Diese Arbeit wurde durch K12 HD068322 (SCM) unterstützt; R01 CA179921 und P51 OD011092 (AVM); und 14PRE20320014 aus Amerika Heart Association (SB).

Hinweis: alle in diesem Protokoll beschriebene Verfahren durchgeführt werden, unter Bedingungen der BSL-2.
 1. KSHV Lager Vorbereitung <ol><li>bereiten TNE Puffer: auflösen 292,24 mg EDTA in DdH 2 O, 225 mL bringen, und passen Sie auf pH 8. 605,7 mg Tris in DdH 2 O auflösen, bis 225 mL bringen und auf pH 8 anpassen. EDTA und Tris Lösungen kombinieren, hinzufügen 4,38 g NaCl, endgültige Lautstärke bis 500 mL, filtern, Sterilisation und Lagerung bei 4 ° C .</li>
	<li>Kultur KSHV-positiv, EBV-Negative primären Erguss Lymphome Zelllinie BCBL-1 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C plus 5 % CO 2 in RPMI ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und Antibiotika, ca. 1 1.2 x 10 6 Zellen pro mL.</li>
	<li>Induzieren KSHV Produktion aufgeteilt Kulturen 1:2 mit frischem Medium und eine Endkonzentration von 20 ng/mL Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) hinzu und inkubieren Sie Kulturen für 5 Tage. Als Alternative Behandlung von Zellen mit Natrium-Butyrat (NaB; 0,1 mM) für 3 Tage induzieren lytische Virusreplikation.</li>
	<li>Um Viruspartikel zu ernten, Zentrifugieren Sie zuerst die Kultur Überstand bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur pellet-Zellen und Überstände auf frischen Rohre übertragen.</li>
	<li>Zur weiteren Klärung des Überstands um Zelltrümmer, vermeiden Zentrifugieren bei 2.500 x g für 10 min bei 4 ° c 
	Hinweis: als Alternative zu high-Speed Zentrifugation zur Klärung der Kultur Überstände, Filtration durch eine sterile 0,45 µm Filter durchgeführt werden kann. Wir haben einen deutlichen Rückgang der Titer mit Filtration beobachtet; Daher führen wir den zweiten Zentrifugationsschritt routinemäßig statt.</li>
	<li>5 mL 25 % Saccharoselösung in TNE Puffer mit etwa 30 mL der Überstand in 6 Ultrazentrifugen Rohre geklärte Kultur als nächstes überlagern.</li>
	<li>Zentrifuge ausgeglichen bei 75.000 x g für 2 h bei 4 ° C unter Vakuum Röhren.</li>
	<li>Kultur überstand abgießen und tupfen Sie den Rand des jedes Rohr, so viel überstand und Saccharose Lösung wie möglich zu entfernen, dann Aufschwemmen der Virus-Pellets, die möglicherweise nicht sichtbar, in 150 µL TNE Puffer.</li>
	<li>Alle Pool Nukleinsäuretablette Virus, vermengen, und frieren 25 µL-Aliquots bei-80 ° C .</li>
</ol> 2. Transduktion der EG mit E6 und E7 Papillomavirus Genes Hinweis: Wir verwenden routinemäßig standard Gewebe Kulturflaschen für den Anbau von primären EC Jedoch wenn unbefriedigende Wachstum der EG erhalten werden dann die Verwendung von kommerziellen Kulturflaschen berücksichtigt werden.
<ol><li>Kultur primären menschlichen dermalen mikrovaskuläre oder lymphatischen EG in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C plus 5 % CO 2 im EG Wachstumsmedium (EGM; enthält EG basal Medium [EBM] mit EGM-2 BulletKit [mit FBS, ergänzt Hydrocortison, menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-B vaskulären EG Wachstumsfaktor, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1, Ascorbinsäure, menschliche epithelialen Wachstumsfaktor, Antibiotika und Heparin]) in einem T75 Zelle Kultur Kolben um ca. 50 % Zusammenfluss.</li>
