This work was supported through an Innovative Engineering for Health award by the Wellcome Trust [WT101957], the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) [NS/A000027/1], and a National Institute for Health Research Biomedical Research Centre UCLH/UCL High Impact Initiative. Jan Deprest is being funded by the Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO; JD as clinical researcher 1.8.012.07). Danail Stoyanov receives funding from the EPSRC (EP/N013220/1, EP/N022750/1), the EU-FP7 project CASCADE (FP7-ICT-2913-601021), and the EU-Horizon2020 project EndoVESPA (H2020-ICT- 2015-688592). Sebastien Ourselin receives funding from the EPSRC (EP/H046410/1, EP/J020990/1, EP/K005278) and the MRC (MR/J01107X/1). Marcel Tella is supported by the EPSRC-funded UCL Centre for Doctoral Training in Medical Imaging (EP/L016478/1).

1. Realizzazione di destinazione <ol><li> Sabbiatura <ol><li> Preparare una lamiera di acciaio inossidabile 316 con uno spessore di 1,2 mm. Usando una matita o un chiodo, disegnare un quadrato mm 40 mm x 40 sul foglio con l&#39;aiuto di un righello. </li><li> Tagliare il quadrato disegnato con un cutter in metallo manuale. ATTENZIONE! Guardare le dita. </li><li> Utilizzare un file per arrotondare gli angoli ei lati del campione. ATTENZIONE! Sono molto taglienti; stai attento. </li><li> Preparare una scala blocco di legno o di metallo di dimensioni leggermente maggiori rispetto alla lamiera di acciaio inox. Posizionare il foglio singolo su di esso; fare questo al fine di evitare la flessione del campione durante la sabbiatura. </li><li> Posizionare il gruppo nella camera di scoppio interna. Ricordatevi di usare un collettore di polveri e per sigillare ermeticamente la camera di scoppio interno; altrimenti, la sabbia si diffonderà in tutto durante il processo. Indossare occhiali di sicurezza per proteggere gli occhi. </li><li> Posizionare una pistola a getto perpendicolare e almeno 4-5 cm dalla superficie metallica. Applicare il contr piedeolo per sabbiatura. Mettere il campione sul pezzo di legno (1-2 cm di spessore) con una morsa, come il flusso di sabbia ad alta pressione può deformare il campione. Durante sabbiatura, tenere saldamente il campione dal bordo del pezzo di legno o utilizzando un altro vizio. </li><li> Ripetere la sabbiatura sul lato opposto se è desiderabile avere un modello di calibrazione inciso su entrambi i lati. </li></ol></li><li> patterning laser <ol><li> Progettare un modello di cerchi asimmetrici, come mostrato in Figura 1. </li><li> Preparare un file di formato di scambio di disegno (DXF) del disegno o utilizzando il software CAD o in un altro linguaggio di programmazione adatto. NOTA: Per comodità, un&#39;applicazione Python in grado di generare file DXF per la progettazione di cui al presente documento viene fornito come parte della domanda GUI compatta 16. </li><li> Importare i file DXF nel software di taglio laser. </li><li> Impostare i seguenti parametri per sfondo incisione. Potenza del laser: 40%, velocità di scansione:80 cm / s, Frequenza: 4.000 Hz, numero di passaggi: 1. </li><li> Impostare i seguenti parametri per l&#39;incisione del modello. Laser di potenza: 40%, Velocità di scansione: 2,1 cm / s, Frequenza: 4.000 Hz, numero di passaggi: 1. </li><li> Mettere il campione sulla piattaforma di lavoro e allineare il modello di taglio utilizzando il software. </li><li> Dopo il laser esegue il taglio, pulire il campione mediante immersione in alcool. Non utilizzare salviette, come fanno di solito lasciano residui indesiderabili. </li></ol></li><li> Sterilizzazione <ol><li> Avvolgere il campione sterilizzato in un pacchetto sterilizzazione e inserirla nell&#39;unità di sterilizzazione (autoclave). </li><li> Aggiungere acqua (l&#39;acqua non distillata) per l&#39;autoclave