This work was supported through an Innovative Engineering for Health award by the Wellcome Trust [WT101957], the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) [NS/A000027/1], and a National Institute for Health Research Biomedical Research Centre UCLH/UCL High Impact Initiative. Jan Deprest is being funded by the Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO; JD as clinical researcher 1.8.012.07). Danail Stoyanov receives funding from the EPSRC (EP/N013220/1, EP/N022750/1), the EU-FP7 project CASCADE (FP7-ICT-2913-601021), and the EU-Horizon2020 project EndoVESPA (H2020-ICT- 2015-688592). Sebastien Ourselin receives funding from the EPSRC (EP/H046410/1, EP/J020990/1, EP/K005278) and the MRC (MR/J01107X/1). Marcel Tella is supported by the EPSRC-funded UCL Centre for Doctoral Training in Medical Imaging (EP/L016478/1).

1.ターゲットの製作<ol><li>サンドブラスト<ol><li> 1.2 mmの厚さの316ステンレス鋼板を準備します。鉛筆や爪を使用して、定規の助けを借りてシートに40ミリメートル×40ミリメートルの正方形を描画します。 </li><li>マニュアル金属カッターを使用して描かれた正方形をカットします。注意！指を見ます。 </li><li>サンプルの角や辺を丸めるために、ファイルを使用します。注意！彼らは非常に鋭いです。注意してください。 </li><li>ステンレス鋼板よりもサイズが若干大きくまっすぐな木製や金属ブロックを準備します。その上にカット紙を置きます。サンドブラスト中にサンプルを曲げないようにするためにこれを行います。 </li><li>内部ブラスト室にアセンブリを配置します。集塵装置を使用し、しっかりと内部ブラスト室を密封することを忘れないでください。それ以外の場合は、砂が処理中に敷き詰めます。目を保護するための安全ゴーグルを着用します。 </li><li>垂直ブラストガンを置き、少なくとも4〜5センチメートル離れて金属の表面から。足のCONTRを適用しますサンドブラスト用のオール。サンプルを変形させることができ、高圧の砂の流れとして、バイスを用いて、（1〜2センチメートル厚）木片にサンプルを置きます。サンドブラスト時には、木片の端または別のバイスを使用してしっかりとサンプルを保持します。 </li><li>両側に刻まキャリブレーションパターンを有することが望ましい場合は、他の側にサンドブラストを繰り返します。 </li></ol></li><li>レーザパターニング<ol><li> 図1に示すように、非対称の円のパターンを設計します。 </li><li> CADソフトウェアまたは別の適切なプログラミング言語を使用して、いずれかの設計の図面交換形式（DXF）ファイルを準備します。 注：便宜上、本論文で述べた設計のためのDXFファイルを生成することができますPythonアプリケーションは、コンパクトなGUIアプリケーション16の一部として提供されます。 </li><li>レーザー切断ソフトウェアにDXFファイルをインポートします。 </li><li>背景エッチングのための次のパラメータを設定します。レーザーパワー：40％、スキャン速度：80センチメートル/ sで、周波数：4,000Hzから、パスの数：1。 </li><li>パターンをエッチングするため、次のパラメータを設定します。レーザーパワー：40％、スキャン速度2.1センチメートル/秒、周波数：4,000Hzから、パスの数：1。 </li><li>作業プラットフォームにサンプルを入れて、ソフトウェアを使用して切断パターンを揃えます。 </li><li>レーザーカットを実行した後、アルコールに浸漬することにより、サンプルをきれいに。彼らは通常、望ましくない残留物を残すように、任意のワイプを使用しないでください。 </li></ol></li><li>殺菌<ol><li>滅菌パッケージ内で滅菌サンプルをラップし、滅菌器（オートクレーブ）に挿入します。 </li><li>オートクレーブに水（ない蒸留水）を追加し、ターゲットを滅菌するために、ユーザーのガイド/製造元の推奨に従ってください。 </li></ol></li></ol> 2.周術期のキャリブレーション<ol><li>較正ソフトウェア<ol><li> GitHubの16に設けられた「endocal「内視鏡キャリブレーションソフトウェアパッケージをインストールします（その中のREADMEファイルの指示に従ってください）。 注：このソフトウェアは簡単に使用できる便利なアプリケーションでOpenCVのカメラキャリブレーションモジュール17をラップします。提供されたアプリケーションは、2つのモードで動作します。