This work was supported through an Innovative Engineering for Health award by the Wellcome Trust [WT101957], the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) [NS/A000027/1], and a National Institute for Health Research Biomedical Research Centre UCLH/UCL High Impact Initiative. Jan Deprest is being funded by the Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO; JD as clinical researcher 1.8.012.07). Danail Stoyanov receives funding from the EPSRC (EP/N013220/1, EP/N022750/1), the EU-FP7 project CASCADE (FP7-ICT-2913-601021), and the EU-Horizon2020 project EndoVESPA (H2020-ICT- 2015-688592). Sebastien Ourselin receives funding from the EPSRC (EP/H046410/1, EP/J020990/1, EP/K005278) and the MRC (MR/J01107X/1). Marcel Tella is supported by the EPSRC-funded UCL Centre for Doctoral Training in Medical Imaging (EP/L016478/1).

1. Fabricação alvo <ol><li> Jato de areia <ol><li> Prepara-se uma folha de aço inoxidável 316 com uma espessura de 1,2 mm. Usando um lápis ou um prego, desenhar um milímetro quadrado de 40 mm x 40 sobre a folha com o auxílio de uma régua. </li><li> Corte o quadrado desenhado usando um cortador de metal manual. CUIDADO! Assista os dedos. </li><li> Use um arquivo para arredondar os cantos e lados da amostra. CUIDADO! Eles são muito afiadas; seja cuidadoso. </li><li> Preparar um bloco de madeira ou de metal em frente ligeiramente maior em tamanho do que a chapa de aço inoxidável. Coloque a folha de corte sobre ele; fazer isso para evitar a flexão da amostra durante a jacto de areia. </li><li> Coloque o conjunto na câmara de explosão interna. Lembre-se de usar um coletor de pó e selar hermeticamente a câmara de explosão interna; caso contrário, a areia vai se espalhar por todo durante o processo. Use óculos de segurança para proteger os olhos. </li><li> A posição de uma pistola de explosão perpendicular e, pelo menos, 4-5 cm de distância da superfície do metal. Aplique o contr péol para jateamento. Coloque a amostra sobre o pedaço de madeira (1-2 cm de espessura) usando um vício, como o fluxo de areia a alta pressão pode deformar a amostra. Durante jacto de areia, manter a amostra firmemente pela borda do pedaço de madeira ou usando outro vício. </li><li> Repetir a jacto de areia, por outro lado se for desejável ter um padrão de calibração gravada em ambos os lados. </li></ol></li><li> padronização Laser <ol><li> Desenhar um padrão de círculos assimétricos, como mostrado na Figura 1. </li><li> Prepare um arquivo de formato de troca de desenho (DXF) do projeto ou usando software CAD ou outra linguagem de programação adequada. NOTA: Por conveniência, uma aplicação Python que pode gerar arquivos DXF para o projeto mencionado neste artigo é fornecido como parte da aplicação GUI compacta 16. </li><li> Importar os arquivos DXF para o software de corte a laser. </li><li> Coloque os seguintes parâmetros para a gravura de fundo. Laser de energia: 40%, velocidade de digitalização:80 cm / s, frequência: 4.000 Hz, número de passes: 1. </li><li> Configure os seguintes parâmetros para gravar o padrão. Laser de energia: 40%, Velocidade de digitalização: 2.1 cm / s, frequência: 4.000 Hz, número de passes: 1. </li><li> Coloque a amostra na plataforma de trabalho e alinhar o padrão de corte usando o software. </li><li> Após o laser realiza o corte, limpar a amostra, mergulhando-o em álcool. Não use nenhum toalhetes, como eles costumam deixar resíduos indesejáveis. </li></ol></li><li> Esterilização <ol><li> Enrole a amostra esterilizado em um pacote de esterilização e inseri-lo na unidade de esterilização (autoclave). </li><li> Adicionar água (a água não destilada) para a autoclave e siga o manual do utilizador / recomendações do fabricante para esterilizar o alvo. </li></ol></li></ol> Calibração 2. Peri-operatório <ol><li> software de calibração <ol><li> Instalar o pacote &quot;Endocal&quot; calibração endoscópio software fornecido no GitHub 16(Siga as instruções no arquivo README aí). NOTA: Este software envolve o módulo de calibração da câmara OpenCV 17 em um aplicativo de conveniência easy-to-use. O pedido previsto é executado em dois modos: online e offline. O modo online adquire o fluxo de vídeo diretamente do hardware frame-grabber compatível. O modo offline permite imagens de carregamento endoscópio a partir de um arquivo de vídeo ou de uma pasta com um número de quadros de vídeo guardados como arquivos de imagem. Veja README para hardware suportado e instruções detalhadas sobre como usar esses dois modos. </li></ol></li><li> aquisição de vídeo endoscópico NOTA: As seguintes instruções são para a calibração on-line (como descrito acima), mas eles também são aplicáveis ​​a calibração offline. <ol><li> Coloque o alvo de calibração