著者たちは、毎日超音波卵巣スキャンとhCG注射を行うために、レーザースキャニング共焦点顕微鏡（LSCM） 、フィリップ・バリエールとティエリー・ブラードのサポートについてFabrice Vincentに感謝したい。この作品は、「Regione Sardegna and Regione Lombardia」プロジェクト「Ex Ovo Omnia」（無償で26096200からAMLへ）によって部分的に支持されました。 「L&#39;Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012」フェローシップ（2012年からFFへの契約）、FP7-PEOPLE-2011- CIG、Research Executive Agency（REA）「Pro-Ovum」（付与番号303640からVL）欧州ソーシャルファンド、人的資源開発セクター別運営プログラム2007〜2013（契約番号POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371〜IM）と共同で資金を調達した農林水産省獣医学部によって実施された。 in vivoでの卵母細胞の回収は、Françaisdu Cheval et de l&#39;Equitation研究所によって資金提供された。

すべての手順は、動物保護および使用委員会CEEA Val de Loire Number 19によって承認され、実験動物のケアおよび使用のための基本原則に従って実施された。 1.卵母細胞の回収およびインビトロ成熟<ol><li> オーバムピックアップ <ol><li>大人の牝馬のコホートにおける卵胞卵胞の直径を超音波で毎日評価する。 33 mm以上の卵胞が出現したら、頸静脈上部に1,500 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を注射する（iv）。 <ol><li>注射を行う前に、アルコールで綿棒を拭き取り、頸静蓋を見つけ、注射部位の下に親指を2〜3cm置いて、静脈を上昇させる。針を首にほぼ平行に差し込み、針が静脈にあることを確認する（血液が注射器に入る）。この時点で、注入します。 hCGは、支配的な卵胞の卵母細胞の成熟。 </li></ol></li><li> hCG注射の35時間後、デトミジン（15μg/ kg、静脈注射）、ブトルファノール酒石酸塩（10μg/ kg、静脈注射）およびブチルスコポラミンブロムア（0.2-0.3mg / kg、15mL / mare、静脈注射）で牝馬を鎮静させる。 </li><li>針を超音波プローブに接続します。超音波プローブを膣内に挿入し、超音波プローブに直面するように卵巣を直腸的に保持する。あるオペレーターに針を操作させ、他のオペレーターに、卵胞を超音波プローブに向けて卵巣を所定の位置に保持させるように指示する。支配的な卵胞と卵巣から開始します。 </li><li>膣壁および支配的な卵胞の壁を針で穿刺する（OPU用の超音波プローブには、吸引システムに接続された針用のチャネルが装備されている）。エコーグラフ画像ではその瞬間が表示されます。 </li><li>吸入システムに接続された50mLコニカルチューブで濾胞液を吸引する。円錐の内容物を注ぐ大型ペトリ皿に入れ、実体顕微鏡を用いて卵丘 - 卵母細胞複合体（COC）を検索する。 </li><li> COCは常に卵胞液で回収されるわけではないので、5IU / mLのヘパリナットを含有するダルベッコ改変リン酸緩衝食塩水（DPBS）37℃で卵胞を洗い流す。ステップ1.1.5の卵胞液について先に記載したように、DPBSのCOC存在を調べる。 COCが回収されるまで数回洗い流します。 </li><li>優性濾胞からのCOCが回収されると、ステップ1.1.3-1.1.4の優性濾胞について記載したように、≧5mmおよび≦25mmの濾胞を穿刺して洗い流す。 5以上≧25の小胞は黄体形成ホルモン/絨毛性ゴナドトロピン受容体（LHCGR）を発現しないため、卵母細胞はhCGに応答して成熟せず、GV期（未成熟）で収集される。卵丘細胞のいくつかの完全な層と褐色の細かく顆粒化した卵質を有するCOCのみを保持する。他の人は捨てる。 </li><li> OPUの終わりに、感染を防ぐために、雌雄にベンジル - ペニシリン15,000IU /動物を投与する。 </li><li>少なくとも2時間静かできれいな安定した場所に馬を飼おう。他の動物の会社に牝馬を戻す前に、耳の位置、刺激に対する反応（ 例えば騒音）、歩き方などを意識して兆候を確認します。 </li></ol></li><li> インビトロ成熟 <ol><li>ヘパリン1,790IU / L、0.4％ウシ血清アルブミン（BSA）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを37℃に添加した温かいHEPES緩衝TCM199（20mM Hepes）。この媒体を事前に準備する。フィルター滅菌し、4℃で6ヶ月間保管してください。 </li><li> 50ng / mL表皮成長因子（EGF）および20％子ウシ血清7を補充してIVM培地を調製する（NaHCO 3緩衝化TCM199（25mM NaHCO 3 ））。新しいボトルを開けてから3週間以内にNaHCO 3を補充したTCM199を使用してください。 