	<li>Für die Transduktion, Kultur PA317 LXSN 16E6E7 Zellen 24 , 35 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C zuzüglich 5 % CO 2 in DMEM mit 10 % FBS und Antibiotika in ergänzt eine T150 Zelle Kultur Flasche bis sie ca. 90 % Zusammenfluss sind. Dann über Nacht in 16 mL Medium inkubieren.</li>
	<li>Das PA317 Medium durch Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu klären.</li>
	<li>Entfernen die EGM aus den EG-Kultur und Overlay-Zellen mit 12 mL des Mediums geklärte PA317 und inkubieren Sie für 4 Std. 
	Hinweis: Zentrifugieren 16 mL konditionierten Medium 300 X g für 5 min ergibt eine kompakte Kugel, die durch die sorgfältige nachträgliche Entfernung von 12 mL geklärte Überstand nicht gestört wird. Jedoch wenn Übertragung der PA317 LXSN 16E6E7 Zellen Primärkulturen EG ist ein Anliegen (die Verpackung-Zell-Linie wird schnell entwachsen EG), dann Filtration von konditionierten Überstand durch einen 0,45 µm-Filter vor dem Transfer erfolgen kann.</li>
	<li>6 mL des Mediums PA317 mit frischen EGM zu ersetzen und über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Refeed EG mit 12 mL frische EGM und inkubieren Sie eine weitere 48 h.</li>
	<li>EG, Sub-Kultur Medium zu entfernen und waschen mit 12 mL PBS ohne kationen, und geben Sie 3 mL kommerzielle enzymatische Dissoziation Lösung (z.B. TrypLE) und Inkubation bei 37 ° C für 3 min.</li>
	<li>Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr übertragen und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aufschwemmen der daraus resultierenden Zelle Pellet in frischen EGM und teilen gleichmäßig in 3 x T75 Flaschen mit einem Endvolumen von 12 mL EGM pro Flasche.</li>
	<li>G418 hinzufügen um EG ausgestrahlt mit E6 und E7 zu wählen, eine Endkonzentration von 200 µg/mL für zwei Durchgänge, nach denen die transduced EG vernickelt für Infektion oder in flüssigem Stickstoff eingefroren.</li>
</ol> 3. Infektion der ausgestrahlt EG mit KSHV <ol><li>am Tag vor der Infektion ernten EG durch enzymatische Verdauung mit der kommerziellen enzymatische Dissoziation-Lösung, wie oben beschrieben. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 1 mL der EGM. Verwenden Sie 5 µL Zellen, um eine 1/10-Verdünnung in Trypan blau vorzubereiten. Lebende Zellen mit einem Hemocytometer zu zählen und Samen 2,5 x 10 5 lebende Zellen in 2 mL EGM pro Bohrloch in 6-well-Platten.</li>
	<li>Am Tag der Infektion entfernen EGM waschen Zellen mit 3 mL PBS mit Calcium und Magnesium pro Bohrloch, und fügen Sie dann 2 mL EBM. 
	Hinweis: Es ist unerlässlich, EBM, anstatt EGM während der Infektion, zu verwenden, wie das Heparin in EGM Viruspartikel zu Bindung und anschließende Infektion des Ziels EC hemmen wird</li>
	<li>Zellen mit KSHV, infizieren 5 bis 20 µL Virus Brühe in jede Vertiefung und wirbeln Teller mischen. Für Mock-infizierten Zellen ein gleiches Volumen an TNE Puffer in jede Vertiefung hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Platten bei 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 90 min.</li>
