Name: ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1
Uploaded: 2015-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
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我々は、技術的な助言をB6.A2G-Mx1のマウスとSemraÖzcelikを提供するためのピーターStaeheliに感謝します。 この作品は、SFB829とKN536 / 16を通じてドイツ研究財団、医学のケルンフォーチュンプログラム/学部、ケルン大学によってサポートされていました。

倫理ステートメント。 屠殺した動物からの表皮シートの製造はLandesamtエリーゼナチュール、環世界とVerbraucherschutz、ノルトライン=ヴェストファーレン（ドイツ）のガイドの勧告に厳密に従って実施されます。研究はLANUV NRW（番号8.84-02.05.20.13.018）によって承認されました。 楽器と培養培地の調製<ol><li>グルタミンジペプチド、10％FCS、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシン（以下「DMEM」と称する）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/高グルコースに表皮シートを養います。 </li><li>表皮シートの製造のために、慎重に加熱したPBSでディスパーゼII粉末（5 mg / mlの）を溶解（最大37℃）。 0.22μmのフィルターを通して溶液を濾過し、治療のためにそれを直接使用しています。 </li><li>表皮全体の製造は13をマウントするために、バフを遮断準備0.5％の粉乳、冷水魚皮から0.25％のゼラチン及びTBS中0.5％のTriton X-100とER。物質は、回転ミキサー上で室温で少なくとも2時間混合物をインキュベートすることによって溶解させます。また、洗浄用緩衝液としてPBS中の0.2％のTween 20を準備します。固定のために、3.4％、PBS中4％ホルムアルデヒドを準備します。 </li><li>凍結切片の免疫染色のために、PBS中の5％正常ヤギ血清および0.2％Tween 20でブロッキングバッファーを準備します。固定のため、PBS中の0.5％ホルムアルデヒドを準備します。 </li></ol>マウスの皮膚から表皮シートの作製<ol><li>感染研究のための新生児背中の皮膚からの表皮の調製<ol><li>解剖皿に断頭マウス（生後1〜3日）を配置し、四肢と完全な胴体から皮膚の効率的な除去を可能にする胴体に近い尾をカット。四肢の除去中に、直径が可能な限り小さくカットを維持しようとします。 </li><li>湾曲した微細な鉗子Aと胴体を修正優しく胴体から皮膚を分離するために、バックに沿って尾側する頭蓋から皮膚の下に鈍い先端のはさみを動かすND。背面に沿って皮膚をスリット。 </li><li> FACS分析、ケラチノサイトまたはRNAの準備を単離するために、胴体をオフにプッシュする組織と鈍い先端のはさみを修正するために鉗子を使用して、胴体から完全に皮をはがし。凍結切片またはホールマウントの調製のために背中の皮膚の部分だけを取ります。 </li><li>約10×10mmの1-2個にメスで背部皮膚をみじん切りに。 〜1ミリリットル滅菌PBSで6ウェルプレートの1ウェルに作品を配置。真皮側が下を向いていることを確認します。 </li><li> 1.5ミリリットルのディスパーゼIIでPBSを交換してください（5 mg / mlのPBS）と（ホールマウント用）、37℃で、またはO / N 4℃で30分間のいずれかでインキュベートします。 