저자들은 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 (LSCM) , Philippe Barrière 및 Thierry Blard의 매일 초음파 난소 스캐닝 및 hCG 주입에 대한 지원을 위해 Fabrice Vincent에게 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 &quot;Regione Sardegna and Regione Lombardia&quot;프로젝트 &quot;Ex Ovo Omnia&quot;(보조금 26096200에서 AML로)에 의해 지원되었습니다. &quot;L&#39; Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012&quot;Fellowship (2012 년 FF로 계약), FP7-PEOPLE-2011-CIG, 연구 집행 기관 (REA) &quot;Pro-Ovum&quot;(부여 번호 303640 - VL); 유럽 ​​사회 기금, 인적 자원 개발 부문 별 운영 프로그램 (2007-2013 년 계약 번호 : POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 in IM)이 공동으로 후원하는 농업 및 수의학 박사 과정이있다. in vivo oocyte collection은 Français du Cheval et de l&#39; Equitation에 의해 지원되었습니다.

모든 절차는 동물 보호 및 사용위원회 CEEA Val de Loire Number 19에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 난 모세포 수집 및 생체 외 성숙 <ol><li> 오옴 픽업 <ol><li> 매일 성인 암말 집단에서 난소 난소의 직경을 초음파로 평가합니다. 난포가 33 mm 이상일 때, 정맥 정맥 상부에 1,500 IU의 인간 chorionic gonadotrophin (hCG)을 주입한다 (iv). <ol><li> 주사를하기 전에 알코올로 부위를 닦고 경정맥을 찾은 다음 주사 부위 아래에 2 ~ 3cm 정도의 엄지 손가락을 대어 정맥이 올라 오도록하십시오. 바늘을 목에 거의 평행하게 삽입하고 바늘이 정맥에 있는지 확인하십시오 (혈액이 주사기로 들어갑니다). 이 시점에서 주사; hCG는우성 여포에있는 난 모세포의 발달. </li></ol></li><li> hCG 주사 35 시간 후 detomidine (15 μg / kg, iv), butorphanol tartrate (10 μg / kg, iv) 및 butylscopolamine bromure (0.2-0.3 mg / kg, 15 mL / mare, iv)로 수컷을 진정시킨다. </li><li> 바늘을 초음파 탐침에 연결하십시오. 초음파 프로브를 질식 삽입하고 초음파 프로브를 직면하도록 난소를 직립 상태로 유지하십시오. 한 명의 조작원에게 바늘을 조종하고 다른 하나는 초음파 프로브를 마주 보는 난자를 제자리에 놓습니다 . 우세한 난포가있는 난소에서 시작하십시오. </li><li> 질 벽과 지배적 인 여포의 벽을 바늘로 찔러 넣으십시오 (OPU 용 초음파 프로브에는 흡입 시스템에 연결된 바늘 용 채널이 있습니다). theneedle은 echographic 이미지에서 볼 수 있습니다. </li><li> 흡입 시스템에 연결된 50 ML 원추형 튜브에 follicular 유체를 대기음. 원추형의 내용물을 붓는다.튜브를 큰 배양 접시에 넣고 stereomicroscope를 사용하여 cumulus-oocyte complex (COC)를 찾는다. </li><li> COC는 항상 난포액으로 검색되지 않기 때문에, 5 IU / mL heparinat 37 ° C를 함유 한 Dulbecco의 변형 된 인산염 완충 식염수 (DPBS)로 여포를 세척하십시오. 이미 1.1.5 단계에서 난포액에 대해 설명한대로 DPBS의 COC 존재를 검사하십시오. COC가 회수 될 때까지 여러 번 세척하십시오. </li><li> 지배적 인 여포에서 COC가 검색되면, 1.1.3-1.1.4 단계에서 지배적 인 여포에 대해 설명한 바와 같이 ≥ 5 및 ≤25mm의 모공을 뚫고 플러시하십시오. 5 개 이상 ≤25 개는 황체 형성 호르몬 / 콜리 오가 나도 트로 핀 수용체 (LHCGR)를 발현하지 않으므로 hCG에 반응하여 성숙하지 않으며 GV 단계 (미성숙)에서 수집됩니다. 여러 가지 완전한 층의 적운 세포와 갈색, 미세하게 과립 화 된 ooplasm으로 만 COC를 유지하십시오. 다른 사람들은 버립니다. </li><li> OPU가 끝날 때,감염을 방지하기 위해 수컷은 벤질 - 페니실린 15,000IU / 동물을 투여하십시오. </li><li> 최소한 2 시간 동안 조용하고 깨끗한 상태에서 암말을 입으십시오. 귀의 위치, 자극에 대한 반응 ( 예 : 소음)을 측정하고 암말을 다른 동물의 회사에 반환하기 전에 걸음 걸이로인지의 흔적을 확인하십시오. </li></ol></li><li> 체외 성숙 <ol><li> 헤파린 1,790 IU / L, 0.4 % 소 혈청 알부민 (BSA), 페니실린 및 스트렙토 마이신을 보충 한 따뜻한 HEPES- 완충 된 TCM199 (20 mM Hepes) 37 ° C. 미리이 매체를 준비하십시오. 