em um recipiente de fluido estéril, tal como um boião. </li><li> Encher o recipiente com o fluido alvo ou uma substância semelhante estéril. NOTA: Por exemplo, no proce fetoscopicmentos, o fluido alvo é líquido amniótico. Uma vez que as propriedades ópticas de fluido amniótico são semelhantes à água salina 18, 19, água salina estéril pode ser usado para calibrar o fetoscópio. </li><li> Ajuste o zoom e a nitidez do endoscópio se o desejar. </li><li> Mergulha-se o endoscópio no líquido e mantê-lo a uma distância a partir do alvo de calibração similar à distância a partir da anatomia que o endoscópio vai ser usado mais tarde no. </li><li> Inicie o aplicativo de calibração e começar a aquisição câmera. </li><li> Mover a ponta do endoscópio ligeiramente para diferentes pontos de vista, mantendo o padrão de calibração em toda visão da câmara. Para um desempenho ideal, manter a lenda elíptica em torno do padrão de calibração dentro da visão circular do endoscópio. NOTA: quadros de vídeo que são utilizáveis para a calibração são indicados por uma sobreposição de padrão virtual, como pode ser visto na Figura 3. </li><li> Acquire, pelo menos o número mínimo de pontos de vista da câmara endoscópicos necessários para a calibração (como indicado na janela Endocal). NOTA: A versão atual do Endocal requer pelo menos 10 visualizações câmera endoscópica para a calibração, um número heuristically selecionado de pontos de vista em que o erro de calibração parece ser mínimo e seguem um padrão estável 20. </li><li> Pressionar a tecla de calibração, tal como indicado na janela Endocal, para iniciar o processo de calibração utilizando as imagens obtidas até agora. </li></ol></li><li> Salvando e usando os parâmetros de calibração <ol><li> Pressione a tecla de calibração indicada para salvar os parâmetros de calibração, resultando em um YAML ( &quot;YAML Is not Markup Language&quot;) arquivo 21. </li><li> Grupo os parâmetros de calibração para os coeficientes da matriz câmera e distorção, como explicado no módulo de calibração da câmara OpenCV 17. NOTA: Depois de realizar a calibração, a calibraçãoaplicativo exibe automaticamente a imagem com correção de distorção ao direito da imagem endoscópio originais. </li><li> Use o sinal de vídeo com correção de distorção durante um procedimento fetoscopic para visualização pura ou para placentário em tempo real de mosaicos 11. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Jacto de areia é um passo importante no processo de fabricação porque a superfície do metal em bruto reflecte bem visível, a luz endoscópio, tornando-se impossível para os círculos a ser detectado. É difícil distinguir os círculos mesmo a olho nu (ver Figura 5). Note-se que a superfície do alvo mostrado já foi gravada com um laser. No entanto, isto não diminui a reflexão da luz. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig5.jpg" /> Figura 5: alvo de calibração sem jateamento aplicada. Como pode ser visto a partir da vista endoscópio à esquerda, o brilho da luz endoscópio na superfície do material torna difícil até mesmo para o olho nu para distinguir os círculos (há um círculo apenas para o sudeste da grande reflexão). Note-se que a superfície do alvo presente (ou seja, o &quot;fundo&quot;) foi já gravadas, mas isto não é<html> útil na ausência de jacto de areia. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Antes do padrão de condicionamento, é também importante para gravar a superfície de toda a amostra. Isto é necessário porque a superfície de jacto de areia tem muitas reflexões especulares (ver Figura 6), o que interfere com a detecção de blob. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig6.jpg" /> Figura 6: Superfície Sandblasted sem condicionamento. Embora não seja tão proeminente como a superfície de metal bruto, os relativamente pequenos reflexões especulares (alguns dos quais são destacados com setas amarelas) são ainda suficientes para evitar a detecção blob de ter sucesso, então nenhuma calibração pode ser realizada com este objectivo.arget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Aplicando o laser a velocidades diferentes dá diferentes cores de fundo. A cor do fundo desempenha um papel significativo no contraste entre os círculos e o fundo. Por isso, é essencial para determinar a cor de fundo óptima. Para este efeito, uma placa com círculos gravado contra um conjunto de diferentes origens foi criado (ver Figura 7). Os fundos foram testados usando o módulo de detecção de recurso de OpenCV 23, o qual é utilizado no módulo de calibragem OpenCV câmara 17. Neste trabalho, o alvo era feito de aço inoxidável, uma vez que é o material mais comum utilizado e fiável em clínicas para os dispositivos médicos. Este material está livremente disponível, não é caro, robusta, e fácil de esterilizar. Outros materiais poderiam potencialmente ser usadas para o alvo de calibração, tais como os metais de alumínio ou iodado, mas este é o SCOPe de trabalho futuro. