Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. 솔루션의 준비 및 뽑아 유리 바늘 <ol><li> 20 mM 트리스 pH가 8.8에 4 ㎎ / ㎖에서 Tricaine (3- 아미노 벤조산 에틸 에스테르라고도 에틸 3- 아미노 벤조 에이트)의 25 배 스톡 용액을 제조하고 그 용액의 pH에서 4 밀리리터 매장 제 나누어에서 가져 -20 ° C. 참고 : 마취 Tricaine함으로써 근육의 경련 및 운동 (6)을 차단하는 신경 전압 문이 나트륨 채널을 우선적으로 작용한다. </li><li> E3 배아 매체에 0.17 ㎎ / ㎖의 최종 농도 Tricaine의 작동 용액을 만든다. (7) 참고 :이 용액의 pH가 품으로 즉흥적 솔루션을 작업 Tricaine을 확인합니다. </li><li> 전자의 용액을 가열하여 50 ㎖ 튜브에서 E3 배아 배지에서 1.5 %의 최종 농도로 저 융점 아가로 오스를 녹인다. 물 목욕이나 벤치 탑 인큐베이터 중 하나에서 45 ° C -이 솔루션은 42 평형을 보자. 수직에 대한 많은 요리를 준비하는 경우빛 장 영상 (4 단계), 아가로 오스 E3 배아 매체에 1 % 표준 용융의 추가 25 mL로. </li><li> OD 1.20 mm, ID 0.69 mm, 길이 10mm의 크기와 필라멘트 모세 혈관과 붕규산 유리를 사용합니다. </li><li> 날카로운 집게 한 쌍으로, 속도 (50), 시간 (225), 압력 (500) (120)를 당겨, 열 (600), 브레이크 : 모세 혈관은 장비 및 시약, 다음 설정을 사용의 표에 설명 된 가열 필라멘트 바늘 풀러의 종류에 가져온 경우 단지 지점 과거 바늘되는이 배아를 배향하고 초과 아가로 오스를 제거하는 깨끗하고 날카로운 바늘을 만들 구부러. 마이크로 메스 또한 과량 아가 로스를 제거 할 수있다. </li></ol> 거꾸로 또는 수직 현미경을위한 배아 2. 퍼가기 <ol><li> E3 배아 매체에 적절한 단계로 배아를 올립니다. (7) </li><li> 양안 dissec 아래 날카로운 집게 한 쌍의 필수 단계에서, dechorionate 배아팅 현미경. </li><li> Tricaine 작업 용액에 적어도 5 분 동안 dechorionated 배아를 품어. </li><li> 용융 아가 용액을 45 ° C로 냉각되면, E3 매체의 최소한의 전송로 50 ㎖ 튜브에 직접 dechorionated 배아를 전송하는 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다. </li><li> 매체를 장착 약 1 ml의와 함께 배아를 제거하고 약 추가 할 수 있습니다. 10 밀리미터 마이크로 웰과 35mm 유리 바닥 페트리 접시의 중앙 원에 배아와 함께 매체를 장착 100 ㎕. </li><li> 설치 매체가 설정 될 때, 바깥쪽으로 (그림 1A)를 직면 꼬리 아가로 오스의 원의 가장자리로 배아를 이동합니다. 겔이 완전히 설정 될 때까지 원하는 횡 방향 배아를 유지하는 모세관 바늘을 사용한다. 이미지 후방 신체 발달, 가능한 한 측면 오리엔테이션에서 배아의 방향을주의하십시오. 따라서,주의 adjustmen하여이 위치에 배아를 유지모세관 바늘 TS. 주 : 필요한 경우, 여러 개의 배아이 시점에서 장착 접시에 첨가 될 수있다. 이 경우, 제 접시로 오스가 낮은 용융 전송하고 아가 드롭의 중심 배아를 추가한다. 그리고, 유리 링의 에지에 배아를 밀어 원하는 위치로 배향. 여섯 배아까지 아가로 오스가 응고되기 전에이 방법을 장착 할 수 있습니다. </li></ol> 후방 몸 주위 초과 아가로 오스 3. 제거 참고 :이 섹션은 아가로 오스는 후방 본체 주변 지역에서 제거하는 절차를 설명합니다. 후방 바디 연신의 경우에는 꼬리 성장 아웃 할 수있는 일반적으로 보장하는 것이 중요하다. 