e seguire la guida utente / raccomandazioni del costruttore per sterilizzare il bersaglio. </li></ol></li></ol> Calibrazione 2. peri-operatorio <ol><li> software di calibrazione <ol><li> Installare il &quot;endocal&quot; pacchetto software di calibrazione endoscopio fornito su GitHub 16(Seguire le istruzioni del file README in esso). NOTA: Questo software avvolge il modulo di calibrazione fotocamera OpenCV 17 in un&#39;applicazione convenienza facile da usare. La domanda prevista funziona in due modalità: online e offline. La modalità online acquisisce il flusso video direttamente dall&#39;hardware frame-grabber compatibili. La modalità offline consente di ottenere immagini di carico endoscopio sia da un file video o una cartella con un numero di fotogrammi video salvati come file immagine. Vedere README per l&#39;hardware supportato e le istruzioni dettagliate su come utilizzare questi due modi. </li></ol></li><li> acquisizione di video endoscopica NOTA: Le seguenti istruzioni sono per la calibrazione on-line (come descritto sopra), ma sono applicabili anche alla calibrazione in linea. <ol><li> Posizionare il foglio di calibrazione in un contenitore fluido sterile, come un barattolo. </li><li> Riempire il contenitore con il liquido bersaglio o una sostanza simile sterili. NOTA: per esempio, nel proce fetoscopicdure, il fluido obiettivo è liquido amniotico. Poiché le proprietà ottiche di liquido amniotico sono simili all&#39;acqua salina 18, 19, acqua salina sterile può essere utilizzato per la calibrazione del fetoscope. </li><li> Regolare lo zoom e la nitidezza dell&#39;endoscopio, se lo desideri. </li><li> Immergere l&#39;endoscopio nel fluido e tenerlo ad una distanza dalla calibrazione simile alla distanza dal anatomica che l&#39;endoscopio sarà successivamente utilizzato a. </li><li> Avviare l&#39;applicazione di calibrazione e avviare l&#39;acquisizione della fotocamera. </li><li> Spostare la punta dell&#39;endoscopio leggermente per diverse visualizzazioni mantenendo l&#39;intero modello di calibrazione in vista della telecamera. Per ottenere prestazioni ottimali, tenere la leggenda ellittica intorno al motivo di calibrazione all&#39;interno della vista circolare dell&#39;endoscopio. NOTA: Il video frame che sono utilizzabili per la calibrazione sono indicate da un modello di sovrapposizione virtuale, come si vede in figura 3. </li><li> acquire almeno il numero minimo di visualizzazioni endoscopiche fotocamera necessarie per la calibrazione (come indicato nella finestra endocal). NOTA: La versione corrente di endocal richiede almeno 10 visualizzazioni delle telecamere endoscopiche per la calibrazione, un certo numero di punti di vista euristico selezionato dove l&#39;errore di calibrazione sembra essere minima e seguire uno schema stabile 20. </li><li> Premere il tasto di calibrazione, come indicato sulla finestra endocal, per avviare il processo di calibrazione utilizzando le immagini acquisite finora. </li></ol></li><li> Salvataggio e utilizzando i parametri di calibrazione <ol><li> Premere il tasto di taratura indicata per salvare i parametri di calibrazione con un conseguente YAML ( &quot;YAML Non è Markup Language&quot;) file 21. </li><li> Gruppo i parametri di calibrazione in i coefficienti di matrice fotocamera e distorsione, come spiegato nel modulo di calibrazione della fotocamera OpenCV 17. NOTA: Dopo aver eseguito la calibrazione, la calibrazioneapplicazione visualizza automaticamente l&#39;immagine di distorsione corretta alla destra dell&#39;immagine dell&#39;endoscopio originale. </li><li> Utilizzare il feed video distorsione corretta nel corso di una procedura di fetoscopic per la visualizzazione puro o in tempo reale placentare mosaicatura 11. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