	<li>, Wenn das Ziel der Studie werden frühe Ereignisse erfordern eine synchrone virale Infektion, z.B. frühe Ereignisse in de Novo Infektion untersucht soll entfernen das virale Inokulum an dieser Stelle. Spülen und refeed Zellen mit 2 mL frische EGM. Andernfalls fügen 2 mL EGM und Kulturen über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Zellen mit 2 mL EGM am Tag nach der Infektion und dann jeden zweiten Tag refeed.</li>
	<li>Wenn Zellen sind etwa 90 % Zusammenfluss Ernten durch enzymatische Verdauung mit kommerziellen enzymatische Dissoziation-Lösung wie oben beschrieben, dann die Zellen aus drei Brunnen in einem T75 unter Hinweis auf die gesamte Durchgangsnummer und die Passage zu bündeln nach der Infektion.</li>
	<li>Erweitern Mock und KSHV-infizierten EG mit 1:3 Zwischenzeiten für mindestens zwei weitere Passagen zu welchem Zeitpunkt Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren oder in Experimenten verwendet werden können. 
	Hinweis: Wie bei der Aufteilung der EG mit E6 und E7 ausgestrahlt, Wartung Kulturen von Mock und KSHV-infizierten Zellen sollte aufgeteilt werden vor dem Erreichen der Mündung (~ 85 bis 90 %).</li></ol>
 4. Bestätigung Infektion mit KSHV durch Immunfluoreszenz Hinweis: Erkennung von der KSHV Latenz-assoziierten nuclear Antigen (LANA-1/ORF73) bietet eine zuverlässige quantitative Messung der Infektion. Anti-LANA-Antikörper sind im Handel erhältlich.
<ol><li>Am Tag vor der Färbung, Platte zwei Brunnen, die jeweils mit Mock-KSHV-infiziert oder EG auf einer 24-Well-Platte 1 x 10 5 pro Zellen nun in 1 mL EGM und über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Waschen Zellen zweimal mit 500 µL PBS plus Calcium und Magniseum. Waschen für 30 s auf einem schaukelnden Plattform.</li>
	<li>Zellen mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur in einem extern-beatmete Dampfhaube befestigen.</li>
	<li>Waschen Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer (0,1 % Triton x-100 plus 0,02 % Ziegenserum in PBS plus kationen).</li>
	<li>Zellen mit 500 µL 2 % Ziegenserum in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur blockieren.</li>
	<li>Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.</li>
	<li>Kennzeichnen einen Brunnen von Mock-KSHV-infiziert oder EG mit 200 µL Primärantikörper 01:10 verdünnt0 in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Inkubieren Sie die verbleibenden zwei Brunnen in 200 µL Waschpuffer nur.</li>
	<li>Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.</li>
	<li>Beschriften aller vier Brunnen mit 200 µL Sekundärantikörper verdünnt 1: 100 in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Rocker.</li>
	<li>Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.</li>
	<li>In jede Vertiefung gelten 20 µL Montage mittlerer mit DAPI und ein Deckglas und bewerten Färbung mit einem inversen Mikroskop fluoreszierende.</li>
	<li>Bestimmen die prozentuale Infektion KSHV-infizierten Zellen durch zählen der Anzahl der LANA-positiven Kerne in mindestens 200 Zellen. Infektion mit rekombinanten KSHV-Bac16 sich auch durch Beobachtung der Kulturen für den Ausdruck der GLP lässt.</li>
</ol>