필터를 살균하고 최대 6 개월 동안 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 50 NG / ML 상피 성장 인자 (EGF)와 20 % 송아지 혈청 7 NaHCO 3 - 보충 TCM199 (25 MM NaHCO 3 ) 보완하여 IVM 매체를 준비합니다. 새로운 병을 뗀 후 3 주 이내에 NaHCO 3 보충 TCM199를 사용하십시오. EGF를 미리 100x 배지로 준비하고 -20 ° C에서 동결 시켜라.6 개월 이내에 사용하십시오. 최소한 2 시간 동안 38.5 ° C에서 5 % CO 2 가 포함 된 가습 공기 중에서 4-well dish의 웰에 500 μL를 분배하고 배양하십시오. </li><li> 5 ~ 25 밀리미터 이상 모낭에서 COC를 회수 한 후 HEPES-TCM199 2 mL가 채워진 페트리 접시 (직경 3.5 cm)에 넣으십시오. 세포 파편을 씻어 내기 위해 COC를 접시의 다른 영역으로 옮기십시오. </li><li> COCs를 IVM 배지에 옮기고 38.5 ° C에서 5 % CO2의 가습 공기 중에서 28 시간 배양합니다. </li></ol></li></ol> 2. 면역 형광 및 이미지 분석 <ol><li> 염색체 수 <ol><li> 우세한 모낭 또는 IVM의 끝에 수집 후, 38.5 ° C에서 5 % CO 2 와 가습 공기에서 1 시간 100 μm의 monastrol와 COC를 품어. monastrol을 미리 100x 축척으로 준비하고 -20 ° C에서 1 년까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 적운 세포 제거0.5 % hyaluronidase로 치료하거나 부드럽게 pipetting; 0.2 % pronase에서 처리하여 투명대를 제거합니다. 사전에 hyaluronidase와 pronase를 10x 배지로 준비하고 -20 ° C에서 1 년까지 보관하십시오. </li><li> 4 ° C에서 추가로 45 분 후 38.5 ° C에서 15 분 동안 DPBS의 4 % paraformaldehyde에 난 모세포를 수정. 주의! 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 개인 보호 장비를 착용하고 유해 폐기물 처리 지침에 따라 오염 된 물질을 처리하십시오. </li><li> 0.1 % 폴리 비닐 알콜 (PVA)을 보충 한 DPBS 500 μL로 채워진 3 개의 웰에 순차적으로 옮겨 난 모세포를 세척한다. 실온 (RT)에서 10 분 동안 0.3 % Triton X-100에서 침투. </li><li> RT에서 적어도 30 분 동안 1 % 소 혈청 알부민 (DPBS-1 % BSA)과 10 % 정상 당나라 혈청을 보충 한 DPBS에서 비특이적 결합 배양을 차단하십시오. 시료는 4 ℃에서 3 ~ 4 일 동안 blocking 용액에 보관할 수 있습니다. </li><li> 기본 얼룩 들어, 4 ° C 하룻밤 1 % BSA (희석 1시 50 분)로 보충 DPBS의 토끼 방지 오로라 B phospho - Thr232에 oocytes를 품어. </li><li> 단계 2.1.4에서 설명한대로 oocytes를 씻으십시오. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 tetra - methylrhodamine isothiocyanate (TRITC) - 결합 당나귀 안티 - 토끼 IgG (DPBS - 1 % BSA에 1 : 100)의 oocytes을 품어. </li><li> 단계 2.1.4에서 설명한대로 oocytes을 씻어 다음 유리 슬라이드에 20 μm의 YOPRO1 보충 비 경화, 안티 페이드 장착 매체 한 방울에 3-4 oocytes를 놓으십시오. 모든 난 모세포가 장착 될 때까지 절차를 반복하십시오 (슬라이드 당 3-4 개의 난 모세포). </li><li> oocytes가 장착 매체에 약 10 분 동안 정착 수 있도록하고 coverslip으로 그들을 커버. oocytes을 분쇄하지 않도록, 유리 슬라이드에 coverslip을 배치하기 전에 양면 테이프 두 스트립을 적용합니다. 참고 :이 예방 조치는 모든 샘플이 유리 슬리드 coverslip. 유리 슬라이드는 -20 ° C에서 얼 수 있으며 다음 2-3 일 동안 이미지화됩니다. </li><li> 적색 (centromeres) 및 녹색 (염색체) 채널 7 , 13 , 14 , 20 , 21을 사용하여 60X 목적과 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에 샘플을 이미지. 0.35 μm 간격으로 z 축에 전체 metaphasic 플레이트에 걸친 샘플을 스캔하십시오. 모든 단일 계획의 디지털화 된 이미지를 저장하십시오. </li><li> NIH ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html에서 구할 수 있음)의 셀 카운트 기능을 사용하여 직렬 공 촛점 절에서 센트로 메어를 센다. 참고 : 숫자 코드가있는 순차적 섹션에서 나타나고 머물러 있고 사라지는 중심체를 식별하여 인접한 섹션에 나타나는 centromeres의 반복 횟수를 피하십시오. </li><li> 염색체를 반복한다.독립 운영자에게 2.1.11 절에서 unting. 