La sabbiatura è un passo importante nel processo di fabbricazione in quanto la superficie del metallo grezzo riflette la luce visibile dell&#39;endoscopio, rendendo impossibile per i cerchi da rilevare. È difficile distinguere i cerchi anche ad occhio nudo (vedi Figura 5). Si noti che la superficie del bersaglio mostrata era già incisa con un laser. Tuttavia, ciò non diminuisce la riflessione della luce. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig5.jpg" /> Figura 5: calibrazione senza sabbiatura applicata. Come si vede dalla vista dell&#39;endoscopio sulla sinistra, il riflesso dalla luce dell&#39;endoscopio sulla superficie del materiale rende difficile anche per occhio nudo per distinguere i cerchi (c&#39;è un cerchio appena a est del grande riflessione). Si noti che la superficie di tale obiettivo (cioè, il &quot;bianco&quot;) è stato già attaccato, ma questo non è<html> utile in assenza di sabbiatura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Prima del profilo di mordenzatura, è anche importante per incidere la superficie dell&#39;intero campione. Ciò è necessario perché la superficie sabbiata ha molte riflessioni speculari (vedere Figura 6), che interferiscono con riconoscimento di regioni. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig6.jpg" /> Figura 6: superficie sabbiata senza incisione. Anche se non è di primo piano come la superficie del metallo grezzo, le relativamente piccole riflessioni speculari (alcuni dei quali sono evidenziati con frecce gialle) sono ancora sufficienti per impedire il rilevamento blob da riuscire, in modo che nessuno di taratura possono essere eseguite con questo obiettivo.Arget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Applicando il laser a diverse velocità dà diversi colori di sfondo. Il colore di sfondo gioca un ruolo significativo nel contrasto tra i cerchi e lo sfondo. Quindi, è importante per determinare il colore di sfondo ottimale. A tal fine, un piatto con cerchi inciso contro un insieme di diverse provenienze stato creato (vedi Figura 7). Gli sfondi sono stati testati utilizzando il modulo di rilevamento caratteristica di OpenCV 23, che viene utilizzato nel modulo di calibrazione fotocamera OpenCV 17. In questo lavoro, l&#39;obiettivo è stato fatto di acciaio inossidabile, in quanto è il materiale più comune e affidabile utilizzato in cliniche per dispositivi medici. Questo materiale è liberamente disponibile, non costoso, robusto e facile da sterilizzare. Altri materiali possono potenzialmente essere utilizzati per la calibrazione, come ad esempio alluminio o iodato metalli, ma questo è il scope del lavoro futuro. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig7.jpg" /> Figura 7: Piastra in acciaio inox con una tavolozza di diversi colori di sfondo incise con il laser. Esperimenti pratici sono stati condotti in combinazione con il modulo di rilevamento funzione OpenCV per determinare quale colore di sfondo fornisce il risultato ottimale in termini di blob-to-contrasto di fondo 23. La vista endoscopio a sinistra mostra la piastra. I colori di sfondo moderati (cioè, quelle altre che le scuri e più chiari quelli) in questa palette resa migliore riconoscimento di regioni. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Uno dei vantaggi di questo lavoro è che l&#39;esecuzione di una calibrazione usando la porta fabbricato prende 2-3 min. La maggior parte dello sforzo goES a stabilizzare manualmente l&#39;endoscopio per ottenere una vista decente del motivo di calibrazione. Usando un supporto endoscopio fuoriserie potrebbe eliminare la necessità di stabilizzazione manuale, che a sua volta potrebbe ridurre significativamente i tempi di calibrazione. <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55298/55298video1.jpg" /> Video 1: Video che mostra come ottica di calibrazione distorsione può essere eseguita utilizzando il target di calibrazione sviluppato in collaborazione con la software endocal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/fetoscope-calibration-480.mov" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).</a> Un vantaggio del nostro lavoro rispetto al lavoro di Wengert et al. 15 è che il modulo di calibrazione fotocamera OpenCV 17 può essere utilizzato come è per la calibrazione, senza richiedere alcuna modifica o personalizzata paramezazione. Perché OpenCV è un pacchetto software ben consolidata e ben curato ed è molto popolare nella comunità visione artificiale, utilizzando elimina la necessità per la scrittura e il mantenimento di software personalizzato. Per comodità del lettore, un&#39;applicazione GUI compatta è previsto 16, che il lettore può facilmente installare e utilizzare per testare nuovi target di calibrazione. Uno svantaggio del nostro metodo rispetto a Wengert et al. 15 è che il loro metodo è più robusto per occlusioni del modello, in quanto non richiede il rilevamento di tutti i blob. Inizialmente, un target di calibrazione con un motivo a scacchi è stato fabbricato per questo lavoro. Tuttavia, questo tipo di calibrazione è rivelata inadatta in esperimenti a causa della difficoltà di rilevare gli angoli dei quadrati scacchiera. Rilevamento d&#39;angolo si basa su binarizzazione immagine istogramma-based (vedere il codice sorgente OpenCV 24). Questo impsi trova la necessità di un chiaro contrasto cromatico tra i chiari e scuri piazze, che non poteva essere garantita con il nostro schema a scacchiera, in parte a causa dei riflessi speculari, come quelli illustrati nella Figura 6. Tali riflessioni speculari sono presenti anche dopo sfondo incisione; tuttavia, la rilevazione dei cerchi sembra essere meno sensibili a questo inconveniente. Nella configurazione attuale, solo una vista perpendicolari del profilo di calibrazione consentono il rilevamento blob di successo. Ciò è dovuto alle riflessioni speculari dalla superficie del bersaglio ostacolando riconoscimento di regioni ad angoli obliqui. Siamo lavorando per migliorare ulteriormente il bersaglio in modo da consentire l&#39;acquisizione di vista ad una più ampia gamma di angoli, che potrebbero migliorare la qualità di calibrature effettuate 20. In tempo reale placentare mosaicing conduttura precedentemente proposto 11, il calcolo del transformazione che mappa coppie di immagini si basa sul rilevamento e il raggruppamento delle caratteristiche di successo. distorsioni ottiche, invece, provocano un gruppo di caratteristiche con una geometria rigida appaia diversa attraverso immagini. Di conseguenza, questa differenza comporta imprecisioni nelle trasformazioni calcolati, che provocano derive dei mosaici immagine risultanti. Perché le distorsioni ottiche più importanti sono presenti verso i bordi, immagini endoscopiche sono attualmente tagliate per le loro regioni più interne. Una buona correzione per le distorsioni ottiche potrebbe potenzialmente consentire l&#39;incorporazione di una parte più grande di ogni immagine nel processo di mosaicatura. Il vantaggio di questo metodo è duplice. Innanzitutto, aumenterebbe il numero di caratteristiche rilevate in ogni immagine, migliorando potenzialmente il calcolo delle trasformazioni di immagine. In secondo luogo, permetterebbe l&#39;intera superficie anatomica bersaglio essere ricostruito in un tempo più breve.

