我々は議論をタイムラプスイメージングのための取付けに関するアドバイスはキャシージュバン、地元の組織の損傷を作成するには、二光子顕微鏡を用いて上での最初のアドバイスのためにマーク寺崎に感謝、そしてSagastiとPortera - Cailliauラボ。初期の実験は、ウッズホール、マサチューセッツ州の海洋生物学研究所のグラス財団のフェローとして、ASによって行われた。 Sagastiラボの仕事はホワイト財団、Klingenstein財団、生物科学におけるバローズウェルカム基金のキャリア賞からの補助金によって支えられている。

パート1：長期的イメージングのための取付ゼブラフィッシュ胚<ol><li>埋め込みのために1％低融点アガロース溶液を調製。小さなチューブと摂氏42度で加熱ブロックのストアに分注し、マイクロ波で加熱することにより、DI水でアガロースを溶解する。 </li><li>イメージングのための胚を選択して、静かにピンセットで離れて絨毛膜を引っ張って、そのchorionsを削除します。胚は、色素の形成を抑制するために22から24時間後に受精（HPF）で5％PTUリンゲル溶液中に配置することができます。これは、画像の明瞭度を改善し、感覚軸索の二光子axotomiesを行うために不可欠です。天然色素をフォームに許可されている場合、自家蛍光は、2光子顕微鏡の軸索をあいまいにしています。ゼブラフィッシュのためのソリューションは116 mMのNaCl、2.9 mMの塩化カリウム、1.8 mMのCaCl 2を 、そして5mMのHEPES、pH 7.2のが含まれているリンガー。 </li><li> PTUリンガーに〜0.02％tricaineを追加することにより胚を麻酔。動物は先に進む前に触れないように応答していないことを確認してください。 </li><li>ガラスまたはテフロンリングの片側に真空グリースを塗布し、ガラス製カバースリップの上にそれを固定することにより、長期的なイメージング室を準備します。 </li><li>多くPTUリンガーのを転送しないように注意しながら、ガラスピペットで42度アガロース溶液に1つの胚を転送して、準備カバースリップの上にアガロースの1滴で胚を移す。 </li><li>アガロースが固まるように必要に応じて胚を置きます。作業が終了したら、イメージングチャンバー、カバースリップが上面になるように反転されることに留意してください。 </li><li>あなたが電動ステージを持っているし、一度にできるイメージの複数の場所の場合、各胚のためのステップ1.4から1.6を繰り返します。 </li><li> 0.02パーセントtricaine PTUリンガーとリングをご記入し、アガロースが完全に固化することができます。 </li><li>スライドガラスにリング（s）をカバーして、リング（S）の反対側に真空グリースを塗布してください。以上の密閉室（s）を反転させます。これらのチャンバは、正立または倒立顕微鏡でのイメージングに使用することができます。 </li></ol>パート2：カメレオンのTi -サファイアレーザーを使用してカスタム構築された二光子顕微鏡を用いて二光子の軸索切断<ol><li>イメージングのための準備。顕微鏡下でスライドホルダーにマウントされている胚（s）を置きます。 40X（0.8 NA）水の目標と、ワン胚に焦点を当てる。レーザーをオンにします。我々は、再現性の視覚化と次のパラメータを使用して神経細胞の発現GFPを損傷することができた。非損傷力で軸索を可視化するために、910ナノメートルの波長（nm）と30の消費電力（mWのが記載されているサンプルでの電力量です）ミリワットにレーザーを設定します。イメージングソフトウェアを開きます。我々は、カレルヴォの研究室2、3で開発さscanimageでもソフトウェアを使用してください。 </li><li>二光子レーザーで胚をスキャンにフォーカスを押して、あなたがaxotomize、そしてこの軸索の画像をキャプチャする軸索を探します。最初と最後のZ位置に印を付けて、画像を取得し、Zスタックの最大投影を行う。 </li><li>あなたがaxotomizeとスキャンを停止する軸索の枝上で70Xのズーム。 180 mWの有害な力にサンプルでmWを増やし、レーザーの単一のスキャンを実行します。我々は1にZスライスの数を設定して、&quot;グラブ&quot;を押すことによりこれを行います。これは、軸索を切断するには十分なはずです。あなたの顕微鏡や実験的な目標のためにこの手順を最適化するためのメソッドの説明を参照してください。 </li><li>ズームアウトするには、30mWのために電力を低減し、画像を取る。 </li></ol>パート3：ツァイス上の2つの光子軸索切断510共焦点/二光子顕微鏡<ol><li>場所は、ステージに胚をマウントし、25X水の目的またはその他の適切な目標を使用してフォーカスにそれをもたらす。 </li><li>それは一方から他方に切り替えることが可能になるように、マルチトラックの設定では2光子（910 nm）とアルゴン（488 nm）のレーザーをオンにします。両方のレーザは、GFPを検出するために使用されていますが、二光子放出は、赤と可視化、そして緑とアルゴンレーザーの放射は、2つを区別する。 </li><li>けがに軸索を特定するためにアルゴンレーザーを使用してください。 Zの設定のもとで最初と最後の光のセクションをマーク。共焦点画像を取得し、Zスタックの最大投影を作成します。 </li><li>負傷する軸索の地域を選択し、フォーカスにこの領域をもたらす。アルゴンレーザーの電源をオフにし、二光子レーザーをオンにします。軸索にフォーカスが残っていることを確認するために〜9％の透過のレーザー強度で二光子で試料をスキャンしてください。 </li><li>クロップツールが利用可能となるように&quot;停止&quot;ボタンをクリックしてください。関心の領域を拡大するために作物を使用してください。通常、我々は、〜70X（ズームは&quot;モード&quot;タブの下にチェックすることができます）にズーム。 &quot;チャンネル&quot;タブの下に15〜20％の伝送に〜9％の透過率からの二光子の強度を変更する。 </li><li>軸索を切断するには、過剰なダメージを避けるために、停止ボタンを押して約1秒とするための&quot;高速XY&quot;ボタンをアクティブに。手順が動作すれば軸索は、散乱ゴミとして見られるべきである。 </li><li>その軸索を確実に488 nmのアルゴンレーザーに切り替える破損していた、別の共焦点画像を利用し、最大投影を作成します。 </li></ol>パート4：ツァイスLSM 510上に共焦点タイムラプスイメージング<ol><li>イメージングのための準備。あなたが加熱ステージを使用している場合は、あなたの早送り動画を設定する前に少なくとも30分にそれを投入してください。顕微鏡下でスライドホルダーにマウントされている胚（s）を置きます。必要な空気の客観的なワン胚に焦点を当てる。我々は20倍、0.5 NAの目的を使用してください。オープンツァイスLSM 510イメージングソフトウェア。適切なレーザーをオンにして、目的の構成を設定します。我々は今ツァイスLSMマルチタイムソフトウェアとの長期的なイメージングのための詳細なプロトコールについて説明します。これらのメソッドは、イメージングソフトウェアを使用して独自の顕微鏡での使用に適合させることができる。 </li><li>マルチタイムウィンドウ内の最初の胚の位置および設定を定義します。スキャン、ステージ、およびマルチタイムウィンドウを開きます。高速スキャンウィンドウにスキャンをアクティブにします。希望のXY位置にステージを移動します。スキャンウィンドウの最初と最後のZ位置をマークします。また、スキャンのウィンドウで、ミッドし、[停止]を押します。終了する中間のZスライスのスキャンを待って、その後段階のウィンドウでマークの位置を押してください。 、ある胚のみイメージングいる場合は、マルチタイムウィンドウで&quot;単一の場所&quot;タブをクリックします。 &quot;置換XYZ&quot;をクリックし、&quot;設定を保存&quot;。以前の構成を上書きするように要求するときに同意する。 4.4に進みます。あなたが機械化されたステージを持っていれば、画像の複数の胚への複数の場所を設定することができます。この場合、あなたは最初の場所のためにXYZと設定を定義する前に、&quot;複数の場所&quot;タブを選択してください。また、単に&quot;複数の場所&quot;タブの下のプルダウンメニューが位置1にあることを確認してください、そしてあなたが上で設定を保存]をクリックする前に構成セクションのプルダウンメニューは、locの1マルチと述べている。 </li><li>マルチタイムウィンドウ内に残っている胚の位置および設定を定義します。あなたの次の胚を見つけ、その後、高速スキャンを押して、目的のXY位置にステージを移動し、スキャンのウィンドウで、最初と最後のZ位置をマークします。また、スキャンのウィンドウで、ミッドし、[停止]を押します。終了する中間のZスライスのスキャンを待って、その後段階のウィンドウでマークの位置を押してください。 &quot;XYZの置換&quot;をクリックしてください。 &quot;設定の保存&quot;をクリックして、構成セクションのプルダウンメニューは複数のLoc 2と述べているだけで&quot;複数の場所&quot;タブの下のプルダウンメニューが位置2にあることを確認してください、と。以前の構成を上書きするように要求するときに同意する。残りの胚に対して、このプロセスを繰り返します。 </li><li>マルチのLocウィンドウで画像取得のためのパラメータを設定します。 &quot;ブロックのリスト&quot;セクションにあるGR - GLのオプションを選択し、[グループの繰り返しの希望数を入力してください。これは、共焦点は、それぞれの場所で画像を取得する回数です。 Parametersセクションで目的の待機間隔を入力します。これは、1つの画像の繰り返しの開始から次の繰り返しの開始までの時間の量です。構成セクションの&quot;ZStackXY&quot;を選択します。あなたに一番下のセクションのベースファイル名を入力してください。 &quot;選択画像DB&quot;をクリックして、mdbファイルを選択してください。 &quot;オプション&quot;ボタンをクリックします。一時ファイルを保存するMDBのフォルダを選択します。 &quot;最終的な画像を保存&quot;、および&quot;Zスタックの中央&quot;、&quot;最終的なイメージを開いたままに&quot;確認してください。間隔を待つ]を選択します。オプションウィンドウを閉じるには、[OK]をクリックします。 &quot;開始時刻&quot;をクリックしてください。イメージングの期間中、マルチタイムウィンドウは開いたままにしておきます。 </li><li>あなたのデータを分析する。タイムラプスイメージングが終了したときに、マルチタイムソフトウェアは、場所ごとにサマリファイルに一時ファイルをすべてコンパイルします。あなたはそれが完了する前にムービーを停止したい場合は、要約ファイルが作成されるように、代わりに&quot;ストップ&quot;の&quot;Finish&quot;を押してください。一時ファイルや要約ファイルが自動的に指定されたMDBのフォルダに保存されている必要があります。 LSMソフトウェアのメニューから、&quot;投影&quot;し、&quot;3Dビュー&quot;をクリックしてください。プルダウンメニューで選択してサマリファイルを使用して、&quot;適用&quot;をクリックしてください。これは、それぞれの共焦点画像のZスタックの最大の予測を生成します。 LSMソフトウェアのメニューで、&quot;ファイル&quot;をクリックし、&quot;エクスポート&quot;。 tifファイルのシリーズとして最大の突起を保存します。その後、ImageJでまたはQuickTime Proを使ってtifファイルは一連のムービーを作成することができる。 LSMの画像の軸索は軸索の形態に関する詳細な定量的な情報を生成するために画像解析ソフト（MicroBrightfieldからなどNeuroLucida）を用いて3次元的に追跡することができます。 </li></ol>パート5：代表的な結果成功した実験は、細胞のダイナミックの正確な表現になります怪我からの軸索のsは回復。あなたの胚は、目に見える変性と強いビートで、イメージを作成した後、健康になります。軸索切断は軸索の定義枝を切断する、正確なダメージになるはずです。周囲の軸索と最小限の細胞死への傷害がないはずです。我々は直接実験の約50％の軸索切断のサイト上の単一表皮細胞の死を参照してくださいと信じています。あなたがより多くのダメージを観察する場合の議論で説明したように、あなたの二光子プロトコルを最適化する必要があります。