PBSで3回洗浄します。静かに表皮を持ち上げるために、基礎となる真皮および他の鉗子を修正するために、1つの鉗子を使用して、完全なシートとして表皮を除去します。このステップEASを作るために双眼鏡を使用して、Y。下部にその基底側を含むDMEMに表皮シートを転送します。感染実験のためにすぐにシートを使用してください。 注：主にFACS分析、ケラチノサイトまたはRNAの準備を単離するための新生児の皮膚からの表皮の準備を使用してください。理由は、その脆弱性のため、凍結切片またはホールマウントのための感染シートの製造は、あまり適していません。 </li></ol></li><li>感染研究のための大人の尾の皮膚から表皮の調製<ol><li>頚椎脱臼により1〜3ヶ月の年齢でマウスを安楽死させます。背中の長い埋め込み毛包が無傷の表皮シートの分離を妨げるので、代わりに背中の皮膚の尾を取ります。屠殺したマウスから尾をカットし、メスで長さ方向にスリット。 </li><li>骨から皮をはがしし、約5×5mmの小片にメスでそ​​れを切ります。 1つのウェルに4枚まで入れて、2.1.5で説明したようにディスパーゼII中でのインキュベーションを進めます 注：使用大人太極拳リットルの皮膚は、凍結切片またはホールマウントを調製しました。あるいはすぐに使用する、尾部は、かなりの感染効率を損なうことなく記憶または4℃で約24時間、輸送することができます。尾部は、4​​8時間まで維持される場合、表皮シートがほとんどHSV-1に感染したことはできませんでした。 </li></ol></li><li> FACS分析のために表皮の解離 注：FACS分析による表面タンパク質の発現の検出は、細胞表面と目的のタンパク質を損なわない適切な細胞分離技術を必要とします。 <ol><li> RTで15分間、1.5ミリリットル/ウェルの組換えトリプシンに基づく細胞解離溶液に、37℃で15分間基底側を6ウェルプレート中の新生表皮シートをインキュベートします。 </li><li> 3ミリリットルのDMEMを追加することにより、インキュベーションを停止します。ケラチノサイトが溶解を得るように穏やかに6ウェルプレートに表皮を移動させるように湾曲した微細なピンセットを使用して、ケラチノサイトを解離します。細胞懸濁液を収集し、このステップを3回繰り返します常に新鮮なDMEMを使用。 注：この解離手法は、ケラチノサイトの表面にネクチン1を検出することが適当です。 </li><li>あるいは、RTで15分間、37℃で15分間、酵素を含まない細胞解離溶液に表皮シート（CDS）をインキュベートします。優しく上下CDSをピペットでケラチノサイトをフラッシュするために、室温でさらに15分間インキュベートします。 </li><li>細胞懸濁液を収集し、新鮮なDMEMを使用して、フラッシング工程を3回繰り返します。 注：この解離がHVEMの表面発現を検出するのに適しています。 CDS溶液の欠点は、より少ない細胞が、組換えトリプシンに基づく細胞解離溶液よりも解離することです。表面発現に加えて、ICP0式として、核または細胞質発現は、組換えトリプシン基づく細胞解離溶液で感染表皮シートの解離後にFACSによって分析することができます。 </li></ol></li><li>ケラチノサイトまたはexを単離するための表皮の解離道のRNA <ol><li> 1.5ミリリットル/ウェルの組換えトリプシン基づく細胞解離溶液を含んでいる皿の底部に向かって基底側で6ウェルプレートに新生児表皮シートを置きます。 RTで30分間インキュベートします。 