<html> Calibrazione obiettivo è un problema ben noto nel campo visivo computer che è stato studiato intensamente negli anni 1, 2, 3. Un passaggio chiave di procedure di calibrazione della telecamera è di stimare i parametri di un modello di distorsione, nonché i parametri della telecamera intrinseci, estraendo una griglia di punti con una geometria nota dalle immagini della telecamera con precisione sub-pixel. bersagli di calibrazione con uno schema a scacchiera con quadrati bianchi e neri sono comunemente usati per questo scopo. Chiazze circolari offrono un modello alternativo 4, 5, 6. Negli ultimi anni, c&#39;è stato un crescente interesse nello sviluppo della tecnologia di navigazione chirurgica per procedure di chirurgia fetale, come il trattamento di sindrome da trasfusione feto-fetale (TTTS) su feti&gt; 7, 8, 9, 10. Poiché il campo di vista del fetoscope (cioè, un endoscopio utilizzato in procedure chirurgiche fetali) è molto limitata, sono stati proposti metodi per la mappatura della vascolarizzazione placentare senza l&#39;utilizzo di inseguitori esterni per aiutare la chirurgia TTTS 11, 12, 13. Distorsioni ottiche all&#39;interno di immagini fetoscopic avere effetti negativi sulle questi metodi di mosaicatura di calcolo che si basano su estrazione di informazioni visive 11. Pertanto, vi è una necessità non soddisfatta di uno strumento economicamente efficiente e veloce per peri-operatorio calibrazione fetoscopes modo che compensazione della distorsione ottica può essere effettuata in tempo reale durante l&#39;intervento. A causa del fatto che il fetoscope è immerso nel liquido amniotico durante l&#39;intervento, la differenza di indice di rifrazione tra undel liquido amniotico e ir rende classici metodi di calibrazione della fotocamera in aria non idonei per le procedure di chirurgia fetale. Stima parametri della telecamera di liquido immerso da parametri della telecamera in-aria è un compito difficile e richiede almeno un&#39;immagine del fluido immersi target di calibrazione 14. Inoltre, peri-operatorio, la calibrazione fotocamera fetoscopic fluido immerso è attualmente impraticabile a causa dei requisiti di sterilizzazione e le restrizioni sui materiali ammessi in sala operatoria. Per questi motivi, calibrando endoscopi per distorsioni ottiche non è tipicamente parte della corrente workflow clinico. Il lavoro in questo manoscritto è un tentativo di colmare questa lacuna calibrazione fotocamera progettando e producendo un profilo di calibrazione distorsione ottica sterilizzabile e pratico con un modello di cerchi asimmetrici. In precedenza, Wengert et al. fabbricato un dispositivo di calibrazione personalizzata con una piastra di alluminio ossidato come la calibrazione. Il loro method, però, funziona solo in combinazione con l&#39;algoritmo di calibrazione personalizzata si sono sviluppati 15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2mm Metal sheet 316 Grade, 40 mm by 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water container at least 50mm by 50mm by 30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A sterilisation package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seline water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual metal cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A file to round up the corners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A wooden or metal block 50 mm by 50 mm at least 10 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A vise (desirable but not required)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand Blasting machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GUI application to create .dxf file with the pattern (https://github.com/gift-surg/endocal)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An endoscope calibration software from GitHub (http://docs.opencv.org/2.4/doc/tutorials/calib3d/camera_calibration/camera_calibration.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCV camera calibration module (https://github.com/opencv/opencv)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medical-grade sterilizable target for fluid-immersed fetoscope optical distortion calibration