オンラインとオフライン。オンラインモードでは、互換性のあるフレームグラバーハードウェアから直接ビデオストリームを取得します。オフラインモードでは、負荷内視鏡画像のためのいずれかの動画ファイルや画像ファイルとして保存したビデオフレームの数のフォルダから可能になります。サポートされているハードウェアおよびこの2つのモードを使用する方法の詳細な手順については、READMEを参照してください。 </li></ol></li><li>内視鏡映像取得 注：（上記のように）以下の手順は、オンライン校正のためですが、彼らはまた、オフラインでキャリブレーションにも適用可能です。 <ol><li>このような小壺のように、無菌の流体容器にキャリブレーションターゲットを置きます。 </li><li>目標液または類似の滅菌物質で容器を満たします。 注：例えば、fetoscopic proceでデュレス、目標液は羊水です。羊水の光学特性は生理食塩水18、19と同様であるため、滅菌生理食塩水は、胎児鏡を較正するために使用することができます。 </li><li>所望のように、内視鏡のズームやシャープネスを調整します。 </li><li>流体中に内視鏡を浸し、内視鏡は、後に使用される解剖学からの距離に類似したキャリブレーションターゲットからの距離でそれを保持します。 </li><li>キャリブレーションアプリケーションを起動し、カメラの取得を開始します。 </li><li>カメラのビュー内の全キャリブレーションパターンを維持しながら、異なるビューのためにわずかに内視鏡の先端を移動します。最適なパフォーマンスを得るために、内視鏡の円形ビュー内のキャリブレーションパターンの周りに楕円形の凡例を保ちます。 注： 図3に見られるように、キャリブレーションのために使用できるビデオフレームは、仮想パターンのオーバーレイで示されています。 </li><li>アックイキャリブレーションのために必要な内視鏡カメラ・ビューの少なくとも最小数（endocalウィンドウに示されるように）再。 注：endocalの現在のバージョンは、キャリブレーションのために少なくとも10の内視鏡カメラビュー、キャリブレーション誤差が最小で、安定したパターン20に従うように見えるビューのヒューリスティックに選択された番号が必要です。 </li><li> endocalウィンドウに示されているように、これまでに取得された画像を使用してキャリブレーション処理を開始するために、キャリブレーションキーを押します。 </li></ol></li><li>キャリブレーション・パラメータを保存し、使用して<ol><li>プレスYAML中の得られた較正パラメータを保存するために指示されたキャリブレーションキー（「YAMLはマークアップ言語ではありません」）21を提出します 。 </li><li> OpenCVのカメラキャリブレーションモジュール17で説明したようにグループカメラ行列と歪み係数に較正パラメータ。 注：キャリブレーションを実行した後、キャリブレーションアプリケーションは自動的に元の内視鏡画像の右に歪み補正された画像を表示します。 </li><li>純粋な可視化のための、または11をモザイクリアルタイム胎盤のためのfetoscopic手順の間に、歪み補正後のビデオフィードを使用してください。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, Z., Matsushita, Y., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camera+calibration+with+lens+distortion+from+low-rank+textures.">Camera calibration with lens distortion from low-rank textures.</a> , 2321-2328 (2011).</li><li>Devernay, F., Faugeras, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+calibration+and+removal+of+distortion+from+scenes+of+structured+environments.">Automatic calibration and removal of distortion from scenes of structured environments.</a> , 62-72 (1995).</li><li>Duane, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close-range+camera+calibration.">Close-range camera calibration.</a> Photogramm. Eng. 37 (8), 855-866 (1971).</li><li>Mallon, J., Whelan, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+pattern?+biasing+aspects+of+planar+calibration+patterns+and+detection+methods.">Which pattern? biasing aspects of planar calibration patterns and detection methods.</a> Pattern recognition letters. 28 (8), 921-930 (2007).