3ミリリットルのDMEMを加え、穏やかに皿に表皮を移動するために、湾曲細かい鉗子を使用して、ケラチノサイトを解離。 </li><li>細胞懸濁液を収集し、新鮮なDMEMを使用して、この手順を3回繰り返します。この細胞懸濁液は、RNAを抽出したり、文化の一次マウスケラチノサイトにするために使用します。 </li></ol></li></ol> HSV-1と表皮シートの3感染<ol><li> 500μlのDMEM以上にHSV-1 WT株17 11の溶液を調製し、表皮シートはフローティングされたウイルス液で培地を交換してください。この時点は、0時間12として定義される。37℃で24ウェルプレートの1ウェルに表皮シートの感染を行っ。ウイルス力価の計算は、推定された数に基づいています表皮シート（5×5 mmのシートあたり約2×10 5細胞 ）あたりの基底層での細胞。 </li><li> HSV-1で約100プラーク形成単位（P​​FU）/細胞で感染し、1時間のパイでDMEMによるウイルス含有培地を交換 注：新生児の皮膚から表皮シートの場合、シートはインキュベーション中に解離し始めることに注意してください。 </li></ol>感染した細胞の可視化4. <ol><li>表皮ホールマウント13 <ol><li> RTまたはOで2時間/ N 4℃のいずれかの3.4％ホルムアルデヒドで表皮シートを修正。 PBSで2回洗浄し、0.5％粉乳、冷水魚皮、室温14で1時間、TBS中の0.5％のTriton X-100 0.25％ゼラチンでブロックします。 </li><li> 15を室温でブロッキング緩衝液中で1:60に希釈したマウス抗ICP0（モノクローナル抗体11060）とシートO / Nインキュベートします。中間径フィラメントネットワークを可視化するために、ウサギポリクローナルと同時にインキュベート抗マウスケラチン14（100ng / mlの）。 </li><li>室温で4時間の間に、PBS-0.2％Tween 20で4〜5回洗浄します。 AF488結合抗マウスIgG（1 / mlの）、AF555結合抗ウサギIgG（1 / mlの）、およびDAPI（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）（100 ngのでO / Nインキュベート/ ml）を、室温でブロッキング緩衝液中。 </li><li>室温で4時間、PBS-0.2％Tween 20で洗浄します。試料スライドの上にその基底側マウントの表皮シート、蛍光マウンティング培地中に埋め込んで、カバーガラスでカバーしています。 </li></ol></li><li>表皮凍結切片<ol><li>成人表皮シートを室温で20分間、PBS中の4％ホルムアルデヒドで固定し、PBSで2回洗浄しました。液体窒素中の培地と凍結凍結組織で固定シートを埋め込みます。クライオミクロトームで8-10ミクロンのセクションをカット。 </li><li> RTで10分間PBS中0.5％ホルムアルデヒドで再びセクションを修正、PBSで2回洗浄し、5％正常ヤギ血清でブロックし、0.2％Tween 20をPBS中で室温で30分間、次いで、Mで60分間染色ウーズ抗ICP0（モノクローナル抗体11060）15は、ブロッキング緩衝液で3回洗浄し、続いて、ブロッキング緩衝液中で1:60に希釈しました。 </li><li>その後、RTで45分間ブロッキング緩衝液中にAF488結合抗マウスIgG（1μg/ ml）およびDAPI（100ng / mlの）でインキュベートし、3回洗浄します。蛍光マウンティング培地中のセクションを埋め込み、カバーガラスでカバーしています。 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