Onkogenese ist ein mehrstufiger Prozess, der wichtige Sicherheitsvorkehrungen innerhalb eines Organismus36umgeht. KS-Läsionen entlang ein Spektrum der chronischen Entzündung zu wahren Sarkome bestehen, erfordert Aufklärung bestimmter pathophysiologischen Prozesse durch KSHV vermittelt, dass einige Studien in Zellmodellen Kultur durchgeführt werden, die Umwandlung9unterstützen. Es sollte angemerkt werden, dass Verlust von Kontakt-Hemmung und Anchorage-abhängigen Wachst...

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Multi-focal Angioproliferative Tumor Auswirkungen auf Haut, Schleimhaut und viszeralen Websites, der am häufigsten in der Umgebung von fortgeschrittenen Immununterdrückung1entwickelt. Vier epidemiologische Formen sind beschrieben worden: Classic, eine träge Form, das in der Regel ältere Menschen des Mittelmeerraums und des Nahen Ostens Erbes; iatrogene, durch Behandlung mit immunsuppressiven Medikamenten nach Organtransplantationen; Epidemie, eine AIDS-definierenden Krebs; und eine HIV-unabhängige Form häufig bei Kindern in endemischen Gebieten in Afrika endemisch. Mit dem Aufkommen der effektive Kombination Anti-retroviral Drogen-Therapien für die Behandlung von HIV ist Epidemie KS in Entwicklungsländern viel seltener diagnostiziert. Jedoch bleiben die klinisch aggressiven endemischen und epidemischen Formen unter die am häufigsten diagnostizierten Krebsarten in vielen afrikanischen Ländern2,3,4. Daher ist die Identifizierung von wirksame Pathogenese gezielt Medikamente zur Behandlung von KS Forschungsschwerpunkt.
Histologisch, zeichnen sich KS-Läsionen durch umfangreiche aber abnorme Neovaskularisation wobei Spindel Zellen EG Ursprungs diskontinuierliche vaskulären Netzwerken5bilden. Diese abnormen Gefäße ("vaskuläre Schlitze") erlauben Extravasation der Erythrozyten, die Läsionen ihre charakteristische Farbe geben. Darüber hinaus enthalten Läsionen zahlreiche Leukozyten, die chronischen Entzündung (z.B. Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen) charakterisieren. Rückbildung der KS-Läsionen nach Immunrekonstitution wurde beschrieben, was darauf hindeutet, dass KS Funktionen einer hyper-proliferative Läsion und wahre Tumor6,7,8,9.
KS Herpesvirus (KSHV), dem Erreger der KS, wurde im Jahr 199410identifiziert. Seit dann viele in Vitro Zellkultur Modelle entwickelt worden um Pathogenese Studien ermöglichen, einschließlich der Zellen aus Biopsie Tumormaterial und primäre explantiert oder Telomerase exprimierenden EG infiziert mit KSHV in-vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. keines der derzeit verfügbaren Modelle voll rekapituliert die KS Tumor Mikroumgebung, aber alle haben wertvolles Wissen zu unserem Verständnis der Pathobiologie KSHV Infektion beigetragen. Im Gegensatz zu den anderen bekannten tumorigenic menschliche Herpesvirus Epstein - Barr-Virus (EBV), KSHV nicht leicht transformiert Zellen in Kultur nach de Novo Infektion19,20,21, 22. aber diese Einschränkung überwunden durch transducing primären menschlichen EG entweder gemischt mikrovaskuläre oder lymphatischen Ursprungs mit der E6 und E7 Gene aus humanem Papillomavirus Typ 16 vor der Infektion mit KSHV23,24 . Ausdruck dieser exogene Onkogene erhöht drastisch das transformierende Potenzial der KSHV in-vitro- teilweise durch weitere Hemmung der Retinoblastoma Protein und p5323,24. Diese EG-Transduktion Methode hat mehrere Labore, wichtige Veränderungen im Host zu identifizieren erlaubt Zelle Genexpression, die durch KSHV Infektion hervorgerufen und, die Erleichterung der KS Zelle überleben und Verbreitung25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. der hierin beschriebenen Protokolle sind unkompliziert und hoch reproduzierbare und führt zu der Generation von Alter und Durchgang abgestimmt KSHV-infizierten EG und Mock-infizierten Steuerelemente, können viel länger als primäre Zellen gezüchtet werden und werden, ermöglichen Sie die Untersuchung von onkogenen Mechanismen KSHV angestellt. Obwohl das Protokoll enthält ein Verfahren zur Herstellung von Wildtyp KSHV aus der primären Erguss Lymphome Zelllinie BCBL-1, E6/E7-verewigt EG sind auch sehr anfällig für Infektionen mit rekombinanten BACmid abgeleitet KSHV-BAC1630. Protokolle für die Vorbereitung des BAC16 sind an anderer Stelle beschrieben33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Kaposi-Sarkom (KS) ist eine ungewöhnliche Tumor bestehend aus wuchernden Spindel Zellen, die durch Infektion der Endothelzellen (EG) mit KSHV initiiert und entwickelt sich in den meisten Fällen im Rahmen der Immunsuppression. Trotz jahrzehntelanger Forschung optimale Behandlung von KS bleibt schlecht definiert und klinischen Ergebnisse sind besonders ungünstig in beschränkten Ressourcen. KS-Läsionen sind getrieben von pathologischen Angiogenese, chronische Entzündungen und Onkogenese und verschiedene in-vitro- Kultur Zellmodelle wurden entwickelt, um diese Prozesse zu studieren. KS ergibt sich aus KSHV-infizierten Zellen endothelialen Ursprungs, also EC-Linie Zellen am besten geeignete in-vitro- Surrogate von der Spindel Zelle Vorläufer zur Verfügung stellen. Da EG haben eine begrenzte in-vitro- Lebensdauer, und die onkogenen Mechanismen KSHV angestellt sind weniger effizient als die der anderen tumorigenic Viren, es war jedoch schwierig zu beurteilen, die Prozesse der Transformation in der PV oder Telomerase-verewigt EC Daher wurde ein neuartiger EG basierende Kultur-Modell entwickelt, die Transformation nach Infektion mit KSHV bereitwillig unterstützt. Ektopische Expression der Gene des menschlichen Papillomavirus Typ 16 E6 und E7 erweiterte Kultur von Alter und Durchgang abgestimmt Mock und KSHV-infizierten EG ermöglicht und unterstützt die Entwicklung einer wahrhaft transformierten (d. h. tumorigenic) Phänotyp in infizierten Zellkulturen . Diese gefügig und hoch reproduzierbare Modell KS hat die Entdeckung von mehreren wesentlichen Signalwege mit hohem Potenzial für die Übersetzung in klinischen Umgebungen erleichtert.