</li><li>Balletti, C., Guerra, F., Tsioukas, V., Vernier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+Action+Cameras+for+Photogrammetric+Purposes.">Calibration of Action Cameras for Photogrammetric Purposes.</a> Sensors. 14 (9), 17471-17490 (2014).</li><li>Heikkila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+camera+calibration+using+circular+control+points.">Geometric camera calibration using circular control points.</a> IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 22 (10), 1066-1077 (2000).</li><li>Deprest, J. 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SPIE 9786, Medical Imaging 2016: Image-Guided Procedures, Robotic Interventions, and Modeling. 97861R. , (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+mapping+of+untracked+free-hand+endoscopic+views+to+an+ultrasound+image-constructed+3D+placenta+model.">Image mapping of untracked free-hand endoscopic views to an ultrasound image-constructed 3D placenta model.</a> The International Journal of Medical Robotics and Computer Assisted Surgery. 11 (2), 223-234 (2015).</li><li>Liao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+image+mapping+of+endoscopic+image+mosaics+with+three-dimensional+ultrasound+image+for+intrauterine+fetal+surgery.">Fast image mapping of endoscopic image mosaics with three-dimensional ultrasound image for intrauterine fetal surgery.</a> Minimally invasive therapy &amp; allied technologies. 18 (6), 332-340 (2009).</li><li>Chadebecq, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Dry+Calibration+With+Medium+Adaptation+For+Fluid-Immersed+Endoscopy.">Practical Dry Calibration With Medium Adaptation For Fluid-Immersed Endoscopy.</a> , (2015).</li><li>Wengert, C., Reeff, M., Cattin, P. C., Sz&#233;kely, G., Handels, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bildverarbeitung f&#252;r die Medizin 2006: Algorithmen Systeme Anwendungen. Proceedings des Workshops vom 19. - 21. M&#228;rz 2006 in Hamburg. , 419-423 (2006).</li><li>. Compact GUI application for optical distortion calibration of endoscopes Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/gift-surg/endocal">https://github.com/gift-surg/endocal</a> (2016)</li><li>Reeff, M., Gerhard, F., Cattin, P. C., Sz&#233;kely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mosaicing of endoscopic placenta images. , (2011).</li><li>Steigman, S. A., Kunisaki, S. M., Wilkins-Haug, L., Takoudes, T. C., Fauza, D. 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The authors have nothing to disclose.