We have developed a calibration target for use with fluid-immersed endoscopes within the context of the GIFT-Surg (Guided Instrumentation for Fetal Therapy and Surgery) project. One of the aims of this project is to engineer novel, real-time image processing methods for intra-operative use in the treatment of congenital birth defects, such as spina bifida and the twin-to-twin transfusion syndrome. The developed target allows for the sterility-preserving optical distortion calibration of endoscopes within a few minutes. Good optical distortion calibration and compensation are important for mitigating undesirable effects like radial distortions, which not only hamper accurate imaging using existing endoscopic technology during fetal surgery, but also make acquired images less suitable for potentially very useful image computing applications, like real-time mosaicing. In this paper proposes a novel fabrication method to create an affordable, sterilizable calibration target suitable for use in a clinical setup. This method involves etching a calibration pattern by laser cutting a sandblasted stainless steel sheet. This target was validated using the camera calibration module provided by OpenCV, a state-of-the-art software library popular in the computer vision community.

Abbiamo creato un profilo di calibrazione sterilizzabile mediante attacco un modello di cerchio asimmetrica su un foglio di metallo sabbiato acciaio, il cui disegno è mostrato in Figura 1. Un&#39;installazione esemplare che mostra la calibrazione in azione insieme ad un fetoscope è mostrato in figura 2. Per alimentare questo disegno nel software incisione laser, un&#39;applicazione personalizzata è stato implementato nel linguaggio di programmazione Python 16. Creare il modello di progettazione comporta in modo iterativo incisione linee parallele su un foglio di metallo. Per il modello di avere un colore uniforme, alla fine, la distanza tra queste linee dovrebbe essere inferiore alla larghezza del fascio laser (vedere il riquadro di figura 1): questo valore è 45 micron per il cutter laser Violino (Laservall). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig1.jpg" /> <st<html> rong&gt; Figura 1: Progettazione del modello inciso con una griglia 3-by-11 di cerchi asimmetrici. Inserto: vista ingrandita della griglia di cerchi asimmetrici. La distanza tra le linee è 45 micron (pari alla larghezza del fascio laser), e ogni cerchio ha un diametro di 1 mm. Altre misure potrebbero essere utilizzati per la griglia pure, ma questo è risultato essere ottimale rispetto al campo fetoscope di vista. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig2.jpg" /> Figura 2: configurazione Exemplar con il target di calibrazione in uso. La punta del fetoscope immersi acqua è diretta alla calibrazione sulla destra. Sulla sinistra è un soldo britannico per fornire informazioni di scala.&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Il target di calibrazione fabbricato consente la rilevazione della sagoma circolare nel flusso video endoscopica con OpenCV 17, le cui posizioni vengono poi ordinati in griglia circolare asimmetrica predefinito (vedi figura 3). Usando questa informazione, in cooperazione con il già noto geometry griglia, parametri della telecamera interni possono essere stimati. Questi includono la matrice telecamera ed i coefficienti di distorsione. La matrice fotocamera consiste delle lunghezze focali e centri ottici lungo gli assi X e Y del piano dell&#39;immagine 2D. I coefficienti di distorsione sono basati sul modello Brown-Conrady 3. Si noti che per questo lavoro, solo i parametri di distorsione radiale sono stati stimati. Per una breve discussione della teoria, con esempi pratici, consultare la pagina web del modulo di calibrazione fotocamera OpenCV &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 17 e la casella degli strumenti di calibrazione fotocamera MATLAB 22. Maggiori dettagli sulla procedura di calibrazione della fotocamera sono disponibili nel lavoro di Zhang 20. Il repository software endocal dispone di un set di dati campione di 10 viste endoscopiche del profilo di calibrazione fabbricato 16. Utilizzando questo insieme di dati, una calibrazione con un errore medio ri-proiezione di 0,28 pixel (min: 0,16, max: 0,45) è stato ottenuto. Questo è paragonabile ai 0,25 pixel riportati da Wengert et al. usando il loro algoritmo di calibrazione personalizzata 15. Lo stesso gruppo di ricerca, tuttavia, ha segnalato un errore di ri-proiezione di 0,6 pixel in un più recente carta quando si utilizza il metodo a 15 per la calibrazione di una telecamera endoscopica utilizzata per placentare mosaicatura 18. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig3.jpg" /> <strong&gt; Figura 3: il rilevamento in tempo reale del motivo di calibrazione. Uno screenshot dall&#39;applicazione calibrazione 16 con il motivo di calibrazione rilevato sovrapposto il flusso video in diretta utilizzando la visualizzazione di realtà virtuale da OpenCV 17. Si noti che ogni colonna rilevata del motivo di calibrazione è sottolineata da un colore diverso. I cerchi rilevati, in combinazione con la geometria nota, vengono utilizzati per calcolare i parametri della telecamera. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> I parametri della telecamera stimati sono utilizzati per la correzione di distorsione ottica. La figura 4 mostra uno schema a scacchiera rettangolare, come visto con un fetoscope, dove distorsioni ottiche rendono le linee appaiono come curve. Si noti che le linee appaiono normali in distortiimmagine sullo corretta. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig4.jpg" /> Figura 4: correzione della distorsione ottica. Uno screenshot dall&#39;applicazione calibrazione 16 con l&#39;immagine video in diretta da una registrazione fetoscope dalla scacchiera (a sinistra) con l&#39;immagine di distorsione corretta (a destra). Tre linee esemplari sono disegnate in entrambe le immagini, ciascuna da un angolo all&#39;altro, dove la traiettoria è lineare. A causa delle distorsioni ottiche, queste linee appaiono come curve nelle immagini fetoscope originali. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Medical-grade Sterilizable Target for Fluid-immersed Fetoscope Optical Distortion Calibration