참고 : euploid (32 염색체), 과잉 배수 (&gt; 32) 또는 저배수 (&lt;32)로 난 모세포를 분류하십시오. </li></ol></li><li> 스핀들 형태와 히스톤 아세틸 화 <ol><li> 지배적 인 여포 또는 IVM의 끝에 수집 후, 단계 2.1.2에서 설명한대로 0.5 % hyaluronidase 또는 부드러운 pipetting으로 치료하여 cumulus 세포를 제거합니다. </li><li> 단계 2.1.4에서와 같이 DPBS - PVA의 oocytes을 씻고 38 ° C에서 20 분 동안 2.5 % 파라 포름 알데히드에 그들을 수정. 단계 2.1.4에서 설명한대로 광범위하게 씻어서 0.1 % Triton X-100에서 5 분간 RT에서 투과 시키십시오. 참고 : 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 개인 보호 장비를 착용하고 유해 폐기물 처리 지침에 따라 오염 된 물질을 처리하십시오. </li><li> 2 % 소 혈청 알부민 (DPBS - 2 % BSA), 0.05 % 사포닌 및 10 % 정상 당나라 혈청을 보충 한 DPBS에서 비특이적 결합 배양을 차단RT에서 2 시간. 참고 : 시료는 4 ℃에서 3 ~ 4 일 동안 블로킹 용액에 보관할 수 있습니다. </li><li> 기본 얼룩 들어, 밤새 4 ° C에서 0.05 % 사포닌과 DPBS - 2 % BSA에서 마우스 anti-alpha-tubulin (1 : 150) 및 토끼 anti-acH4K16 (1 : 250)에서 oocytes를 품어. </li><li> 단계 2.1.4와 같이 oocytes을 씻으십시오. 0.05 % 사포닌을 함유 한 DPBS-2 % BSA에서 녹색 형광 염료 - 접합 당나귀 항 마우스 IgG (1 : 500) 및 TRITC- 결합 당나귀 항 - 토끼 IgG (1 : 100)의 용액에서 난 모세포를 1 시간 동안 항온 배양한다 어둠 속에서 RT. </li><li> 단계 2.1.4에서와 같이 난 모세포를 씻어 낸 다음 1 μg / ML 4 &#39;, 6 - diamidino - 2 - phenylindole (DAPI)을 보충 한 비 경화, 안티 - 페이드 장착 매체 한 방울에 3-4 oocytes를 놓습니다. 유리 슬라이드에. </li><li> 단계 2.1.8에서 설명한대로 유리 슬라이드에 oocytes를 탑재합니다. </li><li> 빨간색 (acH4K16), 녹색 (알파 - 튜 불린) 및 파란색 (DNA) 채널을 사용하여 60x 대물 렌즈로 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에서 샘플을 이미지화하십시오. 참고 : 모든 샘플을 수집하는 동안 빨간색과 파란색 채널에 대한 레이저 설정을 일정하게 유지하십시오. 모든 감광 스핀들과 metaphasic 플레이트에 걸쳐 0.35 μm 간격으로 z 축에서 샘플을 스캔하십시오. 디지털화 된 이미지 (단일 계획 및 투사 된 3D 이미지)를 저장하십시오. </li><li> NIH ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30)의 측정 기능을 사용하여 투영 된 이미지의 최대 너비에서 pole-to-pole 스핀들 길이와 스핀들 직경을 측정하십시오. .html). 각 3 번 반복하고 평균을 계산하십시오. </li><li> NIH ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html)의 통합 밀도 기능을 사용하여 acH4K16의 상대적 형광을 정량화하십시오. DAPI 염색의 통합 밀도를 위해 표준화하십시오. </li></ol></li></ol> 3. mRNA 발현 분석 <ol><li> 5 ~ 25 mm 모낭에서 COC를 회수 한 후 육아종 세포를 수집합니다페트리 접시에 남아 uspension 및 2 분 10,600 XG에서 원심 분리하여 차가운 DPBS에서 두 번 씻으십시오. 액체 질소에서 급히 동결. -80 ° C에서 최대 6 개월 동안 샘플을 보관하십시오. 세포는 표준 곡선을 위해 봉사 할 것이다. </li><li> 미숙 (GV), 체외에서 성숙 및 생체 내에서 성숙 oocytes에서 단계 2.1.2에서 설명한대로 모든 cumulus 세포를 조심스럽게 제거하십시오. </li><li> 2.1.4에 설명 된대로 oocytes을 DPBS - PVA에서 씻어, 1 μL 볼륨에서 그들을 수집하고 위에 2 μL RNALater 누워. 액체 질소에서 급속 동결. -80 ° C에서 최대 6 개월 동안 샘플을 보관하십시오. </li><li> 루키 페라 제 RNA 2 μg을 각 시료에 스파이크 인 (spike-in)으로 첨가하십시오. oocytes 2 X 2 풀과 작은 샘플에서 RNA를 복구하는 데 적합한 실리카 멤브레인 필터 기반 키트를 사용하여 전체 RNA를 추출하십시오. </li><li> 37 μM에서 1 시간 동안 0.25 μg 무작위 hexamers 및 마우스 Moloney 백혈병 바이러스 역전사 효소와 10 μL에서 RNA 역전사 -<html> 176 ℃. 최대 6 개월 동안 -20 ° C에서 샘플을 보관하십시오. </li><li> RNAse없는 물에서 granulosa 세포에서 cDNA를 50 NG / μL로 희석. 