EGFを予め100倍のストックとして調製し、-20℃で凍結させる。6ヶ月以内に使用してください。 4ウェルディッシュのウェルに500μLを分注し、5％CO 2を含む加湿空気中、38.5℃で少なくとも2時間インキュベートする。 </li><li> ≧5および≦25 mmの卵胞からCOCを回収した後、2 mLのHEPES-TCM199を充填したペトリ皿（直径3.5 cm）に入れます。細胞破片を洗い流すためにCOCをディッシュの異なる領域に移動します。 </li><li> COCをIVM培地に移し、38.5℃で5％CO 2を含む加湿空気中で28時間インキュベートする。 </li></ol></li></ol> 2.免疫蛍光法と画像解析<ol><li> 染色体数 <ol><li>優性卵胞またはIVMの終わりに収集した後、38.5℃で5％CO 2を含む加湿空気中で100μMモナステロールと1時間COCをインキュベートする。モナストロールを100倍のストックとして事前に調製し、-20℃で最大1年間保管してください。 </li><li>卵丘細胞を除去するそれらを0.5％ヒアルロニダーゼで処理することによって、または穏やかにピペッティングにより; 0.2％プロナーゼでそれを処理することにより透明帯を除去する。ヒアルロニダーゼとプロナーゼを予め10倍のストックとして調製し、-20℃で1年間保存してください。 </li><li> 38.5℃で15分間DPBS中の4％パラホルムアルデヒド中で卵母細胞を固定し、次いで4℃でさらに45分間固定する。 注意！パラホルムアルデヒドを取り扱うときは、個人用保護具を着用し、有害廃棄物のガイドラインに従って汚染された物質を廃棄してください。 </li><li> 0.1％ポリビニルアルコール（PVA）を補充した500μLのDPBSで満たした3つのウェルに順次移すことによって卵母細胞を洗浄する。 0.3％Triton X-100中で室温（RT）で10分間浸透させる。 </li><li> RTで少なくとも30分間、1％ウシ血清アルブミン（DPBS-1％BSA）および10％正常ロバ血清を添加したDPBS中での非特異的結合をブロックする。試料は、4℃で3〜4日間ブロッキング溶液中で保存することができます。 </li><li>一次染色のために、1％BSA（希釈1:50）を添加したDPBS中のウサギ抗Aurora B phospho-Thr232中の卵母細胞を4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ステップ2.1.4で説明したように卵母細胞を洗浄する。灰色のRTで1時間、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC） - 抱合ロバ抗ウサギIgG（DPBS-1％BSA中1：100）の溶液中で卵母細胞をインキュベートする。 </li><li>ステップ2.1.4に記載されているように卵母細胞を洗浄し、ガラススライド上に20μMのYOPRO1を補充した1滴の非硬化性の退色防止培地に3-4個の卵母細胞を置く。すべての卵母細胞がマウントされるまで手順を繰り返します（1スライドあたり3〜4個の卵母細胞）。 </li><li>卵母細胞をマウント培地中で約10分間沈降させ、次いでそれらをカバーグラスで覆う。卵母細胞を粉砕することを避けるために、ガラススライド上にカバーガラスを敷く前に、両面テープの2つのストリップを塗布する。 注記：この予防措置は、すべてのサンプルがガラススライドdeとカバースリップ。ガラススライドは-20℃で凍結され、2〜3日後に画像化される。 </li><li>赤色（セントロメア）および緑色（染色体）チャンネル7,13,14,20,21を使用して、60X対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡上のサンプルを画像化する。 z軸上の骨幹全体プレートにまたがるサンプルをスキャンし、0.35μmごとにステップを実行します。すべての単一計画のデジタル化されたイメージを保存します。 </li><li> NIH ImageJソフトウェアの細胞計数機能（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.htmlから入手可能）を使用して、直列共焦点部分のセントロメアを計数する。 注：隣接するセクションに表示されるセントロメアの繰り返しカウントを避けるには、数値コードを使用して連続したセクションに表示、滞在、消滅するセントロメアを特定します。 </li><li>染色体を再現するステップ2.1.11で独立した演算子でuntingする。 注：卵母細胞を倍数体（32染色体）、倍数体（32倍体）、または低倍体（&lt;32）として分類する。 </li></ol></li><li> スピンドル形態およびヒストンアセチル化 <ol><li>優性卵胞またはIVMの終わりに集めた後、ステップ2.1.2に記載されているように、0.5％ヒアルロニダーゼでの処理または穏やかなピペットで卵丘細胞を除去する。 </li><li>ステップ2.1.4のようにDPBS-PVAで卵母細胞を洗浄し、38℃で20分間2.5％パラホルムアルデヒドで固定する。ステップ2.1.4に記載されているようにして広範に洗浄し、0.1％Triton X-100で5分間室温で透過処理する。 