臨床現場では、極性体を示す各卵母細胞が受精の準備ができていると仮定するのが慣例である。ヒト卵母細胞成熟の生命イメージングは、双極性メタフェーズIIスピンドルが組み立てられる前に極体がよく見えるようになり、タイムリーな精子注射のリスクを生み出すことである。偏光顕微鏡は、ヒト卵母細胞におけるメオティックスピンドルの非侵襲的可視化を可能にし、IFVで安全に利用して、細胞質内精子注入前に卵の成熟度を評価することができる。
ICSIのタイミングを最適化することは、IVFサイクルの予後が悪く、受精に利用できる卵母細胞の数が少ない場合に特に重要です。この臨床手順は、標準的なIVF治療に対するアドオン技術であり、良好な検査実習に従って、経験豊富な人員によって事前に形成されるべきである。ヒト絨毛性ゴナドトロピン注射後35~36時間、二酸化炭素非依存の処理媒体で回収された積雲卵母細胞複合体を回収する。
摂氏37度で二酸化炭素非依存インキュベーターで卵母細胞を10〜15分間平衡化する。卵母細胞を高ヒアルロニダーゼ溶液に露出し、取り扱い培地で希釈する。30秒後、200マイクロリットルのピペットを使用して、積雲コロナ細胞を機械的に除去します。
核および第1極体の有無に応じて、裸卵母細胞の数および発達状態を評価する。胚芽小胞ステージを入れ、メタフェーズIおよびメタフェーズII段階卵母細胞を、鉱物油で覆われた二酸化炭素非依存性培養培地の個々の液滴に入れる。その後、卵母細胞を摂氏37度、5%の二酸化炭素、6%の酸素を湿度で3〜4時間置きます。
胚培養用の培養プレートを調製するために、適切なサイズの培養プレートの個々のウェルに適切な量の事前平衡培養培地を加える。平衡化された鉱物油で液滴を覆い、プレートに一意の識別子を付け、少なくとも20分間二酸化炭素依存性アンキュベーターに入れます。ICSI皿を準備するには、極性体を表示する卵母細胞ごとに5マイクロリットルの事前温め付けハンドリング媒体を追加し、きれいなプラスチック皿に針洗浄のための1つの余分な液滴を加えます。
細胞質内精子注射の前に精子固定のためのPVP溶液の追加の液滴を追加し、事前に温めたミネラルオイルで液滴を重ね合わせ.必ず料理にラベルを付けください。次いで、精子注射皿を二酸化炭素非依存インキュベーターに少なくとも20分間置く。
プレートが平衡している間に、ガラス底培養皿に各極性体を表示する卵母細胞に対して、事前に温めた処理媒体の5マイクロリットルの液滴を加える。すべての液滴を事前に温めたミネラルオイルでオーバーレイします。必ず料理にラベルを付けください。
次いで、プレートを二酸化炭素非依存インキュベーターに少なくとも20分間入れます。プレートが平衡している間、反転した顕微鏡の加熱された段階でスイッチを入れ、滅菌保持針と精子注射針をマイクロインジェクションホルダーに収める。針に焦点を合わせ、適切な目的を選択し、凝縮器が明るいフィールド位置にあることを注意してください。
緑色の干渉フィルタを挿入し、液晶分析スライダを作動位置に設定します。シャッターを約50%に設定し、円偏光板を調整してバックグラウンドノイズを低減します。偏光顕微鏡検査用にコンピュータをセットアップするには、イメージングソフトウェアを起動し、ビデオメニューでビデオ、ビデオソース、polarAIDEを選択します。
次に、ビデオページに移動してライブビデオに切り替え、アイコンを選択してスピンドルとゾナ解析をアクティブにします。各卵母細胞の成熟度を決定するには、すべての卵母細胞を準備されたガラス底皿の個々の液滴に移し、準備された反転顕微鏡の下に覆われた皿を置きます。最初の卵子をフォーカスに持ち込み、検出された卵母細胞複屈折画像をコンピュータで処理し、コンピュータ画面上にリアルタイムで表示します。
持ち込み針と精子注射針を使用して卵母細胞を回し、極体が12時の位置にあり、極体に焦点を当てます。PB付近で一目でスピンドル複屈折がはっきりと見えない場合は、透明帯にわずかに触れ、各軸の周りに卵母細胞をそっと回して、偏光とアレイスピンドル繊維の位置合わせを確認します。すべての紡錘陽性卵子を同定した後、調製されたICSI皿内の個々の液滴に卵母細胞を移し、そして標準的なプロトコルに従って卵母細胞を細胞質の精子注入に供する。
卵母細胞が検出可能なメタフェーズIIスピンドルシグナルを示さない場合は、偏光顕微鏡皿を二酸化炭素非依存インキュベーターに2〜3時間置く。示されているように偏光顕微鏡検査を再形成する前に、注射後、胚盤胞期に達するまで、調製した胚培養プレートに卵母細胞を移す。ヒト卵母細胞のマイクロマニピュレーションの全てが、37度の制御環境で、最適な培養培地pHで確実に行われるように注意してください。
紡錘の画像化は、重要な交期遷移を受けているものから、メタフェーズII段階で逮捕された完全に成熟した卵母細胞の識別を可能にする。発達遅延卵母細胞が体外に押し出す極性体では、転移IIスピンドルシグナルの欠如は必ずしも細胞の乱れを反映するとは限らないが、転移Iから転移II段階への卵母細胞の進行を示す可能性がある。大腸紡錘の存在は卵の発達能力の肯定的なマーカーである。
ICSIを延期すると、発達遅延卵母細胞に成熟プロセスを完了し、注射前にメタフェーズIIスピンドルを組み立てる余分な時間を与えます。このアプローチを用いると、日常的に廃棄される未熟な卵母細胞でさえも臨床的に利用され、妊娠を成功させる。