배아 완전히 아가가 포함 된 후, 아가 로스를 제거하여, 배아는 헤드 영역과 난황의 약 절반으로 둘러싸인 남겨진다. <ol><li> 아가 강하가 설정되면, 페트리 디 홍수Tricaine 작업 솔루션을 쉬. </li><li> 전송 된 광 염기 쌍안 해부 현미경 하에서 강한 콘트라스트가 동작을 명확하게 볼 수 아가 로스의 절단이 가능하도록 상기 미러 위치 및 입사광의 각도를 조정한다. </li><li> 절단 실행 1 (도 1) 바로 체절 (5) (5 차의 위치에 형성 심장 필드 후부 위치에서 난황 따라 아가 중도 절단 모세관 바늘 또는 마이크로 메스를 사용 전방 체절). </li><li> 그림과 같이 형성 마음에 인접한 초기 절단, 유리에 아가로 오스를 통해 전체 방법을 시작합니다. </li><li> 최대보고 그림 1과 같이 배 이상 긴 절단을 시작하면서 아래로 천천히 깊은 아가로 오스 내에서 모세관 또는 마이크로 메스를 유지하고. 배아 또는 노른자를 천공하지 않고 가능한 한 배아에 가깝게 잘라. </li><li> 다음에, 절단하게 2, 3 (도 1 </strong&gt;), 배아에 대한 위치에서 유리에 이르기까지 모든 방법을가는 컷으로 시작은 접시를 바닥. 이 제 5 somites 접선되도록 후방 본체의 전개 전체 dorsalward 허용 2 절단 만든다. 노른자면과 90 ° 각도로 삼을 잘라 HEARTFIELD에서 시작합니다. 주 : 완전한 블록 (단계 3.6)로 오스를 제거하는 에이즈 (도 1에 도시 된 바와 같이) 유리 원형의 가장자리까지 아가로 오스를 절단. 그러나, 이것은 필요하지 않다. </li><li> 인하 1과 3의 교차점에서 시작, 천천히 후방 몸을 둘러싼 아가로 오스의 제곱을 제거하기 위해 위쪽으로 들어 올리는 동안 컷 2의 끝으로 천천히 대각선 컷을합니다. 주 : 일부 경우에, 이것은 하나의 블록에 출시되고 동작이 한 번에 완료된다. 다른 사람에서는 DIS-별장에 배아를 둘러싼 모든 아가로 오스를 여러 번 시도해야 할 수 있습니다. </li><li> 날카로운 집게 한 쌍으로, 빠질 B를 제거배아 매체로부터 아가로 오스의 잠금. 이 과정에 도움 접시 측으로 아가 로스 편을 이동시키고, 아가 로스 편을 들어 올리는 동안 지지체로서 배양 접시의 벽을 사용한다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> 그림 1 : 설치 셋업의 다이어그램. (A) 다이어그램은 페트리 접시의 중앙 유리 링 내에 장착 된 배아의 위치를 나타낸다. 오른쪽에있는이 아가로 오스 dottted 빨간 선으로 표시 둘러싸을 통해 각각의 연속 컷 배아의 확대이다. (B)이 탑재 된 배아는 모두 반전 직립 목표에 대한 접근 용이성을 표시하는 측면도에 도시된다. (C) 배아가 수직 광 시트 영상 셋업 마운트 될 수있는 방법을 보여주는 유사한 digram. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">카스티하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK. <ol start="9"><li> 근육 경련이 완전히 그 시점에서 차단되지 않은 경우, 4 ㎎ / ㎖, pH가 7의 원액에서 Tricaine 방울을 추가합니다. </li></ol> 4. 수직 빛 시트 현미경을위한 배아의 설치 참고 :이 그 위에서 설명한 방법에 변화가 수직 지향 SPIM에 의해 시료의 이미징을위한 여러 목적의 접근을 허용합니다. 이 변화의 뒤에 아이디어는이 영상 목표를 쉽게 액세스 할 수 있도록, 접시의 바닥보다 약간 높은 샘플을 들어 올릴 것입니다. <ol><li> 장착 샘플 전에 코트 5mm의 높이 E3 배지에서 1 % 아가로 오스와 100mm 플라스틱 페트리 접시에 세트 할 수있다. </li><li> 접시의 중앙에 1 ml의 저 융점 아가 방울을 배치하고 설정할 수. </li><li> 그러나 2 항에서와 같은 저 융점 아가로 오스에 포함 된 배아는, 이번에는 50 ㎖ 튜브에서 배아를 제거의 아가로 오스 용액 (0.5 ㎖)의 작은 방울과 접시의 중앙에 떨어 ㎖로 1 위에이 작은 방울을 배치합니다. </li><li> 작은 방울의 중심 배아를 배치하고 겔이 설정 될 때까지의 올바른 방향을 유지하기 위해 모세관 바늘을 사용한다. </li><li> Tricaine 작업 용액으로 요리 홍수와 섹션 3에서와 같이하지만, 1 % 표준 아가로 오스의 쿠션을 통해 절단하지 않고 초과 아가로 오스를 제거합니다. </li></ol>