生の金属面が目立つことは不可能円が検出されるようにすること、内視鏡の光を反射するので、サンドブラストは、製造プロセスにおける重要なステップです。それも肉眼で円を区別することは困難である（ 図5参照）。示さターゲットの表面がすでにレーザーでエッチングしたことに注意してください。しかしながら、これは、光の反射を減少させません。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig5.jpg" /> 図5：なしサンドブラストでのキャリブレーションターゲットが適用されます。左側の内視鏡ビューから見られるように、材料表面上の内視鏡の光からのグレアが（ちょうど大きな反射の南東に円がある）でも、円を区別する肉眼のためにそれを困難にしています。このターゲット（ すなわち、「バックグラウンド」）の表面は既にエッチングが、これではありませんされたことに注意してください<html>サンドブラストの不在に役立ちます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> パターンエッチングの前に、試料全体の表面をエッチングすることも重要です。これは、サンドブラスト処理表面は、多くの鏡面反射を持っているので、ブロブ検出を妨害、（ 図6を参照）が必要です。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig6.jpg" /> 図6：なしエッチングで表面をサンドブラスト。生の金属表面ほど顕著ではないが、（黄色の矢印で強調されているそのうちのいくつか）が比較的小さい鏡面反射がまだ続くからブロブ検出を防止するのに十分であるので、何のキャリブレーションは、このターゲットを用いて実行することはできません。ARGET = &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 異なる速度でレーザーを適用すると、別の背景色を与えます。背景色は、円と背景とのコントラストが重要な役割を果たしています。したがって、最適な背景色を決定するために重要です。この目的のために、丸付きプレートが作成された別の背景（ 図7参照 ）のセットに対してエッチング。背景はOpenCVのカメラキャリブレーションモジュール17で使用されているOpenCVの23の特徴検出モジュールを用いて試験しました。それは、医療デバイスのための診療所で使用される最も一般的かつ信頼性の高い物質であるように、この作業では、ターゲットは、ステンレス鋼で作られました。この材料は、高価な堅牢、かつ殺菌することは容易ではない、自由に利用可能です。他の材料は、潜在的に、アルミニウム又はヨウ素添加金属として、較正ターゲットを使用することができるが、これはSCOPあります今後の作業の電子。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig7.jpg" /> 図7：レーザーでエッチング異なる背景色のパレットを搭載ステンレス鋼板。実用的な実験は、色ブロブ対背景コントラスト23の観点で最適な結果を与えるバックグラウンドを決定するためにOpenCVの特徴検出モジュールと組み合わせて実施されました。左側の内視鏡ビューは、プレートを示しています。適度な背景色（ すなわち、最も暗いと最も軽いものことを他のもの）は、このパレットでは、より良いブロブ検出をもたらします。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> この作業の利点の1つは、作製対象を使用してキャリブレーションを行うこと2-3分かかることです。努力のほとんどが行きますESは手動でキャリブレーションパターンのまともなビューを取得するために内視鏡を安定化します。特注の内視鏡保持具を使用して順番に大幅較正時間を短縮する可能性があり、手動安定化の必要性を排除することができます。 <img alt="ビデオ1" src="/files/ftp_upload/55298/55298video1.jpg" /> ビデオ1：ビデオは、光学歪み校正がendocalソフトウェアと共に開発較正ターゲットを用いて行うことができる方法を示します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/fetoscope-calibration-480.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 （ダウンロードするには、右クリックします。）</a> Wengert らの仕事に比べて我々の仕事の利点。 図15は、OpenCVのカメラキャリブレーションモジュール17は、任意の変更またはカスタムパラメを必要とせずに、キャリブレーションのためのものであるとして使用され得ることですterization。 OpenCVのは、十分に確立されたと手入れの行き届いたソフトウェアパッケージであり、それは書き込み、カスタムソフトウェアを維持する必要がなくなり使用して、コンピュータビジョンのコミュニティで非常に人気がありますので。読者の便宜のために、コンパクトなGUIアプリケーションは、読者が簡単にインストールして、新しいキャリブレーションターゲットをテストするために使用できる16を 、提供されています。 Wengert らに比べて我々の方法の一つの欠点。 15は 、すべてのブロブの検出を必要としないように、その方法は、パターンの閉塞に対してよりロバストであるということです。 最初は、チェッカーボードパターンとキャリブレーションターゲットがこの仕事のために作製しました。ただし、キャリブレーションターゲットのこのタイプは、市松模様の正方形の隅を検出することの難しさに起因する実験に不適切であることが判明しました。コーナー検出は、ヒストグラムベースの画像2値化（OpenCVのソースコード24を参照）に依存します。このインプ図6に示すものと同様に、部分的に起因する鏡面反射に、私たちの市松模様で保証されませんでした明るさと暗さの正方形、間に明確な色のコントラストの必要性があります。このような鏡面反射はあっても、バックグラウンドのエッチング後に存在しています。しかしながら、円の検出は、この欠点に敏感であると思われます。 現在の設定では、キャリブレーションターゲットの唯一の垂直ビューは成功したブロブの検出を可能にします。これは、斜めの角度でブロブ検出を妨げるターゲット表面からの鏡面反射によるものです。我々は、潜在的に行わ校正20の品質を向上させることができ角の広い範囲でのビューの取得を可能にするために、標的の向上に努めています。 リアルタイムで胎盤は、以前に11を提案したパイプライン、トランスの計算をモザイク画像対をマッピング形成が検出成功と機能のグループ化に依存しています。光学的歪みは、他の一方で、剛性のジオメトリを持つフィーチャのグループが画像間で異なる出現させます。その結果、この差は得られる画像のモザイクのドリフトを引き起こす計算変換の不正確さにつながります。最も顕著な光学歪みがエッジに向かって存在しているので、内視鏡画像は、現在彼らの最も内側の領域に切り取られます。光学的歪みのための良好な補正は、潜在的にモザイク処理に各画像の大部分の組み込みを可能にするであろう。この方法の利点は、2つある。まず、潜在的に、画像変換の計算を改善する、各画像内の検出された特徴の数を増加させます。第二に、それは短時間で再構成する全体目標の解剖学的表面を可能にするであろう。