이 용액을 1:10으로 희석하여 5 ng / μL, 0.5 ng / μL, 0.05 ng / μL 및 0.005 ng / μL 용액을 얻으십시오. </li><li> 기질로서 0.05 oocytes에 해당하는 cDNA 또는 granulosa 세포 cDNA의 연속 희석액 5 μL, SYBR 녹색 supermix 10 μL 및 각 특정 프라이머의 0.3 μm의를 사용하여 반응 당 총 20 μL의 총 볼륨에서 triplicate로 반응을 조립 표 1 ). </li><li> 3 단계 프로토콜을 사용하여 열 순환 장치에서 반응을 실행하십시오 : 95 ° C 30 초, 60 ° C 30 초 및 72 ° C 20 초, 40 회 반복. 마지막으로, 60 ° C부터 시작하여 용융 곡선을 얻고 95 ° C까지 20 ° C마다 0.5 ° C 씩 온도를 올립니다. </li><li> 표준 곡선을 사용하여 oocyte 샘플에서 특정 mRNA의 시작 수량 (SQ)을 평가granulosa 세포 샘플을 기준으로 계산 된 f&gt; 15. 해당 유전자의 SQ와 하우스 키핑 유전자의 SQ 사이의 비율로 데이터를 표현하십시오. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+induced+developmental+defects+in+the+mouse:+oocyte+meiotic+aneuploidy+and+fetal+growth+retardation/brain+defects.">High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects.</a> PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).</li><li>Ma, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+(HDAC2)+regulates+chromosome+segregation+and+kinetochore+function+via+H4K16+deacetylation+during+oocyte+maturation+in+mouse.">Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).</li><li>Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hyperacetylation+during+meiosis+interferes+with+large-scale+chromatin+remodeling,+axial+chromatid+condensation+and+sister+chromatid+separation+in+the+mammalian+oocyte.">Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).</li><li>Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+isolated+from+dairy+cows+with+reduced+ovarian+reserve+have+a+high+frequency+of+aneuploidy+and+alterations+in+the+localization+of+progesterone+receptor+membrane+component+1+and+aurora+kinase+B.">Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B.</a> Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).</li><li>Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+expression+and+putative+function+in+bovine+oocyte+maturation,+fertilization,+and+early+embryonic+development.">Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development.</a> Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).</li><li>Terzaghi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC1+participates+in+late+events+of+bovine+granulosa+cells+mitosis+and+oocyte+meiosis.">PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis.</a> Cell Cycle. , 1-14 (2016).</li><li>Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+in+the+mammalian+oocyte+in+space+and+time.">Translation in the mammalian oocyte in space and time.</a> Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternally+recruited+DCP1A+and+DCP2+contribute+to+messenger+RNA+degradation+during+oocyte+maturation+and+genome+activation+in+mouse.">Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse.</a> Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