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	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

我々は正確に末梢感覚軸索をaxotomizeすると、直接生活ゼブラフィッシュの胚で再生を観察するために説明する方法を使用している。ゼブラフィッシュにおける長期タイムラプス共焦点イメージングは、 生体内で多くの発達過程を観察するために使用することができます。説明する2つの光子軸索切断の手順は、多くの異なる実験の目的のために変更することができます。我々は、細胞?...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ゼブラフィッシュは、長く生きて透明な胚のタイムラプスイメージングが開発中の細胞および分子メカニズムを研究するために利用されている。ここでは、長期的なイメージングのためのゼブラフィッシュ胚をマウントする方法を説明し、共焦点顕微鏡を用いたタイムラプス画像のキャプチャを自動化する方法を示します。我々はまた、二光子顕微鏡に搭載されたフェムト秒レーザーの集光力を用いてゼブラフィッシュの末梢感覚軸索の個々の枝に制御された、正確なダメージを作成する方法を説明します。成功した二光子軸索切断のためのパラメータは、それぞれの顕微鏡用に最適化されている必要があります。我々は二つの例を提供するためにカスタムされた2光子顕微鏡とツァイス510共焦点/二光子の両方で二光子軸索切断のデモンストレーションを行います。 ゼブラフィッシュの三叉神経感覚ニューロンは、感覚神経特異的プロモーター1によって駆動トランスジェニックラインを発現GFPで可視化することができる。我々は直接ゼブラフィッシュ胚の生体内での感覚軸索再生を観察するためにこのゼブラフィッシュの三叉神経モデルを適応している。それが固化すると胚はtricaineで麻酔し、アガロースのドロップ内に配置。固定された胚は、フェニルチオ尿素（PTU）リンガーズで満たされたイメージングチャンバー内に封入されています。我々は、胚が連続して12から48時間のためにこれらのチャンバーでイメージングできることを見出した。単一の共焦点イメージは、軸索切断の目的のサイトを決定するためにキャプチャされます。関心領域は画像処理による2光子顕微鏡の低、非損傷電力下感覚軸索に位置しています。軸索切断の目的のサイト上で拡大した後、電力が増加し、その定義された領域の単一のスキャンでは、軸索を切断するのに十分です。複数の場所タイムラプスイメージングは​​、直接、負傷から軸索の回復を観察するために共焦点顕微鏡に設定されています。

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K ビュー.  University of California, Los Angeles. ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。

ビデオ: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; Cエレガンス</em&gt;胚

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...