異数性は、人間の早期流産の主な遺伝的原因です。染色体分配のほとんどのエラーは、卵母細胞の減数分裂中に発生します。したがって、卵母細胞の紡錘体アセンブリチェックポイントを評価することは、卵母細胞がエラーが発生しやすい理由を理解するために重要です。
ここでは、ライブイメージングと免疫蛍光の組み合わせを使用してチェックポイントでのさまざまな重要なステップを調べることにより、マウス卵母細胞のSAC完全性を包括的に評価する3つの手法について説明します。手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるセシリア・ブレンジーニ博士です。原稿に記載されているように、対照としてDMSOを含むノコダゾールおよびリバーシンを含む1ミリリットルの培養培地を調製し始める。
卵母細胞の成熟とライブイメージングには、インキュベーター内で事前に温めた96ウェルプレートを使用します。そして、第1、第2および第3のウェルにそれぞれ150マイクロリットルのコントロールDMSO、ノコダゾールおよびノコダゾールプラスリバーシン処理をロードした。原稿に記載されている条件下でプレートをインキュベーター内に保ちながら。
筋成熟を開始するには、DMSOを含む100マイクロリットルのミリノン遊離培養培地6滴を通して卵母細胞を順次移すことによってミリノンを除去します。そして、それらを96ウェルプレートの対応するウェルに入れます。手または口内ピペットを用いて、実体顕微鏡下で卵母細胞を観察した。
摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度80%の制御された環境を備えたインキュベーターチャンバーを備えた明視野顕微鏡を使用して卵母細胞を画像化します。卵母細胞の中央面で20分間隔で24時間画像をキャプチャします。卵の隣と共有透明帯内の小さな細胞で非対称サイトカインを通過する細胞を特定することにより、極体を押し出す卵母細胞の数を定量化した後。
イメージングソフトウェアを使用して画像を表示します。前期1の停止卵母細胞に、事前に調製したセクリン-gfp cRNAのマイクロリットルあたり100ナノグラムをマイクロインジェクションします。マイクロインジェクション後、卵母細胞を二酸化炭素インキュベーター内で少なくとも3時間回収してRNAを翻訳します。
次に、5マイクロモルのノコダゾールの有無にかかわらず、150マイクロリットルの培養培地をロードします。0.5マイクロモルのリバーシンを含む150マイクロリットルの培養培地を96ウェルプレートの3つの異なるウェルに入れた。マイクロインジェクションした卵母細胞を6滴のミルリノン遊離培養培地で洗浄し、卵母細胞の3分の1を各処理に移します。
ミルリノン洗浄の約3時間後に、卵母細胞が減数分裂を再開するまで、5%二酸化炭素と80%湿度で摂氏37度でインキュベーター内のプレートを維持します。インキュベーターチャンバーを備えた蛍光顕微鏡を使用して卵母細胞の成熟の画像を記録します。画像解析ソフトウェアを使用して、セクリン-gfp破壊を定量化し、時間0.1から開始してGFPチャネルの画像を開きます。
目的の解析ソフトウェアでは、選択ツールまたは形状ツールを使用して各卵母細胞をマークし、各細胞の関心領域を生成します。同じ関心領域を使用して、後で減算する背景領域を選択し、すべての時点で各関心領域のGFPピクセル強度を測定します。最後に、各GFP値に対して、バックグラウンドにおける関心領域の測定値を差し引きます。
減数分裂を3つのグループに分割した後、減数分裂の各グループを100マイクロリットルのミルリノン遊離培養培地に移します。滴を鉱油で覆い、インキュベーターに3時間、5時間、7時間入れて、それぞれ前中期1期、後期前中期1期、中期1期に到達します。割り当てられた時点で、9ウェルガラス皿を使用して室温で20分間、PMEバッファー中の500マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒド滴に移して卵母細胞を固定します。
次に、細胞を500マイクロリットルのブロッキング溶液を含むきれいなウェルに移します。MAD2検出を継続するには、500マイクロリットルの透過処理液滴を含むクリーンウェルに卵母細胞を移します。室温で20分間インキュベートした後、細胞をブロッキング溶液の新しいウェルに移し、10分間インキュベートします。
卵母細胞を抗MAD2抗体と抗セントロメア抗体を含む30マイクロリットルのブロッキング溶液に移し、室温で2時間インキュベートします。細胞を0.5%Tritonを添加した30マイクロリットルのPMEバッファーに移した後、過剰な一次抗体を洗浄するために、加湿チャンバー内で10分間インキュベートします。細胞を、抗ヒト633および抗ウサギ568などの二次抗体を含む30マイクロリットルのブロッキング溶液に移す。
そして室温で1時間インキュベートする。顕微鏡スライドに細胞をマウントするには、DAPIを含む10マイクロリットルの封入培地に細胞を移します。カバースリップの各角にワセリンの小さなドットを追加します。
それらをマウントメディアドロップの上に慎重に置き、ゆっくりと押して配布します。透明なマニキュアを使用してカバースリップをスライドにシールします。40倍または63倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用した画像運動原体。
そして抗セントロメア抗体シグナルを用いて、染色体領域全体のイメージングを可能にするZ範囲を決定する。DMSO処理されたコントロール卵母細胞は、ミルリノンからの放出後約14時間で極性体を押し出した。SAC活性化後、ノコダゾール処理卵母細胞は中期1で停止し、極性体を押し出さなかった。
しかし、SAC活性化がない場合、卵母細胞は動原体微小管付着がないにもかかわらず極性体を押し出した。筋成熟時のセクリン-gfp分解速度を評価した。前記コントロールDMSO処理卵母細胞セクリン-gfp強度は、ミルリノンウォッシュアウト後約10時間で減少し始める。
SAC活性化剤、ノコダゾール、セクリン-gfpレベルの存在下で卵母細胞を成熟させると、筋成熟の全期間にわたって安定していた。対照的に、リバーシン処理でSAC活性化を予防した場合、セクリン-gfpパターンは加速し、分解はSAC阻害と一致するミルリノンウォッシュアウトの約4時間後に始まりました。.共焦点イメージングを使用して、前中期初期、後期前中期1、中期1に成熟した卵母細胞のセントロメアとMAD2を検出しました。
SAC信号の強度を評価するために、動原体局在化し、MAD2画素強度を定量化した。動原体へのMAD2動員の有意なレベルは、ほとんどの動原体が微小管に付着していなかった前中期初期に発生します。MAD2のレベルは、後期中期に減少し、すべての動原体が微小管に安定して付着した中期1ではほとんど存在しませんでした。
これらの手法にはそれぞれ制限と解釈があることを強調することが重要です。また、これらの方法を組み合わせて実行して、SAC の整合性を評価することをお勧めします。これらの3つのエッセイにより、研究者は卵母細胞の嚢の厳密さを評価し、ヒト卵子の異数性の潜在的な原因についての洞察を得ることができます。