비록 IVM이 20 년 이상 말에서 수행되었지만, 우리는 인간에게 제안 된 것처럼 난 모세포가 배아 이수 배체의 기원이 될 수 있는지 여부를 아직 모른다. 그 이유는 염색체 계수를위한 난 모세포의 준비가 상당한 표본 손실을 초래할 수 있기 때문일 것입니다. 이를 염두에두고 염색체 분리의 오류를 조사하는 데 사용 된 방법을 조사하여 말의 난 모세포에 적용 할 수있는 가장 적합한 기술을 찾아 냈?...

여성, 동반자 동물 및 멸종 위기에 처한 종의 불임 치료를 위해 광범위한 재현 기술이 개발되었습니다. 임상 환경에서 가장 보편적 인 절차 중 하나는 초음파 유도 질식 흡입, 난자 채집 (OPU) 1 에 의한 난소에서 난태 (metaphase) II (MII) 단계 난 모세포를 회수하는 것입니다. 이 난 모세포는 수용체 자궁에 이식 된 배아와 함께 시험 관내 (IVF)에서 수정된다. MII- 단계 (성숙한) 난 모세포는 외인성 생식선 자극 호르몬의 투여 후에 회수된다. 그러나이 치료법은 일부 환자에서 난소과 자극 증후군 (OHSS) 2 의 발병과 관련이 있습니다. 한 번 모낭에서 분리 된 자발적으로 감수 분열을 재개하기위한 완전히 성장한 미숙 난 모세포 (GV-stage)의 내재적 인 능력을 이용하여, 관리자없이 성숙한 난 모체를 얻을 수 있습니다gonadotropin 조율 3 . 이 과정은 난자 시험관 내 성숙 (IVM)이라고 불리우며 생식 기술을 돕는 데있어 덜 약물 지향적이고 덜 비싸며 환자 친화적 인 접근 방식을 의미합니다. 그러나 체외 에서 성숙 된 난 모세포 를 이용한 배아 발달의 성공은 일반적 으로 생체 내에서 성숙한 난 모세포보다 더 낮다. 가능한 설명은 체외에서 성숙한 난 모세포가 염색체 분리의 오류에 더 영향을 받고, 결과 배수체가 정상 배아 발생을 저해한다는 것이다. IVM 동안의 염색체 오 분류의 분자 적 기초를 이해하는 것은 궁극적으로이 기술의 잠재력을 밝혀 줄 것입니다. 이 정맥 에서 in vitro에서 성숙한 난 모세포의 형태 학적 및 생화학 적 특징을 생체 내 성숙과 비교하는 실험 접근법ed oocytes는 7 , 8에 기술되어 있다. 구체적으로, 미성숙 및 성숙 난 모세포의 OPU 및 미성숙 난 모세포의 IVM 절차는 실험 모델로서 성인 및 자연 사이클링 말을 사용하여 설명됩니다. 그런 다음 immunofluorescence 및 이미지 분석은 염색체 분리, 스핀들 형태 및 이러한 배우자의 히스톤 아세틸 화의 전체적인 패턴을 조사하는 데 사용됩니다. 마지막으로 mRNA 발현 분석을 위해 역전사 및 정량적 PCR 프로토콜을 설명합니다. 설치류 동물 모델과 비교하여 말은 유전자 조작을 허용하지 않으며 조작하기가 쉽지 않으며 값 비싼 유지 관리가 필요합니다. 그러나이 모델은 난 모세포 생리학과의 유사성으로 인해 난 모세포의 성숙에 대한 연구에 상당한 관심을 보이고있다 9 , 10 &lt;/ sup&gt;. 더욱이, 말에서 IVM-IVF의 신뢰할 수있는 프로토콜의 개발은 높은 유전 적 가치의 암말로부터의 새끼의 수를 증가시킬 수 있기 때문에 상당한 경제적 이익을 갖는다. 난 모세포 (oocytes), 특히 독성이있는 종에서 실험을 수행하는 데있어 한계 중 하나는 제한된 샘플 가용성입니다. 이 한계는 샘플 손실을 최소화하는 염색체 계수를 수행하기 위해 이전에 생쥐에서 개발 된 접근법을 말 난 모세포 13 , 14 로 조정하여 여기서 극복되었습니다 (다른 가능한 기술과의 비교에 대한 설명 참조). 또한, 트리플 형광 얼룩 프로토콜은 동일한 샘플에 대한 여러 분석을 수행하기 위해 최적화되었으며, q - PCR 분석은 2 oocytes의 수영장에서만 수행되었습니다. 전반적으로, 본 연구는 형태 학적 및 생화학 적으로 cha낮은 샘플 가용성으로 인해 연구하기가 극히 어려운 세포 유형 인 말 oocyte를 괴롭 히고 있습니다. 그러나, 그것은 생식 생물학 및 monovulatory 종족의 불임에 대한 우리의 지식을 확장 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">ultrasound probe</td>
			<td style="width:159px;">Aloka</td>
			<td style="width:113px;">UST-5820-7,5</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human chorionic gonadotrophin&#160;</td>
			<td>centravet</td>
			<td>CHO004</td>
			<td>1500unit/animal IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">detomidine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>MED010</td>
			<td>9-15&#181;g/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">butylscopolamine bromure&#160;</td>
			<td>centravet</td>
			<td>EST001</td>
			<td>0,2mg/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:159px;">NIKON</td>
			<td style="width:113px;">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">butorphanol</td>
			<td>centravet</td>
			<td>DOL003</td>
			<td>10&#181;g/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzyl-penicillin</td>
			<td>centravet</td>
			<td>DEP203 IM</td>
			<td>15000UI/animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCM199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3769 10X1L</td>
			<td>powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaHCO3-buffered TCM199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2154-500ML</td>
			<td>liquid for IVM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epidermal growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">newborn calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4762-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dishes</td>
			<td>NUNCLON</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>BB6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">monastrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">normal donkey serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>636102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>711-025-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vecta-Shield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">YOPRO1</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Y3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope&#160;</td>
			<td>LSM 780&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope&#160;</td>
			<td>LSM 700&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ software</td>
			<td colspan="2">rsb.info. nih.gov/ij/download.html&#160;</td>
			<td>free resource</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti-alpha-tubulin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-acH4K16</td>
			<td>Upstate Biotechnology</td>
			<td>07-329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNALater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferase RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PicoPure RNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">random hexamers&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>N8080127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green supermix&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">specific primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermal-cycler&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MyiQ&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-CENPA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-Aurora B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3609</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of chromosome segregation, histone acetylation, and spindle morphology in horse oocytes