注意：パラホルムアルデヒドを取り扱うときは、個人用保護具を着用し、有害廃棄物のガイドラインに従って汚染物質を処分してください。 </li><li> 2％ウシ血清アルブミン（DPBS-2％BSA）、0.05％サポニン、および10％正常ロバ血清を添加したDPBS中での非特異的結合のブロックRTで2時間。 注：サンプルは、4℃で3〜4日間ブロッキング溶液に保存することができます。 </li><li>一次染色のために、0.05％サポニンを含むDPBS-2％BSA中、マウス抗アルファ - チューブリン（1：150）およびウサギ抗acH4K16（1：250）中の卵母細胞を4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ステップ2.1.4のように卵母細胞を洗浄する。 0.05％サポニンを含むDPBS-2％BSA中、緑色蛍光色素結合ロバ抗マウスIgG（1：500）およびTRITC結合ロバ抗ウサギIgG（1：100）の溶液中で卵母細胞を1時間インキュベートする。暗闇の中のRT。 </li><li>ステップ2.1.4のように卵母細胞を洗浄した後、1μg/ mLの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を補充した非硬化性の抗フェードマウント培地の液滴に3-4個の卵母細胞を置き、スライドガラスに。 </li><li>ステップ2.1.8で説明したように、卵母細胞をガラススライド上にマウントする。 </li><li>赤色（acH4K16）、緑色（アルファ - チューブリン）、および青色（DNA）チャネルを使用して、60x対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡上のサンプルをイメージする。 注：赤と青チャンネルのレーザー設定は、すべてのサンプルの取得中一定に保ちます。 0.35μmごとにステップを使用して、減数分裂紡錘体および星状板全体に及ぶ試料をz軸上で走査する。デジタル化された画像（単一の計画と投影された3D画像）を保存します。 </li><li> NIH ImageJソフトウェア（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30）の測定機能を使用して、投影画像上の最大幅での極 - 柱スピンドル長さおよびスピンドル直径を測定する。 .html）。それぞれ3回繰り返し、平均を計算する。 </li><li> NIH ImageJソフトウェアの統合密度関数（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html）を使用して、acH4K16の相対蛍光を定量する。それをDAPI染色の統合密度について標準化する。 </li></ol></li></ol> mRNA発現の解析<ol><li> COCを5〜25mmの小胞から回収した後、顆粒膜細胞を収集するペトリ皿に残っている浮遊液を除去し、10,600×gで2分間遠心分離することにより冷たいDPBS中で2回洗浄する。液体窒素中で急速冷凍。サンプルを-80℃で6ヶ月間保存する。細胞は標準曲線のために働くであろう。 </li><li>未成熟（GV）、 インビトロで成熟した、およびインビボで成熟した卵母細胞から、ステップ2.1.2に記載されているように卵丘細胞を慎重にすべて除去する。 </li><li> 2.1.4に記載されているように、卵母細胞をDPBS-PVA中で洗浄し、1μLの体積でそれらを単独で収集し、2μLのRNALaterを上に置く。液体窒素中でスナップフリーズする。サンプルを-80℃で6ヶ月間保存する。 </li><li> 2μgのルシフェラーゼ RNAを各サンプルにスパイクインとして加える 。 2 x 2の卵母細胞をプールし、小さなサンプルからRNAを回収するのに適したシリカメンブレンフィルターベースのキットを使用して全RNAを抽出する。 </li><li> 0.25μgのランダムヘキサマーおよびマウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素で10μLのRNAを逆転写し、37＆<html> 176℃。サンプルを-20℃で6ヶ月間保存する。 </li><li> RNAseを含まない水中の顆粒膜細胞からcDNAを50ng /μLに希釈する。この溶液を1:10に希釈して5ng /μL、0.5ng /μL、0.05ng /μL、および0.005ng /μL溶液を得る。 </li><li>基質として0.05卵母細胞に相当するcDNA、または顆粒膜細胞cDNAの連続希釈物5μL、SYBRグリーンスーパーミックス10μLおよび各特異的プライマー0.3μMを用いて、反応あたり総量20μLで反応を3回組み立てる。 表1 ）。 </li><li> 95℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で20秒間を40回反復する3ステッププロトコールを使用して、サーマルサイクラーで反応を実行する。最後に、60℃から開始する融解曲線を取得し、95℃まで20秒ごとに0.5℃ずつ温度を上昇させます。 </li><li>検量線を用いて、卵母細胞サンプル中の特定のmRNAの開始量（SQ）を評価する対象とする遺伝子のSQとハウスキーピング遺伝子のSQとの比としてデータを表現する。 </li></ol>

