Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1.溶液の調製とプルガラスニードル<ol><li> 20 mMトリスpHを8.8に4ミリグラム/ mLでトリカイン（3-アミノ安息香酸エチルエステルとも呼ばれる3-アミノ安息香酸エチル）の25倍ストック溶液を作成し、そのソリューションはpHである4 mLおよび店舗7.小分けに持ち込みます-20℃。 注：麻酔トリカイン、それによって筋肉のけいれんや運動6を遮断する神経電位依存性ナトリウムチャネルに優先的に作用します。 </li><li> E3胚培地中0.17ミリグラム/ mlの最終濃度でトリカインの作業溶液を作ります。 7 注：この溶液のpHが漂うとして即時作業溶液トリカインしてください。 </li><li>電子レンジ内の溶液を加熱して50 mLチューブ中のE3胚培地中1.5％の最終濃度を低融点アガロースを溶解します。水浴またはベンチトップインキュベータのいずれかで45℃ - このソリューションは42に平衡化してみましょう。垂直のための大規模な料理を準備している場合光シートイメージング（ステップ4）、アガロースE3胚培地に1％の標準的な融解の追加の25mLのを作ります。 </li><li> OD 1.20ミリメートル、ID 0.69ミリメートル、長さ10mmの寸法のフィラメント毛細血管にホウケイ酸ガラスを使用してください。 </li><li>毛細血管は、 機器および試薬の表に記載され加熱フィラメント針プラーの種類に引っ張られた場合は、次の設定を使用します。熱600は、鋭いピンセットで120、速度50、時間225、圧力500を引いて、ブレークちょうどそれが胚を配向し、過剰のアガロースを除去するためのクリーンでシャープな針を作成するために曲がるした時点過去の針。マイクロメスはまた、過剰なアガロースを除去するために使用することができます。 </li></ol>倒立または直立顕微鏡のための胚の2の埋め込み<ol><li> E3胚の培地中の適切な段階に胚を上げます。 7 </li><li>両眼dissecの下に鋭いピンセットで必要な段階では、dechorionate胚ティン顕微鏡。 </li><li>トリカイン作業溶液中で少なくとも5分間dechorionated胚を培養します。 </li><li>溶融アガロース溶液を45℃に冷却した後、E3媒体の最小の転送に50mlチューブに直接dechorionated胚を転送するために、ガラスパスツールピペットを使用します。 </li><li>約1ミリリットルマウンティング培地と一緒に胚を取り出して、約追加します。 10ミリメートルのマイクロウェルと35ミリメートルのガラス底ペトリ皿の中央円に胚と一緒にメディアをマウントする100μlの。 </li><li>マウンティング媒体が設定されているように、（ 図1A）外側を向く尾を含むアガロースの円の端に胚を移動します。ゲルが完全に設定されるまで、所望の横方向の向きで胚を維持するために、キャピラリ針を使用してください。画像後部ボディの開発に、できるだけ横向きで胚を向けるように注意してください。したがって、慎重adjustmenによってこの位置に胚を維持キャピラリ針付きTS。 注：必要に応じて、複数の胚は、この時点で取り付け皿に添加することができます。このような場合は、最初の皿にアガロース低いが溶融転送し、アガロースドロップの中心に胚を追加します。その後、ガラスリングのエッジに胚を押し出すと、所望の位置に向けます。 6胚まで、アガロースが固化する前に、この方法を実装することができます。 </li></ol>後部の体の周りに余分なアガロースの3除去注：このセクションでは、アガロースは、後部本体を囲む領域から除去されることにより、手順を説明します。後部本体の伸長の場合には、尾部が成長アウトできることを通常は保証することが重要です。胚が完全にアガロースによって含まれていた後、アガロースを除去することにより、胚は、頭部領域と卵黄嚢の約半分で囲まれたままです。 <ol><li>アガロースドロップを設定したら、ペトリジをあふれさせますトリカイン作業溶液とのsh。 </li><li>透過光ベースと解剖双眼顕微鏡下では、強いコントラストが操作して明確に見られるように、アガロースの削減を可能にするようにミラーの位置と入射光の角度を調整します。 </li><li>カットを実行するには1（ 図1）、ただ体節5（5 番目の位置に形成心臓領域に後方の位置から、卵黄に沿ってアガロース途中でカットするキャピラリ針またはマイクロメスを使用前方の体節）。 </li><li>示すように形成心臓に隣接する最初のカット、およびガラスにアガロースを介して完全な道を開始します。 </li><li>深いアガロース内の毛細管またはマイクロメスのままにし、 図1に示すように、胚を超える長いカットを作るために始めながら、ゆっくりと上下を見ました。胚や卵黄を穿刺することなく、可能な胚に近いカットします。 </li><li>次に、カット2および3（ 図1を作ります</strong&gt;）、胚に対する位置から、ガラスに至るまですべての道を行くカットで始まる皿底。後部本体のアンフォールディングフル背側方向にするためにできるように、それは最初の5体節に対して接線方向になるように2をカットしてください。卵黄面と90°の角度で3をカットし、ハートフィールドから開始してください。 注：ガラス円のエッジまでアガロースを切断（ 図1に示すように）完全なブロック（ステップ3.6）としてアガロースを除去するのに役立ちます。しかし、これは必須ではありません。 </li><li>カット1と3の交差点に出発し、ゆっくりと後部本体を囲むアガロースの二乗を除去するために、上向きに持ち上げながらカット2の終わりに向かってゆっくりと斜めカットを行います。 注：いくつかのケースでは、これは、1つのブロックに解放され、操作が一度に完了する。他では、それはディスロッジに胚周辺のアガロースをいくつかの試みがかかる場合があります。 </li><li>鋭いピンセットで、外れBを削除胚培地からアガロースのロック。 、このプロセスを補助皿の側にアガロース片を移動し、アガロース片を持ち上げながら、支持体としてペトリ皿の壁を使用します。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> 図1：取付・セットアップのダイアグラム。 （A）図は、ペトリ皿の中心のガラスリング内に取り付けられた胚の位置を示しています。右側には、アガロースdottted赤線で示さ周囲を介して各連続したカットと胚のズームがあります。 （B）に取り付けられた胚は、両方反転して直立目的のためのアクセスのしやすさを表示する側面図に図解されています。 （C）胚は垂直光シートイメージングセットアップのために実装することができる方法を示す同様の2文字組。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">CLください</a>この図の拡大版を表示するには、こちらICK。 <ol start="9"><li>筋肉のけいれんが完全にその時点でブロックされていない場合は、4 mg / mlで、pHが7のストック溶液からトリカインの滴を追加します。 </li></ol> 4.垂直ライトシート顕微鏡のための胚の取り付け注：これはその上に概説した方法のバリエーションが垂直指向SPIMにより試料のイメージングのための複数の目標のアクセスを可能にしています。この変化の背後にある考え方は、2つの撮像目標の容易なアクセスを可能にするために、皿の底よりもわずかに高いサンプルを持ち上げることです。 <ol><li> 5mmの高さに取り付け、コートE3培地中の1％アガロースでの100mmプラスチック製ペトリ皿をサンプリングし、設定することを可能にする前に。 </li><li>皿の中央に1ミリリットルの低融点アガロースのドロップを置き、設定することができます。 </li><li>しかし項2のような低融点アガロース中に埋め込むの胚は、この時間は、50mlチューブから胚を除去しますソリューションのより小さな滴（0.5ミリリットル）でアガロースの皿の中央に1ミリリットル滴の上に、この小滴を配置します。 </li><li>小滴の中心に胚を配置し、ゲルが設定されるまで、その正しい方向を維持するために、キャピラリ針を使用してください。 </li><li>トリカインワーキング溶液で皿をフラッディングし、セクション3のとしてではなく、1％標準アガロースのクッションを切断することなく、余分なアガロースを削除します。 </li></ol>