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig7.jpg" /> Figura 7: a placa de aço inoxidável com uma paleta de cores diferentes do fundo gravados com o laser. Experiências práticas foram conduzidas em conjunto com o módulo de detecção de recurso OpenCV para determinar qual a cor do fundo dá o melhor resultado em termos de contraste 23 gota-a-fundo. A vista endoscópio à esquerda mostra a placa. As cores de fundo moderados (ou seja, outros que as mais escuras e mais leves) nesta paleta de produzir uma melhor detecção blob. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Uma das vantagens deste trabalho é que de efetuar uma calibração usando o alvo fabricada leva 2-3 min. A maior parte do esforço ires para estabilizar manualmente o endoscópio para obter acervo considerável vista do padrão de calibração. Utilizando um suporte de endoscópio com especificação poderia eliminar a necessidade de estabilização manual, que por sua vez pode encurtar significativamente o tempo de calibração. <img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/55298/55298video1.jpg" /> Vídeo 1: Vídeo mostrando como óptico calibração distorção pode ser realizada utilizando o alvo de calibração desenvolvida em conjunto com o software Endocal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/fetoscope-calibration-480.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).</a> Uma vantagem do nosso trabalho em relação ao trabalho de Wengert et al. 15 é que o módulo de calibragem OpenCV câmara 17 pode ser utilizado tal e qual para a calibração, sem necessidade de qualquer modificação ou personalizado parâmezação. Porque OpenCV é um pacote de software bem estabelecida e bem conservados e é muito popular na comunidade de visão por computador, usando-o elimina a necessidade de escrever e manutenção de software personalizado. Para a conveniência do leitor, uma aplicação gráfica compacto é fornecido 16, que o leitor pode facilmente instalar e usar para testar novos alvos de calibração. Uma desvantagem do nosso método em comparação com Wengert et ai. 15 é que o método é mais robusto a oclusões do padrão, uma vez que não requer a detecção de todas as manchas. Inicialmente, um destino de calibragem com um padrão quadriculado foi fabricado para este trabalho. No entanto, este tipo de calibração alvo provou ser inadequada em experiências, devido à dificuldade de detectar os cantos dos quadrados do tabuleiro de damas. Detecção de canto depende de binarização de imagem baseado em histograma (ver o código fonte OpenCV 24). este impencontra-se a necessidade de um contraste de cor clara entre as escuras e claras praças, que não poderia ser garantidas com nosso padrão de xadrez, parcialmente devido às reflexões especulares, como os mostrados na Figura 6. Tais reflexões especulares estão presentes mesmo após o condicionamento de fundo; No entanto, a detecção dos círculos parece ser menos sensível a este inconveniente. Na configuração atual, apenas vistas perpendiculares do alvo de calibração permitem a detecção de blob bem sucedido. Isto é devido às reflexões especulares a partir da superfície do alvo dificulta a detecção de gota em ângulos oblíquos. Estamos a trabalhar para melhorar ainda mais o alvo de modo a permitir a aquisição de vistas em uma ampla gama de ângulos, o que poderia potencialmente melhorar a qualidade de calibrações executadas 20. Na placenta em tempo real de mosaicos oleoduto que foi anteriormente proposto, 11, o cálculo da transformação que mapeia pares de imagem baseia-se na detecção com sucesso e agrupamento de características. distorções óticas, por outro lado, fazer com que um grupo de características com uma geometria rígida apareça diferente entre as imagens. Como consequência, essa diferença leva a imprecisões nas transformações computadorizada, que causam desvios nos mosaicos de imagens resultantes. Porque as distorções ópticas mais proeminentes estão presentes para as bordas, imagens endoscópicas estão actualmente cortada para suas regiões mais íntimos. Uma boa correção de distorções ópticas poderia potencialmente permitir a incorporação de uma parte maior de cada imagem no processo de construção do mosaico. A vantagem deste método é dupla. Em primeiro lugar, seria aumentar o número de características detectadas em cada imagem, melhorar potencialmente a computação das transformações da imagem. Em segundo lugar, permitiria a toda a superfície anatómica alvo a ser reconstruído em um tempo mais curto.