<html>カメラキャリブレーションは集中3、2、1年にわたって研究されているコンピュータビジョンの分野ではよく知られている問題です。カメラキャリブレーション手順の重要なステップは、サブピクセル精度でカメラ画像からの既知のジオメトリとの点の格子を抽出することにより、歪モデルのパラメータ、ならびに固有のカメラパラメータを推定することです。黒と白の正方形を特徴チェッカーボードパターンで較正ターゲットは、一般的にこの目的のために使用されます。円形のブロブは、代替パターン4、5、6を提供しています。 近年では、このような胎児上のツイン・ツー・ツイン輸血症候群（TTTS）の治療として、胎児手術の手順については、手術ナビゲーション技術の開発への関心が高まってきました&gt; 7、8、9、10。胎児鏡の視野（ すなわち、胎児の外科手術に使用される内視鏡）は、非常に限られているように、外部の追跡を使用することなく、胎盤脈管構造をマッピングするための方法は、TTTS手術11、12、13を補助するために提案されています。 fetoscopic画像内の光学的歪みは、視覚情報抽出11に依存しているこれらの計算モザイク法に悪影響を与えます。したがって、光学的歪み補償が介入中にリアルタイムで行うことができるように、周囲に、作動fetoscopesを較正するためのコスト効率と高速ツールの満たされていない必要性が存在します。 胎児鏡は介入中羊水中に浸漬されているという事実は、Aとの屈折率差にIRおよび羊水は胎児手術の手順に適さない古典的で空気カメラキャリブレーション方法をレンダリングします。気中のカメラパラメータから流体に浸漬カメラパラメータを推定することは困難な作業であり、流体に浸漬キャリブレーションターゲット14の少なくとも1つの画像を必要とします。また、周術期には、流体に浸漬fetoscopicカメラキャリブレーションは、手術室で許可された材料上の殺菌の要件と制限のため、現在は非現実的です。これらの理由に、光学歪みを内視鏡を較正することは、典型的に現在の臨床ワークフローの一部ではありません。この原稿での作業は、非対称円のパターンを特色に滅菌可能で実用的な光学歪みのキャリブレーションターゲットを設計し、製造することにより、このカメラキャリブレーションギャップを埋めるための試みです。以前は、Wengert ら。較正ターゲットとして酸化アルミニウム板を搭載カスタム校正装置を作製しました。彼らのメタODは、しかし、唯一の彼らは15を開発したカスタムキャリブレーション・アルゴリズムと連携して動作します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2mm Metal sheet 316 Grade, 40 mm by 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water container at least 50mm by 50mm by 30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A sterilisation package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seline water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual metal cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A file to round up the corners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A wooden or metal block 50 mm by 50 mm at least 10 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A vise (desirable but not required)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand Blasting machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GUI application to create .dxf file with the pattern (https://github.com/gift-surg/endocal)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An endoscope calibration software from GitHub (http://docs.opencv.org/2.4/doc/tutorials/calib3d/camera_calibration/camera_calibration.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCV camera calibration module (https://github.com/opencv/opencv)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medical-grade sterilizable target for fluid-immersed fetoscope optical distortion calibration