This article describes the design and development of a sterilizable custom camera optical distortion calibration target for the peri-operative, fluid-immersed calibration of endoscopes during endoscopic interventions.

Medico-grade di destinazione sterilizzabile per fetoscope ottico Distortion calibrazione Fluid-immersi

We have developed a calibration target for use with fluid-immersed endoscopes within the context of the GIFT-Surg (Guided Instrumentation for Fetal ...

medical-grade-sterilizable-target-for-fluid-immersed-fetoscope

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.6K Views.  University College London. This article describes the design and development of a sterilizable custom camera optical distortion calibration target for the peri-operative, fluid-immersed calibration of endoscopes during endoscopic interventions.

Video: Medical-grade Sterilizable Target for Fluid-immersed Fetoscope Optical Distortion Calibration

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Ricerca

Bioingegneria

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Un Cre-Lox P approccio ricombinazione per la rilevazione di fusione cellulare In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In sintesi in vitro di Native, Spaziatura fibrosa lungo e segmentale collagene spaziatura lungo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene for applications as a stent material. Graphene was grown on copper substrates via chemical vapor deposition and then transferred onto nitinol substrates. In order to understand how the graphene coating could change biological response, cell viability of rat aortic endothelial cells and rat aortic smooth muscle cells was investigated. Moreover, the effect of graphene-coatings on cell adhesion and morphology was examined with fluorescent confocal microscopy. Cells were stained for actin and nuclei, and there were noticeable differences between pristine nitinol samples compared to graphene-coated samples. Total actin expression from rat aortic smooth muscle cells was found using western blot. Protein adsorption characteristics, an indicator for potential thrombogenicity, were determined for serum albumin and fibrinogen with gel electrophoresis. Moreover, the transfer of charge from fibrinogen to substrate was deduced using Raman spectroscopy. It was found that graphene coating on nitinol substrates met the functional requirements for a stent material and improved the biological response compared to uncoated nitinol. Thus, graphene-coated nitinol is a viable candidate for a stent material.

Graphene offers potential as a coating material for biomedical implants. In this study we demonstrate a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene and determine how graphene may influence implant response.

Rivestimenti grafene per impianti biomedici

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband rivelatore ottico di ultrasuono per applicazioni Medical Imaging

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo Cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle Carrier Liquid

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Medico-grade di destinazione sterilizzabile per fetoscope ottico Distortion calibrazione Fluid-immersi

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