<ol><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li>
<li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li>
<li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li>
<li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).</li>
<li>Schröter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li>
<li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

이 실장 기술은 배아가 현미경 및 여러 길이 스케일에서 후방 신체 신장을 다음 목표로 이상 장기 시간 경과 이미징 실험에 전송하는 동안 계속 유지 될 수 있습니다. 이 모두 수직 및 반전 현미경 셋업에서 촬상이 가능하고,이 제안은 상기 수직 배향 SPIM에 적응 될 수있는 방법에 대해 이루어지는 것을 또한, 다목적. 이 프로토콜의 중요한 단계는이 구조의 정상적인 개발을 ?...

후방 바디 신장 배아 몸 축 큰 부분을 형성하기 위해 연장되는 배아 발달에 필수적인 과정이다. 이는 다중 셀 동작 개별 조직의 형태 형성 수준을 생성하는 역할을 배위하는 복잡한 형태 형성 공정의 일례이다. 이러한 차동 조직 변형은 전체 구조 수준에서 후방 본체의 신장을 생성하도록 함께 작용한다. 이러한 프로세스 제어 및 개발 과정에서 조정하는 방법을 이해하려면, 우리는 (분자, 세포, 세포 집단과 조직의 수준에서 즉) 여러 규모에서 이러한 프로세스를 수행 할 수 있어야하고, 전체 구조의 형태 형성에 직접 연관에 . 자신의 광학 투명성과 작은 크기는 최소 침습 광 이미징의 응용 프로그램에 대해 허용하는 제브라 피쉬 배아는 거실에 적합 접근 이미징 후방 신체 신장에 이상적입니다전자 영상. 한 이것은 분자 레벨에서 후방 본체 개발을 밝혀왔다 최근 공보의 시리즈에 의해 입증 된 2 단 전지 4뿐만 아니라 세포 집단 및 전체 기관의 수준에서 3 간 조직 행동. (5) 이러한 공 초점, 다 광자 현미경 선택적 평면 조명 현미경 (SPIM)와 같은 고급 이미징 기술은 광 독성 광 표백 효과의 감소와 개발 프로세스의 장기 영상을 가능하게한다. 실제 샘플의 장착을위한 견고한 방법이 세 가지 목표를 달성하기 위해 필요하다 : 1) 충분한지지가 현미경 및 수집 동안 전송하는 동안 올바른 방향으로 샘플을 유지하기 위해, 2) 샘플의 이동 충분한 자유의 생장을 허용하는 정상 (STABLE)에 영향을주지 않고 후방 바디 영역opment, 그리고 마지막으로 3) 장착 방법의 다양성에 어느 정도의 다양한 영상 셋업에 영상을 허용합니다. 이 프로토콜은 제브라 D. 레 리오의 개발을 이미징 실장 기술을 소개한다. 이 기술은 일반적으로 신장 및 개발 후방 바디 영역을 남기면서 머리와 난황 낭 영역이 거의 아가 로스에 포함되도록 배아 장착 포함한다. 이와 같이,도 아가 표준 광 이미징 기술에 의해 촬상 가능으로 현상 신체의 다른 영역의 장기 촬상에 적합한 방법이다. 이 바꾸는 방향에서 배아를 탑재하는 것도 가능하지만,이 프로토콜은, 횡 방향으로 배아의 장착을 보여줍니다. 그것은 또한, 수직 반전 및 수직 빛 시트 현미경 설정하는 방법을 적용하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass</td></tr><tr><td>Capillaries for injection needles</td><td>&amp;nbsp;Sutter&amp;nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td></td><td></td><td>230 mm long</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting point agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&amp;nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&amp;nbsp;</td><td>11252-30&amp;nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Needle puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P97</td><td>Heating-filament needle puller</td></tr><tr><td>Binocular dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