Die Morphologie der primären EG wird klassisch als "Kopfsteinpflaster" beschrieben, und diese Morphologie wird nicht durch Ausdruck der Papillomavirus E6 und E7 Gene (Abbildung 1A) verändert. Ausdruck der E6 und E7 Gene allein nicht dazu veranlassen, einen veränderten Phänotyp; so Zellen sind anfällig für Hemmung wenden Sie sich an und werden nicht mehr geteilt beim Zusammenfluss in Kultur zu erreichen. Die Zellen werden jedoch vermehren und nachwachsen, Zusammenflu...

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K Aufrufe.  University of Minnesota Medical School. Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Serie: An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

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Forschung

Biologie

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell cytoskeletal structures. This involves the assembly-disassembly of higher-order macromolecular structures at a given time and location, a process that is particularly sensitive to perturbations caused by overexpression of proteins. Methods that can preserve protein homeostasis and maintain near-to-normal cellular morphology are highly desirable to determine the functional contribution of a protein of interest in a wide range of cellular processes. Transient depletion-rescue experiments based on RNA interference are powerful approaches to analyze protein functions and structural requirements. However, reintroduction of the target protein with minimum deviation from its physiological level is a real challenge. Here we describe a method termed adenofection that was developed to study the role of molecular chaperones and partners in the normal operation of dividing cells and the relationship with actin remodeling. HeLa cells were depleted of BAG3 with siRNA duplexes targeting the 3&#39;UTR region. GFP-tagged BAG3 proteins were reintroduced simultaneously into &#62;75% of the cells using recombinant adenoviruses coupled to transfection reagents. Adenofection enabled to express BAG3-GFP proteins at near physiological levels in HeLa cells depleted of BAG3, in the absence of a stress response. No effect was observed on the levels of endogenous Heat Shock Protein chaperones, the main stress-inducible regulators of protein homeostasis. Furthermore, by adding baculoviruses driving the expression of fluorescent markers at the time of cell transduction-transfection, we could dissect mitotic cell dynamics by time-lapse microscopic analyses with minimum perturbation of normal mitotic progression. Adenofection is applicable also to hard-to-infect mouse cells, and suitable for functional analyses of myoblast differentiation into myotubes. Thus adenofection provides a versatile method to perform structure-function analyses of proteins involved in sensitive biological processes that rely on higher-order cytoskeletal dynamics.

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

Eine effiziente In-vitro- Umsetzung-Methode durch eine Transcriptionally geregelten Schönheit Schlafsystem verpackt in eine Integration defekt Lentivirale Vektor

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Quantitative Ansätze zur Untersuchung zellulärer Strukturen und Organelle Morphologie in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Untersuchung des Zinktransportmechanismus in Säugetierzellen mit dem FluoZin-3-Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der zellulären Zinkregulation durch ZnT1-Funktionalität 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...