We have developed a calibration target for use with fluid-immersed endoscopes within the context of the GIFT-Surg (Guided Instrumentation for Fetal Therapy and Surgery) project. One of the aims of this project is to engineer novel, real-time image processing methods for intra-operative use in the treatment of congenital birth defects, such as spina bifida and the twin-to-twin transfusion syndrome. The developed target allows for the sterility-preserving optical distortion calibration of endoscopes within a few minutes. Good optical distortion calibration and compensation are important for mitigating undesirable effects like radial distortions, which not only hamper accurate imaging using existing endoscopic technology during fetal surgery, but also make acquired images less suitable for potentially very useful image computing applications, like real-time mosaicing. In this paper proposes a novel fabrication method to create an affordable, sterilizable calibration target suitable for use in a clinical setup. This method involves etching a calibration pattern by laser cutting a sandblasted stainless steel sheet. This target was validated using the camera calibration module provided by OpenCV, a state-of-the-art software library popular in the computer vision community.

我々は、その設計図1に示されているサンドブラストステンレス鋼の金属シート上に非対称の円のパターンをエッチングすることにより滅菌較正ターゲットを作成しました。一緒に胎児鏡とアクションでこの較正ターゲットを示す例示的なセットアップは、図2に示されています。レーザーエッチングソフトウェアにこの設計を養うために、カスタムアプリケーションは、Pythonプログラミング言語16で実装されました。設計パターンを作成する反復金属シートの平行線をエッチングすることを含みます。パターンが最終的に一貫性のある色を持つためには、これらの線間の距離は、レーザビームの幅未満でなければならない（ 図1の挿入図を参照）の値がヴィオリーノ（Laservall）レーザーカッターのために45μmである-これ。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig1.jpg" /> <st<html>栄&gt;図1：非対称円の3行11グリッドを搭載し刻まれたパターンのデザイン。挿入図：ズームアップ非対称円のグリッドの眺め。線間の距離は、（レーザビーム幅に等しい）が45μmであり、各円は、1mmの直径を有します。他のサイズも同様にグリッドを使用することができるが、これは、ビューの胎児鏡の分野に対して最適であることが見出されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig2.jpg" /> 図2：使用中のキャリブレーションターゲットと模範セットアップ。水浸胎児鏡の先端は右のキャリブレーションターゲットに向けられています。左側にはスケール情報を提供するために、英国のペニーです。&quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 製造されたキャリブレーションターゲットが位置次に予め定義された非対称の円形グリッドにソートされるOpenCVの17と内視鏡のビデオストリームにおける円形パターンの検出を可能にする（ 図3参照）。既知のグリッド幾何形状に関連して、この情報を使用して、内部カメラパラメータを推定することができます。これらは、カメラ行列と歪み係数が含まれます。カメラ行列は、焦点距離と2次元画像平面のx軸とy軸に沿って光学中心から成ります。歪み係数はブラウンコンラディモデル3に基づいています。この作業のために、唯一の放射状の歪みパラメータを推定したことに注意してください。実用的な例と理論の簡単な説明については、OpenCVのカメラキャリブレーションモジュールのWebページを参照してください&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 17とMATLABカメラキャリブレーションツールボックス22。カメラキャリブレーション手順の詳細については、張さんの作品20でご利用いただけます。 endocalソフトウェアリポジトリは、製造されたキャリブレーションターゲット16の10、内視鏡のビューのサンプルデータセットを備えています。このデータセットを使用して、0.28ピクセル（最小：0.16、最大0.45）の平均再投影誤差のキャリブレーションを得ました。これはWengert らによって報告された0.25ピクセルに匹敵します。自分のカスタムキャリブレーション・アルゴリズム15を使用して。 18モザイク胎盤のために使用される内視鏡カメラを較正するための15の方法を使用する場合、同じ研究グループは、しかしながら、より最近の論文で0.6画素の再投影誤差を報告しました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig3.jpg" /> <st栄&gt;図3：キャリブレーションパターンのリアルタイム検出。検出されたキャリブレーションパターンを搭載し、キャリブレーションアプリケーション16からのスクリーンショットは、OpenCVの17から仮想現実可視化を使用して、ライブビデオストリームにオーバーレイ。キャリブレーションパターンの検出された各列が異なる色で強調されていることに注意してください。検出された円は、既知の幾何学的形状に関連して、カメラパラメータを計算するために使用されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 推定されたカメラパラメータは、光学歪補正のために使用されます。光学歪みが線が曲線として表示されるよう胎児鏡を使用して見た図4は 、長方形のチェス盤のパターンを示しています。行がdistortiで正常に見えることに注意してください上の補正された画像。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig4.jpg" /> 図4：光学歪み補正。歪み補正後の画像と市松模様（左）（右）から胎児鏡の記録からのライブ映像をフィーチャーしたキャリブレーションアプリケーション16からのスクリーンショット。 3つの例示的な線は軌道が直線的である別のコーナーからそれぞれ、両方の画像に描かれています。光学的歪みに、これらの行は、元の胎児鏡画像の曲線として表示されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Medical-grade Sterilizable Target for Fluid-immersed Fetoscope Optical Distortion Calibration