<html> Calibração da câmera é um problema bem conhecido no campo da visão de computador que tem sido intensamente estudada ao longo dos anos 1, 2, 3. Um passo fundamental dos procedimentos de calibração da câmera é estimar os parâmetros de um modelo de distorção, bem como os parâmetros da câmera intrínsecas, extraindo uma grade de pontos com uma geometria conhecida a partir de imagens da câmara com precisão sub-pixel. alvos de calibração com um padrão xadrez com quadrados pretos e brancos são comumente usados ​​para esta finalidade. Blobs circulares oferecem um padrão alternativo 4, 5, 6. Nos últimos anos, tem havido um interesse crescente no desenvolvimento de tecnologia de navegação cirúrgico para procedimentos de cirurgia fetal, tais como o tratamento de twin-to-duplo síndrome de transfusão (STT) em fetos&gt; 7, 8, 9, 10. Como o campo de visão do fetoscópio (isto é, um endoscópio utilizado em procedimentos cirúrgicos fetais) é muito limitada, os métodos para o mapeamento da vasculatura placentária sem o uso de rastreadores externos têm sido propostos para auxiliar a cirurgia STT 11, 12, 13. Distorções óticas dentro de imagens fetoscopic ter efeitos adversos sobre esses métodos de mosaicos computacionais que dependem de extração de informação visual 11. Assim, existe uma necessidade não satisfeita de uma ferramenta de custo eficiente e rápido para a peri-operatório fetoscopes calibrar de modo que a compensação distorção óptica pode ser feita em tempo real durante a intervenção. Devido ao facto de o fetoscópio está imerso no líquido amniótico durante a intervenção, a diferença de índice de refracção entre umfluido ir e amniótico torna métodos clássicos em-ar de calibração câmera impróprios para procedimentos de cirurgia fetal. Estimar os parâmetros da câmara imersos em fluidos de parâmetros da câmara em-ar é uma tarefa difícil e requer pelo menos uma imagem do alvo de calibração imersos em fluido 14. Além disso, peri-operatória, fetoscopic calibração da câmara, imersos em fluido é atualmente impraticável devido a requisitos de esterilização e restrições sobre os materiais permitidos na sala de operações. Devido a estas razões, calibrando endoscópios para distorções ópticas não é normalmente parte do fluxo de trabalho clínico atual. O trabalho neste manuscrito é uma tentativa de colmatar esta lacuna calibração da câmara, através da concepção e produção de um destino de calibragem distorção óptica esterilizável e prático com um padrão de círculos assimétricas. Anteriormente, Wengert et ai. fabricou um dispositivo de calibragem personalizado que apresenta uma placa de alumínio oxidado como o alvo de calibração. sua methOD, no entanto, só funciona em conjunto com o algoritmo de calibragem personalizado eles desenvolveram 15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2mm Metal sheet 316 Grade, 40 mm by 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water container at least 50mm by 50mm by 30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A sterilisation package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seline water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual metal cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A file to round up the corners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A wooden or metal block 50 mm by 50 mm at least 10 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A vise (desirable but not required)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand Blasting machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GUI application to create .dxf file with the pattern (https://github.com/gift-surg/endocal)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Cutter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An endoscope calibration software from GitHub (http://docs.opencv.org/2.4/doc/tutorials/calib3d/camera_calibration/camera_calibration.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCV camera calibration module (https://github.com/opencv/opencv)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medical-grade sterilizable target for fluid-immersed fetoscope optical distortion calibration