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M., De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hyperacetylation+during+meiosis+interferes+with+large-scale+chromatin+remodeling,+axial+chromatid+condensation+and+sister+chromatid+separation+in+the+mammalian+oocyte.">Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).</li><li>Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+isolated+from+dairy+cows+with+reduced+ovarian+reserve+have+a+high+frequency+of+aneuploidy+and+alterations+in+the+localization+of+progesterone+receptor+membrane+component+1+and+aurora+kinase+B.">Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B.</a> Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).</li><li>Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+expression+and+putative+function+in+bovine+oocyte+maturation,+fertilization,+and+early+embryonic+development.">Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development.</a> Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).</li><li>Terzaghi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC1+participates+in+late+events+of+bovine+granulosa+cells+mitosis+and+oocyte+meiosis.">PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis.</a> Cell Cycle. , 1-14 (2016).</li><li>Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+in+the+mammalian+oocyte+in+space+and+time.">Translation in the mammalian oocyte in space and time.</a> Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternally+recruited+DCP1A+and+DCP2+contribute+to+messenger+RNA+degradation+during+oocyte+maturation+and+genome+activation+in+mouse.">Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse.</a> Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

IVMは20年以上にわたって馬で行われてきたが、我々は卵母細胞が胚性異数性の起源であるかどうかはまだ分かっていない17 。その理由は、おそらく、染色体計数のための卵母細胞増殖の準備が、かなりの試料損失をもたらすことであろう。このことを念頭に置いて、染色体分離の誤りを調べるために用いた方法の調査を行って、馬の卵母細胞に適用する最も適切な技術を探?...