C57BL / 6から、成人の皮膚の表皮シートは、HSV-1に感染している場合で約100 PFU /細胞より低いウイルス用量が少なく、感染細胞と相関し、遅いながら、私たちは、毛包間表皮内の基底層のほぼ全ての細胞に感染を観察感染の進行。一般的には、毛包には、感染した細胞の可変数を示します。開発毛包の内側を覆うかなり小さいケラチノサイトのほとんどが感染している間、大人の毛包の唯一の?...

単純ヘルペスウイルス（HSV）は、生命を脅かす感染症に軽度の合併症のない皮膚粘膜病変から、ヒトでの疾患の範囲を引き起こす可能性があります。 HSV 1型（HSV-1）が支配的に可能性が高い生殖器感染症を引き起こす1 HSV 2型（HSV-2）、一方、口腔顔面感染症および脳炎に関連しています。 HSVは、培養中の細胞に入り、感染を開始し、ウイルス子孫を生産する方法を理解する上で重要な進展があるが、我々は細胞レベル2での組織へのウイルスの侵入経路（複数可）について少し知っています。 HSV皮膚または感染、マウス、ウサギ、モルモット、粘膜の研究のための動物モデルとして使用されています。皮膚感染は皮内注射によって、またはウイルスの存在下で肌を掻くことによって設立され、病気の発症は、ウイルス産生と相関していました。これらの方法は、疾患の病因の様々な側面を理解することを助け、及び抗ウイルス薬を評価するために使用されます。 TISSUでHSV感染を研究するために、Eレベルは、器官型ヒト皮膚モデルが適用されています。感染率は、これらのいかだ培養で制限されているように、感染症、ウイルスの拡散および抗ウイルス成分の影響を調査した研究の限られた数しか3-6を公開されています。 無傷の上皮におけるHSV-1感染の間に役割を果たしている細胞の決定を特徴づけるために、我々は、マウスの表皮7のex vivo感染研究のためのプロトコルを確立しました。皮膚は、新生児からか、成体マウスの尾から調製しました。 HSV-1は、ウイルス含有培地中に浸漬した完全な皮膚サンプルを、感染することができませんでしたので、私たちは、ディスパーゼII処理によって真皮から表皮を分離しました。ウイルス含有培地上で表皮シートの浮上した後、感染した細胞を様々な時間感染後（PI）7に表皮基底層に可視化することができます。ウイルス複製Aの​​前に、個々の細胞における感染の開始を可視化しますNDウイルス産生は、我々は、HSV-1感染中に発現最初のタンパク質のうちの1つである感染した細胞の蛋白質0（ICP0）に対する抗体で染色しました。 ICP0の細胞内局在は、初期感染時に明確な相を通過します。 ICP0は、ウイルス遺伝子発現の初期段階の間に、核病巣に存在するが、細胞質へのICP0の再局在は、感染8の次の段階を示しています。 我々は、感染の間に、様々な細胞因子の潜在的な役割をテストするために別のマウスモデルから表皮シートの ex vivo感染アッセイを使用していました。アクチンダイナミクスの重要な調節因子としてのRac1の影響に対処するために、我々は、RAC1遺伝子9のケラチノサイト特異的欠失を有するマウスの表皮を感染させました。このモデルは、表皮角化細胞層におけるHSV-1感染の効率に欠損のRac1の影響を研究するために私達を可能にしました。再対照同腹子の感染表皮との比較Rac1の不在は、表皮の基底層7における感染の開始に影響を及ぼさないことを示し、有意差はvealedありません。さらに、マウスモデルの使用は、私たちは細胞の受容体は、表皮内への進入を媒介する対処することができました。 HSV-1とネクチン1またはHVEM欠損マウスのいずれかから感染表皮シートは、組織への最初のウイルスの侵入を強くネクチン1 10の存在に依存することを明らかにしました。さらに、我々の結果は、HVEMはまた、ネクチン1 10未満の効率が、マウスの表皮における受容体として働くことができることを実証しています。 表皮層における感染細胞の空間分布に対処するために、我々は、組織切片および表皮ホールマウント（ 図1）にICP0発現を可視化します。完全な皮膚の凍結切片では、何のICP0発現細胞は、（ 図1）検出されません。対照的に、表皮シートの凍結切片は、細胞質を実証すでに3時間のPI（ 図1）での基底層でICP0式。後の時点で、基底層直上の層に拡散するウイルスを可視化することができます。基底層中の感染細胞の空間分布は、容易に表皮ホールマウント（ 図1）に従うことができます。 100 PFU /細胞でのHSV-1の感染の際に、毛包間表皮における基底ケラチノサイトの約50％が最も感染した細胞が核ICP0を表現するこの時点で1.5時間のパイでICP0の発現を示します。初期遺伝子発現の後の段階を示す細胞質へICP0の再局在は、3時間のPI（ 図1）で、ほぼすべての細胞に存在します。 ex vivoで HSV-1感染時に感染した細胞を可視化これらのモードは、阻害剤のまたは組織中のウイルスの侵入と拡散上/削除変異した細胞成分の効果を研究するための強力なアッセイを提供します。

<table><tbody><tr><td>DMEM/high glucose/GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966047</td><td>needed for cultivation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>dispase II powder</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>has to be solved in heated PBS</td></tr><tr><td>enzyme-free cell dissociation solution</td><td>Sigma</td><td>C5914</td><td>needed for very gentle dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>TrypLE select cell dissociation solution</td><td>Life Technologies</td><td>12563-029</td><td>needed for dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>chelex 100 resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td>needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum</td></tr><tr><td>gelatin from cold water fish skin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>needed for minimization of non-specific antibody binding</td></tr><tr><td>Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td>used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-21429</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (conc.: 0.1 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>36670</td><td>used to counterstain the nucleus</td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1