We have developed a calibration target for use with fluid-immersed endoscopes within the context of the GIFT-Surg (Guided Instrumentation for Fetal Therapy and Surgery) project. One of the aims of this project is to engineer novel, real-time image processing methods for intra-operative use in the treatment of congenital birth defects, such as spina bifida and the twin-to-twin transfusion syndrome. The developed target allows for the sterility-preserving optical distortion calibration of endoscopes within a few minutes. Good optical distortion calibration and compensation are important for mitigating undesirable effects like radial distortions, which not only hamper accurate imaging using existing endoscopic technology during fetal surgery, but also make acquired images less suitable for potentially very useful image computing applications, like real-time mosaicing. In this paper proposes a novel fabrication method to create an affordable, sterilizable calibration target suitable for use in a clinical setup. This method involves etching a calibration pattern by laser cutting a sandblasted stainless steel sheet. This target was validated using the camera calibration module provided by OpenCV, a state-of-the-art software library popular in the computer vision community.

Nós criamos um destino de calibragem esterilizável gravando um padrão de círculo assimétrica em uma folha de metal fosco de aço inoxidável, cujo desenho é mostrado na Figura 1. Uma configuração exemplar mostrando este indicador de calibração na acção em conjunto com um fetoscópio é mostrado na Figura 2. Para alimentar este projeto para o software de gravação a laser, um aplicativo personalizado foi implementado na linguagem de programação Python 16. Criando o padrão de projeto envolve iteratively gravando linhas paralelas em uma folha de metal. Para o padrão para ter uma cor consistente, no final, a distância entre estas linhas devem ser menor do que a largura do feixe de laser (ver inserção da Figura 1): este valor é de 45 uM para o cortador a laser Violino (Laservall). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig1.jpg" /> <st<html> rong&gt; Figura 1: Desenho do padrão gravado com uma grade 3-por-11 de círculos assimétricas. Inserção: ampliada em vista da grelha de círculos assimétricos. A distância entre as linhas é de 45 uM (equivalente a largura do feixe de laser), e cada círculo tem um diâmetro de 1 mm. Outros tamanhos poderia ser usado para a grelha, bem como, mas isso verificou-se ser óptimo no que diz respeito ao campo de vista fetoscópio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig2.jpg" /> Figura 2: setup Exemplar com o alvo de calibração em uso. A ponta do fetoscópio imerso em água é dirigida para o alvo de calibração à direita. À esquerda, há um centavo britânica para fornecer informações escala.&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. O alvo de calibração fabricado permite a detecção do padrão circular no fluxo de vídeo endoscópica com OpenCV 17, cujas localizações são então classificados para a grade circular assimétrica pré-definido (ver Figura 3). Usando esta informação em conjunto com a geometria da rede já conhecido, os parâmetros da câmara interna pode ser estimada. Estes incluem a matriz de câmera e os coeficientes de distorção. A matriz câmara consiste nos comprimentos focais e os centros ópticos ao longo dos eixos X e do eixo y do plano da imagem 2D. Os coeficientes de distorção são baseados no modelo de Brown-Conrady 3. Note-se que para este trabalho, apenas os parâmetros de distorção radiais foram estimados. Para uma breve discussão da teoria, com exemplos práticos, consulte a página da web do módulo de calibração da câmara OpenCV &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 17 ea câmara MATLAB toolbox calibração 22. Mais detalhes sobre o procedimento de calibração de câmera estão disponíveis na obra de Zhang 20. O repositório de software Endocal apresenta um conjunto de dados de amostra de 10 visualizações endoscópicos do alvo de calibração fabricado 16. Usando este conjunto de dados, uma calibração com um erro médio de re-projeção de 0,28 pixels (min: 0,16, máx: 0,45) foi obtido. Isto é comparável com os pixels 0,25 relatados por Wengert et ai. usando seu algoritmo de calibragem personalizada 15. O mesmo grupo de pesquisa, no entanto, relatou um erro de re-projeção de 0,6 pixels em um artigo mais recente ao usar o método em 15 para calibrar uma câmera endoscópica usado para placentária de mosaicos 18. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig3.jpg" /> <stRong&gt; Figura 3: Detecção em tempo real do padrão de calibração. Uma captura de tela do aplicativo de calibração 16 com o padrão de calibração detectado colocado sobre o fluxo de vídeo ao vivo usando a visualização de realidade virtual de OpenCV 17. Note-se que cada coluna de detectado o padrão de calibração é realçada por uma cor diferente. Os círculos detectados, em conjunto com a geometria conhecida, são usados ​​para calcular os parâmetros da câmara. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Os parâmetros da câmara estimados são utilizados para correção de distorção óptica. A Figura 4 mostra um padrão de tabuleiro de xadrez rectangular, como visualizado usando um fetoscópio, onde distorções óticas fazer as linhas aparecem como curvas. Note que as linhas aparecem normal no distortina imagem corrigida. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55298/55298fig4.jpg" /> Figura 4: correção de distorção óptica. Uma captura de tela do aplicativo de calibração 16 que caracteriza a imagem de vídeo ao vivo a partir de uma gravação fetoscópio do padrão quadriculado (à esquerda) com a imagem com correção de distorção (direita). Três linhas exemplares são desenhadas em ambas as imagens, cada uma a partir de um canto ao outro, em que a trajectória é linear. Devido às distorções óticas, estas linhas aparecem como curvas nas imagens originais fetoscópio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55298/55298fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Medical-grade Sterilizable Target for Fluid-immersed Fetoscope Optical Distortion Calibration