女性、コンパニオンアニマル、絶滅の危機に瀕している種の不妊症を治療するための支援された生殖技術の広範な配列が開発されています。臨床設定における最も一般的な手順の1つは、超音波誘導経膣吸引、卵巣ピックアップ（OPU） 1による卵胞からの中期II（MII）ステージ卵母細胞の回収である。次いで、これらの卵母細胞をin vitro （IVF）で受精させ、得られた胚をレシピエント子宮に移植する。 MII期（成熟）卵母細胞は、外因性ゴナドトロピンの投与後に回収される。しかしながら、この治療は、一部の患者において、卵巣過剰刺激症候群（OHSS） 2の発症と関連している。 いったん卵胞から単離された減数分裂を自発的に再開する完全に増殖した未成熟卵母細胞（GVステージ）の本質的能力を利用して、投与することなく成熟卵母細胞を得ることが可能である性腺刺激ホルモンを摂取する3 。この手順は、卵母細胞のインビトロ成熟（IVM）と呼ばれ、繁殖技術を補助するために薬物志向性が低く、費用が低く、患者にやさしいアプローチです。しかし、 インビトロ で成熟した卵母細胞を用いた胚発生の成功は、一般にインビボで成熟した卵母細胞よりも低い4,5 。可能性のある説明は、インビトロで成熟した卵母細胞が染色体分離の誤りによってより影響を受け、その結果生じる異数性が正常な胚発生を損なうということである6 。 IVM中の染色体の誤分離の分子的基礎を理解することは、最終的にこの技術の完全な可能性を明らかにするであろう。この静脈では、 インビボで成熟した卵母細胞の形態学的および生化学的特徴をin vivoでの成熟と比較して調べるために実験的アプローチが用いられたここに記載されている7,8 。具体的には、未成熟卵母細胞および成熟卵母細胞のOPUおよび未成熟卵母細胞のIVMの手順を、実験モデルとして成体および自然循環馬を用いて説明する。次いで、免疫蛍光および画像分析を用いて、染色体分離、紡錘体形態およびこれらの配偶子上のヒストンアセチル化の全体的パターンを調べる。最後に、mRNA発現の分析のための逆転写および定量的PCRのプロトコルが記載される。 げっ歯類の動物モデルと比較して、馬は遺伝子操作を許さず、操作が容易でなく、高価なメンテナンスを必要とする。しかしながら、このモデルは、ヒト卵巣生理学との類似性のために、卵母細胞の成熟9,10の研究にかなりの関心を集めている11,12。/ sup&gt;。さらに、馬におけるIVM-IVFの信頼できるプロトコールの開発は、高い遺伝的価値の牝馬からの仔馬の数の増加を可能にするので、実質的な経済的関心を有する。 卵母細胞、特に、単核種の実験を行うことの限界の1つは、制限されたサンプルの入手可能性である。この制限は、以前にマウスで開発された方法を、馬の卵母細胞13,14に調整して、サンプルの損失を最小限にする染色体計数を行うことによって克服されてきた（利用可能な他の技術との比較の説明を参照）。さらに、三重蛍光染色プロトコルを最適化して同じサンプルについて複数の分析を行い、q-PCR分析を2個の卵母細胞のプールのみで行った。 全体的に、本研究は、形態学的および生化学的なcha低いサンプルの入手可能性のために勉強することが非常に困難な細胞型であるウマ卵母細胞を狂わせる。しかし、それは生殖生物学および不稔性種の不妊症に関する知識を拡大することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">ultrasound probe</td>
			<td style="width:159px;">Aloka</td>
			<td style="width:113px;">UST-5820-7,5</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human chorionic gonadotrophin&#160;</td>
			<td>centravet</td>
			<td>CHO004</td>
			<td>1500unit/animal IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">detomidine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>MED010</td>
			<td>9-15&#181;g/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">butylscopolamine bromure&#160;</td>
			<td>centravet</td>
			<td>EST001</td>
			<td>0,2mg/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:159px;">NIKON</td>
			<td style="width:113px;">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">butorphanol</td>
			<td>centravet</td>
			<td>DOL003</td>
			<td>10&#181;g/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzyl-penicillin</td>
			<td>centravet</td>
			<td>DEP203 IM</td>
			<td>15000UI/animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCM199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3769 10X1L</td>
			<td>powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaHCO3-buffered TCM199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2154-500ML</td>
			<td>liquid for IVM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epidermal growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">newborn calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4762-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dishes</td>
			<td>NUNCLON</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>BB6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">monastrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">normal donkey serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>636102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>711-025-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vecta-Shield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">YOPRO1</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Y3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope&#160;</td>
			<td>LSM 780&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope&#160;</td>
			<td>LSM 700&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ software</td>
			<td colspan="2">rsb.info. nih.gov/ij/download.html&#160;</td>
			<td>free resource</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti-alpha-tubulin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-acH4K16</td>
			<td>Upstate Biotechnology</td>
			<td>07-329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNALater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferase RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PicoPure RNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">random hexamers&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>N8080127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green supermix&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">specific primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermal-cycler&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MyiQ&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-CENPA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-Aurora B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3609</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of chromosome segregation, histone acetylation, and spindle morphology in horse oocytes