보조 생식 분야는 여성, 동반자 동물 및 멸종 위기 종의 불임 치료를 위해 개발되었습니다. 말의 보조 생식은 또한 스포츠 경력을 방해하지 않고 높은 수행자의 배아 생산을 허용하고 높은 유전 적 가치의 암말로부터 도태 한 새끼 수의 증가에 기여합니다. 본 원고는 난자 채취 (OPU)를 이용하여 말의 난소에서 미성숙 및 성숙 난 모세포를 채취하는 과정을 설명한다. 이 난 모세포는 마우스에서 이전에 개발 된 프로토콜을 적용하여 이수 배수 체의 발병률을 조사하는데 사용되었다. 특히, 중기 II 세포 (MII) 난 모세포의 염색체와 중심체 (centromeres)는 공 촛점 레이저 현미경 검사 후 순차적 초점 계획에서 형광으로 분류되고 계수되었다. 이 분석은 미성숙 난 모세포가 난포에서 채취 되고 생체 외에서 성숙되었을 때 이수 배수체 비율에서 더 높은 발병률을 나타냈다.생체 내. 특정 라이신 잔기에서 튜 불린 및 히스톤 4의 아세틸 화 형태에 대한 면역 염색 또한 감수 분열의 형태 및 히스톤 아세틸 화의 전체 패턴에서의 차이를 나타냈다. 마지막으로, 역전사 및 정량적 PCR (q-PCR)에 의해 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 및 아세틸 트랜스퍼 라제 (HAT)를 코딩하는 mRNA의 발현을 조사 하였다. 시험 관내 및 생체 내에서 성숙한 난 모세포 사이 에서 전사 물의 상대적인 발현에 차이는 관찰되지 않았다. oocyte 성숙 동안 전사 활동의 일반적인 침묵과 일치하여 총 전사 양의 분석은 mRNA 안정성 또는 분해를 나타낼 수 있습니다. 따라서 이러한 결과는 다른 번역 및 번역 후 규정이 영향을받을 수 있음을 나타냅니다. 전반적으로,이 연구는 형태학 및 생화학 적으로 말의 난 모세포, cell 유형은 낮은 샘플 가용성으로 인해 연구하기 매우 어렵습니다. 그러나, 그것은 생식 생물학 및 monovulatory 종족에 불임에 대한 우리의 지식을 확장 할 수 있습니다.