This article describes the design and development of a sterilizable custom camera optical distortion calibration target for the peri-operative, fluid-immersed calibration of endoscopes during endoscopic interventions.

Alvo esterilizável de grau médico para fetoscópio Distortion Calibração óptica imerso-Fluid

We have developed a calibration target for use with fluid-immersed endoscopes within the context of the GIFT-Surg (Guided Instrumentation for Fetal ...

medical-grade-sterilizable-target-for-fluid-immersed-fetoscope

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.6K visualizações.  University College London. This article describes the design and development of a sterilizable custom camera optical distortion calibration target for the peri-operative, fluid-immersed calibration of endoscopes during endoscopic interventions.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bioengenharia

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

Em síntese in vitro de Nativo, Espaçamento fibroso Long e Colágeno Espaçamento segmentar Longo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene for applications as a stent material. Graphene was grown on copper substrates via chemical vapor deposition and then transferred onto nitinol substrates. In order to understand how the graphene coating could change biological response, cell viability of rat aortic endothelial cells and rat aortic smooth muscle cells was investigated. Moreover, the effect of graphene-coatings on cell adhesion and morphology was examined with fluorescent confocal microscopy. Cells were stained for actin and nuclei, and there were noticeable differences between pristine nitinol samples compared to graphene-coated samples. Total actin expression from rat aortic smooth muscle cells was found using western blot. Protein adsorption characteristics, an indicator for potential thrombogenicity, were determined for serum albumin and fibrinogen with gel electrophoresis. Moreover, the transfer of charge from fibrinogen to substrate was deduced using Raman spectroscopy. It was found that graphene coating on nitinol substrates met the functional requirements for a stent material and improved the biological response compared to uncoated nitinol. Thus, graphene-coated nitinol is a viable candidate for a stent material.

Graphene offers potential as a coating material for biomedical implants. In this study we demonstrate a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene and determine how graphene may influence implant response.

Revestimentos de grafeno para implantes biomédicos

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband Detector óptico de ultra-som para aplicações Medical Imaging

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...