そのヒト宿主を入力するには、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）は、粘膜表面、皮膚、または角膜の障壁を克服しなければなりません。 HSV-1の目標は、最初の入力時にケラチノサイトおよび神経細胞の潜伏感染が続いている上皮における一次感染を確立します。再活性化した後、ウイル​​スは皮膚の小胞または粘膜潰瘍として現れる皮膚粘膜のサイトで明らかになることができます。 HSV-1は、皮膚や粘膜に侵入し、到達したか、その受容体は、あまり理解されていません。細胞レベルでの上皮組織へのHSV-1の侵入経路を調べるために、我々は、皮膚中の原発性および再発性感染症の部位を表すマウス表皮の ex vivo感染モデルを、確立しました。アッセイは、マウスの皮膚の準備が含まれています。表皮は、ディスパーゼII処理により真皮から分離されています。ウイルス含有培地に表皮シートを浮遊した後、組織が固定され、感染による種々の時間の感染後に視覚化することができますHSV-1前初期タンパク質ICP0に対する抗体を感染させた細胞を染色します。 ICP0発現細胞は、1.5時間の感染後に既に基底ケラチノサイト層で観察することができます。より長い感染時間で、感染した細胞は、感染は、基底ケラチノサイトに限定されないことを示す、基底上層において検出されるが、ウイルスが組織内の他の層に広がります。様々なマウスモデルの表皮シートを使用して、感染のプロトコールは、組織内へのHSV-1の侵入に寄与する細胞成分の関与を決定することができます。さらに、アッセイは、初期エントリ段階、細胞から細胞への広がりおよびウイルス産生を妨害する組織で阻害剤を試験するのに適しています。ここでは、詳細にex vivoでの感染プロトコルを記述し、ネクチン1またはHVEM欠損マウスを用いて、我々の結果を提示します。

この方法の課題は、HSV-1は、基底層から浸透することが可能に表皮シートを調製することです。重要なステップは、マウスの系統に応じて、適合させる必要があり、ディスパーゼII処理によって真皮から表皮を分離することです。ディスパーゼIIの濃度は、2.5から5 mg / mlの、そして20〜45分間のインキュベーション時間の範囲であることができます。中間フィラメントタンパク質のケラチン14の?...

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Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

11.1K ビュー.  University of Cologne. The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

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Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

免疫・感染学

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

単純ヘルペスウイルスの待ち時間と再活性化の研究の主ニューロン培養システム

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

マウスにおける再発性ヘルペス性間質性角膜炎、人間のHSKを研究するためのモデル

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

急性上皮単純ヘルペスウイルスI型感染の ex vivo器官角膜モデル

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

神経科学

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a seroprevalence that ranges from 60-90% worldwide, the Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) commonly causes mucocutaneous lesions of the orofacial region which also manifest as lesions and infection-associated blindness. While current antiviral drugs are effective, emergence of resistance and persistence of toxic side-effects necessitates development of novel antivirals against this ubiquitous pathogen. Although in vitro assessment provides some functional data regarding an emerging antiviral, they do not demonstrate the complexity of ocular tissue in vivo. However, in vivo studies are expensive and require trained personnel, especially when working with viral agents. Hence ex vivo models are efficient yet inexpensive steps for antiviral testing. Here we discuss a protocol to study infection by HSV-1 using porcine corneas ex vivo and a method to treat them topically using existing and novel antiviral drugs. We also demonstrate the method to perform a plaque assay using HSV-1. The methods detailed may be used to conduct similar experiments to study infections that resemble the HSV-1 pathogen.

We describe the use of a porcine cornea to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

単純ヘルペスウイルス-1抗ウイルス薬の有効性を研究するブタ角膜組織外植

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

単純ヘルペスウイルスのプラーキング

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

siRNA-Based Inhibition of Autophagy in Herpes Simplex Virus-Infected Immature Dendritic Cells

Source: D&#252;thorn, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60190">siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a small interfering RNA (siRNA)-based technique to interfere with autophagic flux. A siRNA targeting FIP200 mRNA is introduced into monocyte-derived immature dendritic cells (iDCs) using electroporation, causing the knockdown of FIP200 expression and leading to the inhibition of nuclear lamin disruption via autophagy. Upon adding herpes simplex virus (HSV), the nuclear egress of viral progeny is inhibited due to the absence of lamin disruption via autophagic flux.

siRNAによる単純ヘルペスウイルス感染未成熟樹状細胞におけるオートファジーの阻害

Monocyte-derived DCs were generated from leukapheresis products of healthy donors. For this, a positive vote from the local ethics committee has been ...