이 실험에 대한 최초의 발견은 앞서 깊이있게 설명되었으며 본원에서 기술 된 프로토콜을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예로서보고되었다. 성숙 비율 지배 모낭으로부터 OPU에 의해 회수 된 32 개의 COC 중 28 개 (88 %)가 MII 단계에 있었다. 크기가 5-25mm 인 모낭으로부터 수집 된 58 개의...

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Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

이 원고는 형태 학적 및 생화학 적으로 말의 난 모세포를 특성화하기위한 실험적 접근법을 기술한다. 특히, 본 연구는 초음파 유도 난자 채취 (OPU)에 의한 미성숙 및 성숙한 난 모세포를 수집하는 방법과 염색체 분리, 스핀들 형태, 전 세계 히스톤 아세틸 화 및 mRNA 발현을 조사하는 방법을 설명한다.

말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

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10.9K 조회수.  University of Milan.  이 원고는 형태 학적 및 생화학 적으로 말의 난 모세포를 특성화하기위한 실험적 접근법을 기술한다. 특히, 본 연구는 초음파 유도 난자 채취 (OPU)에 의한 미성숙 및 성숙한 난 모세포를 수집하는 방법과 염색체 분리, 스핀들 형태, 전 세계 히스톤 아세틸 화 및 mRNA 발현을 조사하는 방법을 설명한다. 

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

형광 단백질의 발현에<em&gt; 창고 기</em&gt; 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart disease. To study the formation of PAAs, we developed a protocol using whole-mount immunofluorescence coupled with benzyl alcohol/benzyl benzoate (BABB) tissue clearing, and confocal microscopy. This allows for the visualization of the pharyngeal arch endothelium at a fine cellular resolution as well as the 3D connectivity of the vasculature. Using software, we have established a protocol to quantify the number of endothelial cells (ECs) in PAAs, as well as the number of ECs within the vascular plexus surrounding the PAAs within pharyngeal arches 3, 4, and 6. When applied to the whole embryo, this methodology provides a comprehensive visualization and quantitative analysis of embryonic vasculature.

Here, we describe a protocol to visualize and analyze the pharyngeal arch arteries 3, 4, and 6 of mouse embryos using whole-mount immunofluorescence, tissue clearing, confocal microscopy, and 3D reconstruction.

전체 마운트 면역 조직 화학 및 3D 재건을 사용하여 인두 아치 동맥의 시각화 및 분석

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...