제브라 피쉬 배아 인해 접근성과 광 투과성의 용이성 복잡한 형태 형성 과정을 연구 할 수있는 이상적인 실험 시스템을 제공합니다. 특히, 후방 본체 신도 여러 조직 변형 몸 축의 큰 부분의 형성을 유도하기 위해 함께 작용하는 배아 발달에 필수적인 과정이다. 장기간 시간 경과 화상이 과정을 관찰하기 위해 충분한 지원 현미경 및 취득을 전송하는 동안 올바른 방향으로 샘플을 유지할 수있게 장착 기술을 활용하는 것이 필요하다. 또한, 장착은 정상적인 발달에 영향을주지 않고 후방 바디 영역의 생장에 대한 충분한 이동 자유를 제공한다. 마지막으로, 다양한 영상 셋업에 영상을 수 있도록 장착 방법의 다양성에 어느 정도가 있어야합니다. 여기서, 우리는 후방 바디 elongatio 개발을 이미징 실장 기술을 제시n은 제브라 피쉬 D. 레 리오한다. 이 기술은 일반적으로 신장 및 개발 후방 바디 영역을 남기면서, 헤드 및 난황 낭 영역이 거의 아가에 포함되도록 배아 장착 포함한다. 우리는이 똑바로 반전 및 수직 빛 시트 현미경 셋업에 대해 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 후방 몸 이미징을위한 배아를 장착에 초점을 맞추고 있지만, 쉽게 제브라 피쉬 개발의 여러 측면의 라이브 영상에 대해 적용 할 수 있습니다.

위에서 설명한 프로토콜은 장기간의 시간 경과 이미징을위한 제브라 피쉬 배아의 장착을위한 다양한 방법을 자세히 설명합니다. 이것의 예는도 2a 및 / 비디오 애니메이션도 1에 도시된다. 배아는 mRNA의이 photoconvertible 형광 단백질 kikumeGR을 인코딩으로 1 세포 단계에서 주입 하였다. 10 배 목표와 거꾸로 공 초점 현미경에 상술 한 바와 12 시간 동안 ...

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development at JoVE.com

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K 조회수.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

비디오: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

연구

발생학

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

생물학

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

가상 현실 상호 작용을 통한 제브라피시 심장 수축 분석

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

저자 스포트라이트: 심장 기능의 단일 세포 분석을 위한 제브라피시의 고해상도 4D 광시트 이미징 및 가상 현실

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

생체공학

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

요약

더 많은 비디오 탐색

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착