durata della coltura (circa 20 passaggi). Minore quantità di virus può essere utilizzato se uno studio delle influenze di paracrine è destinato, o se le celle adiacenti non infette sono desiderabili come controlli (ad esempio, per gli studi di immunofluorescenza che coinvolgono altre proteine di interesse). Colture infettate supportano anche l'espressione delle proteine virali litiche ma, come si osserva nelle lesioni di KS, solo una minoranza delle cellule nella cultura spontaneamente subirà litica riattivazione (Figura 3B, verde). Le cellule infettate con KSHV-BAC16, etichettato con GFP, anche sviluppano una morfologia dell'alberino (Figura 3 e 3D). Quando viene utilizzato KSHV-BAC16, sono ottenibili infettare le cellule con uno stock di virus concentrati diluiti in serie e valutando le cellule per l'espressione della GFP a 48h post di infezione usando flusso cytometry30titoli virali.
Per antivirus WT e ricombinante, genomi virali nelle preparazioni d'archivio possono anche essere misurati di purificazione del DNA da cellule infette, seguita dalla quantificazione di PCR dei livelli di KSHV DNA; Tuttavia, uno non deve presupporre che tutti i genomi sono infettive45. Se lo studio del ciclo litico KSHV è destinato, la riattivazione del virus può essere ottenuta stimolando CE con agenti che inducono come descritto sopra per le cellule BCBL-1, anche se l'efficienza di riattivazione è inferiore23. Il ciclo litico può anche essere indotta da trasduzione della CE con la proteina di transactivator KSHV ORF5046. Coerente con i risultati in altri modelli di coltura cellulare di KS, sia espressione spontanea e induzione chimica di KSHV geni virali E6/E7-esprimendo CE diminuisce nel tempo nonostante la manutenzione di un'infezione latente stabile11,16 .
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig1.jpg"> 
Figura 1: morfologia del mock - e KSHV infettati EC. (A) CE Mock-infettati monostrati esibire il classico cobble pietra aspetto di microscopia di contrasto di fase vitale. Senza le azioni dei geni KSHV queste cellule non vengono trasformate e saranno pertanto cessare dividendo e presentano inibizione da contatto dopo aver raggiunto la confluenza nella cultura. (B) cellule infettate da KSHV, al contrario, sviluppano una morfologia allungata "delle cellule dell'alberino" che ricorda delle cellule dell'alberino di KS. Questo pannello mostra la morfologia delle cellule infettate da KSHV giorno 5 PI giunti a confluenza. (C) cellule In KSHV-infettate, vasti cambiamenti nell'espressione genica delle cellule di host conducono alla trasformazione cellulare, che diventa evidente quando KSHV-infettate le cellule sono coltivate senza passaggio. In tali condizioni, cellule infettate da KSHV continuano anche dopo il raggiungimento di confluenza che conduce allo sviluppo dei fuochi a più strati delle cellule di proliferazione. Questo pannello mostra la morfologia delle cellule infettate da KSHV al giorno 14 PI, coltivate per post-confluenza 9 giorni. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54828/54828fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig2.jpg"> 
Figura 2: crescita indipendente Anchorage. Cellule non trasformate in genere subiscono apoptosi dopo la perdita di contatto con un substrato, un processo chiamato anoikis. (A) quando E6/E7-trasdotte mock-infettati CE, che non vengono trasformate, sono sospesi in agar molle e coltivate per due settimane che non formano colonie. (B) affetti da KSHV CE, che sono virus-ha trasformato, sono resistenti all'anoikis e formeranno colonie in agar molle. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54828/54828fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig3.jpg"> 
Figura 3: dimostrazione dell'espressione della proteina virale. (A), la morfologia del mandrino è evidente a seguito di infezione con KSHV (ingrandimento 40x). (B) la macchiatura immunofluorescente del campo stesso mostrato in (A) dimostra che la morfologia del mandrino è associata con l'espressione della proteina virale latenza ORF73 (rosso). Cellule infette supportano replicazione litica pure, come dimostrato da una piccola percentuale di cellule che esprimono il pro viralecessivity fattore ORF59 (verde). (A e B per l'ultima volta da riferimento26.) La morfologia dell'alberino di cellule infettate con il virus di KSHV-BAC16 (C) è associata con l'espressione della GFP (D) (20 ingrandimenti). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54828/54828fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K Views.  University of Minnesota Medical School. Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: un modello in vitro per lo studio dell&#39;angiogenesi (Intervista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

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Biologia

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell cytoskeletal structures. This involves the assembly-disassembly of higher-order macromolecular structures at a given time and location, a process that is particularly sensitive to perturbations caused by overexpression of proteins. Methods that can preserve protein homeostasis and maintain near-to-normal cellular morphology are highly desirable to determine the functional contribution of a protein of interest in a wide range of cellular processes. Transient depletion-rescue experiments based on RNA interference are powerful approaches to analyze protein functions and structural requirements. However, reintroduction of the target protein with minimum deviation from its physiological level is a real challenge. Here we describe a method termed adenofection that was developed to study the role of molecular chaperones and partners in the normal operation of dividing cells and the relationship with actin remodeling. HeLa cells were depleted of BAG3 with siRNA duplexes targeting the 3&#39;UTR region. GFP-tagged BAG3 proteins were reintroduced simultaneously into &#62;75% of the cells using recombinant adenoviruses coupled to transfection reagents. Adenofection enabled to express BAG3-GFP proteins at near physiological levels in HeLa cells depleted of BAG3, in the absence of a stress response. No effect was observed on the levels of endogenous Heat Shock Protein chaperones, the main stress-inducible regulators of protein homeostasis. Furthermore, by adding baculoviruses driving the expression of fluorescent markers at the time of cell transduction-transfection, we could dissect mitotic cell dynamics by time-lapse microscopic analyses with minimum perturbation of normal mitotic progression. Adenofection is applicable also to hard-to-infect mouse cells, and suitable for functional analyses of myoblast differentiation into myotubes. Thus adenofection provides a versatile method to perform structure-function analyses of proteins involved in sensitive biological processes that rely on higher-order cytoskeletal dynamics.

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Studio del meccanismo di trasporto dello zinco nelle cellule di mammifero con il saggio FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Autore in primo piano: Esplorare la regolazione cellulare dello zinco attraverso la funzionalità ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Caratterizzazione dei trasportatori di zinco nei mammiferi mediante un saggio di trasporto dello zinco in vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...