補助生殖の分野は、女性、コンパニオンアニマル、絶滅危惧種の不妊症を治療するために開発されました。馬では、補助生殖により、スポーツキャリアを中断することなく、高パフォーマーからの胚の生産が可能になり、高い遺伝子価値の牝馬からの仔馬の数の増加に寄与する。本稿は、卵巣ピックアップ（OPU）を用いて、馬の卵巣から未熟かつ成熟した卵母細胞を採取するために用いられる手順を記載している。次いで、これらの卵母細胞を使用して、以前にマウスで開発されたプロトコールを適合させることにより異数性の発生率を調べた。具体的には、共焦点レーザー顕微鏡走査後に、中期II（MII）卵母細胞の染色体およびセントロメアを蛍光標識し、逐次焦点計画でカウントした。この分析は、未成熟卵母細胞を卵胞から採取し、インビトロで成熟させた場合の異数性率が高いことを明らかにしたインビボで。特異的リジン残基でのチューブリンおよびアセチル化形態のヒストン4の免疫染色も、減数分裂紡錘体の形態およびヒストンアセチル化の全体的パターンにおける差異を明らかにした。最後に、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）およびアセチルトランスフェラーゼ（HAT）をコードするmRNAの発現を、逆転写および定量PCR（q-PCR）によって調べた。 インビトロおよびインビボで成熟した卵母細胞の間で転写物の相対的発現に差異は観察されなかった。卵母細胞成熟中の転写活性の一般的なサイレンシングと一致して、全転写量の分析は、mRNAの安定性または分解しか示さない。したがって、これらの知見は、他の翻訳および翻訳後の規制が影響を受ける可能性があることを示している。 全体として、本研究は、形態学的および生化学的に馬の卵母細胞サンプルの入手可能性が低いため、研究するのが非常に困難です。しかし、それは、生殖生物学および不妊症種についての私たちの知識を拡大することができます。

これらの実験の最初の知見は、以前に詳細に記載されており、記載されたプロトコルを使用して得ることができる結果の例としてここに報告されている。 成熟率優性濾胞からO​​PUによって回収された32個のCOCのうち、28個（88％）がMII段階にあった。 5〜25mmの大きさの小胞から?...

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ウマ卵母細胞における染色体分離、ヒストンアセチル化および紡錘体形態の解析 |発生生物学 |ビデオ

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

この原稿は、形態学的および生化学的に馬の卵母細胞を特徴付けるための実験的アプローチを記載している。具体的には、超音波誘導卵子ピックアップ（OPU）による未成熟および成熟ウマの卵母細胞の採取方法および染色体分離、紡錘体形態、全球ヒストンアセチル化およびmRNA発現を調べる方法を具体的に説明する。

馬の卵母細胞における染色体分離、ヒストンアセチル化およびスピンドル形態の解析

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

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10.9K ビュー.  University of Milan. この原稿は、形態学的および生化学的に馬の卵母細胞を特徴付けるための実験的アプローチを記載している。具体的には、超音波誘導卵子ピックアップ（OPU）による未成熟および成熟ウマの卵母細胞の採取方法および染色体分離、紡錘体形態、全球ヒストンアセチル化およびmRNA発現を調べる方法を具体的に説明する。 

ビデオ: Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

蛍光タンパク質の発現において<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt;未受精卵へのmRNA注入による

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

発生生物学

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

核小体クロマチン組織に基づいてマウス洞卵母細胞の単離とキャラクタリゼーション

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart disease. To study the formation of PAAs, we developed a protocol using whole-mount immunofluorescence coupled with benzyl alcohol/benzyl benzoate (BABB) tissue clearing, and confocal microscopy. This allows for the visualization of the pharyngeal arch endothelium at a fine cellular resolution as well as the 3D connectivity of the vasculature. Using software, we have established a protocol to quantify the number of endothelial cells (ECs) in PAAs, as well as the number of ECs within the vascular plexus surrounding the PAAs within pharyngeal arches 3, 4, and 6. When applied to the whole embryo, this methodology provides a comprehensive visualization and quantitative analysis of embryonic vasculature.

Here, we describe a protocol to visualize and analyze the pharyngeal arch arteries 3, 4, and 6 of mouse embryos using whole-mount immunofluorescence, tissue clearing, confocal microscopy, and 3D reconstruction.

全実装免疫学化学と3D再構成を用いた咽頭弓動脈の可視化と解析

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

未熟ネコの最小体積ガラス化

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

牛の初期のアンタル卵胞からの卵母細胞のための体外培養戦略

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

ゼブラフィッシュの卵巣卵胞における濾胞細胞と卵母細胞の分離

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...