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	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この実装技術は、胚は、顕微鏡、複数の長さスケールで後部ボディ伸びを以下のことを目的としたオーバー長期的タイムラプスイメージング実験への転送中に静止保持することができます。それは両方の直立および反転の顕微鏡セットアップのイメージングを可能にし、提案が、これはさらに垂直に向けSPIMに適合させることができる方法のために作られているという点でまた、多目的です。...

後部ボディ伸びが胚体軸の大部分を形成するように延びていることにより、胚発生に不可欠なプロセスです。これは、複数の細胞の挙動は、個々の組織のレベルでの形態形成を生成するために協調的に作用することにより、複雑な形態形成過程の一例です。これらの差動組織変形は、その後、構造全体のレベルで後部本体の伸長を生成するために一緒に働きます。これらのプロセスが制御され、現像時に調整されている方法を理解するために、我々は（分子、細胞、細胞集団と組織のレベルでIE）複数のスケールで、これらのプロセスに従うことができなければならず、全体の構造の形態形成に直接これを関連付けること。 その光学的透明性と小さなサイズは、最小侵襲性光イメージングのアプリケーションを可能にするようゼブラフィッシュの胚は、LIVによく適して近づいイメージング後部本体の伸長のために理想的です電子イメージング。 1これは、分子のレベル、2単セルで、3と間組織行動、4だけでなく、細胞集団全体の臓器のレベルで後部本体の開発に光を当てるしている最近の一連の刊行物によって証明されています。 5 このような共焦点、多光子顕微鏡法および選択的平面照明顕微鏡（SPIM）などの高度なイメージング技術は、光毒性および光退色の効果が低下した発生過程の長期イメージングを可能にしています。顕微鏡への転送時および取得時に正しい向きでサンプルを維持するために1）十分な支持の成長を可能にするために、サンプルの移動2）十分な自由：ライブのサンプルの実装のための堅牢な技術は、3つの目標を達成するために必要とされますその通常のdevelに影響を与えることなく、後部ボディ領域発、そして最後に3）多様なイメージング・セットアップにイメージングを可能にする実装方法の汎用性にある程度。 このプロトコルは、ゼブラフィッシュD.レリオの開発を撮像するための実装技術を紹介します。この技術は、細長く、正常に発育する後部ボディ領域を残して、ヘッドと卵黄嚢の領域をほぼ完全に、アガロース中に含まれるように胚をマウントすることを含みます。このように、それはまた、アガロース、標準の光画像化技術による画像化を可能にするように開発身体の他の領域の長期イメージングのための適切な方法です。代替の向きで胚をマウントすることも可能であるが、このプロトコルは、横方向の向きで胚の取り付けを示しています。さらに、直立反転および垂直光シート顕微鏡のセットアップのための方法を適応させる方法を紹介します。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass</td></tr><tr><td>Capillaries for injection needles</td><td>&amp;nbsp;Sutter&amp;nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td></td><td></td><td>230 mm long</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting point agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&amp;nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&amp;nbsp;</td><td>11252-30&amp;nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Needle puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P97</td><td>Heating-filament needle puller</td></tr><tr><td>Binocular dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

ゼブラフィッシュの胚は、アクセシビリティと光透過性の容易さのために複雑な形態形成過程を研究するための理想的な実験系を提供しています。具体的には、後部ボディ伸びは、複数の組織変形が体軸の大部分の形成を指示するために一緒に作用することにより、胚発生に不可欠なプロセスです。長期タイムラプス撮影することによって、このプロセスを観察するためには、十分な支持を顕微鏡及び取得に転送中に正しい方向で試料を維持することを可能にする実装技術を利用する必要があります。また、実装は、その正常な発達に影響を与えることなく、後部ボディ領域の伸長のための運動の十分な自由度を提供しなければなりません。最後に、多様なイメージング・セットアップにイメージングを可能にするために、実装方法の汎用性がある程度存在しなければなりません。ここでは、後部本体の開発を画像化するための実装技術を提供elongatioゼブラフィッシュD.レリオ中のn。この技術は、細長く、正常に発育する後部ボディ領域を残して、ヘッドと卵黄嚢の領域をほぼ完全にアガロース中に含まれるように胚をマウントすることを含みます。これは、直立反転および垂直光シート顕微鏡セットアップのために適合させることができる方法を紹介します。このプロトコルは、後部ボディ用イメージングのための胚をマウントするに焦点を当てているが、それは簡単にゼブラフィッシュの開発のさまざまな側面のライブイメージングのために適合させることができます。

上記で概説したプロトコルは、長期的タイムラプスイメージングのためのゼブラフィッシュ胚の取り付けのための多目的な技術を詳しく説明しています。この例は、図2Aおよびアニメーション/ビデオ図1に示されています。胚は、mRNAがphotoconvertible蛍光タンパク質kikumeGRをコードすると1細胞期で注入しました。上記のように15体節段階でそれら?...

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A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K ビュー.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

ビデオ: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

発生生物学

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

生物学

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

バーチャルリアリティインタラクションによるゼブラフィッシュ心収縮の解析

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

著者スポットライト:Zebrafishの高分解能4Dライトシートイメージングとバーチャルリアリティによる心機能のシングルセル解析

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

生物工学

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

要約

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リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け