This article describes the design and development of a sterilizable custom camera optical distortion calibration target for the peri-operative, fluid-immersed calibration of endoscopes during endoscopic interventions.

流体浸漬胎児鏡光学歪み校正のための医療用滅菌可能なターゲット

We have developed a calibration target for use with fluid-immersed endoscopes within the context of the GIFT-Surg (Guided Instrumentation for Fetal ...

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Research

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Bioengineering

7.6K ビュー.  University College London. This article describes the design and development of a sterilizable custom camera optical distortion calibration target for the peri-operative, fluid-immersed calibration of endoscopes during endoscopic interventions.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

生物工学

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

細胞融合の検出のためのCre - LOX Pの組換えのアプローチインビボでの</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

ネイティブ、繊維状の長い間隔と分節ロング間隔コラーゲンのin vitro合成

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene for applications as a stent material. Graphene was grown on copper substrates via chemical vapor deposition and then transferred onto nitinol substrates. In order to understand how the graphene coating could change biological response, cell viability of rat aortic endothelial cells and rat aortic smooth muscle cells was investigated. Moreover, the effect of graphene-coatings on cell adhesion and morphology was examined with fluorescent confocal microscopy. Cells were stained for actin and nuclei, and there were noticeable differences between pristine nitinol samples compared to graphene-coated samples. Total actin expression from rat aortic smooth muscle cells was found using western blot. Protein adsorption characteristics, an indicator for potential thrombogenicity, were determined for serum albumin and fibrinogen with gel electrophoresis. Moreover, the transfer of charge from fibrinogen to substrate was deduced using Raman spectroscopy. It was found that graphene coating on nitinol substrates met the functional requirements for a stent material and improved the biological response compared to uncoated nitinol. Thus, graphene-coated nitinol is a viable candidate for a stent material.

Graphene offers potential as a coating material for biomedical implants. In this study we demonstrate a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene and determine how graphene may influence implant response.

メディカルインプラントのグラフェンコーティング

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

医療画像処理アプリケーションのための超音波の広帯域光検出器

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

生細胞共役ポリマーにより電気的活動の光制御

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

流体浸漬胎児鏡光学歪み校正のための医療用滅菌可能なターゲット

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