Name: multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
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NIH / NIDA DA034783でサポートされています。私たちは、多量-PAGEでの技術支援のためブライアン・A・キリンガー感謝します。

1.組織調製<ol><li> 4X BN-PAGE試料緩衝液（200mMのビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ - トリス（ヒドロキシメチル）メタン（BIS-TRIS）の10mLの、200mMのNaCl、40％のw / vのグリセロール、0.004％ポンソーS、pHが7.2を準備）。 注：このストック溶液は、事前に行われ、4℃で保存することができます。 </li><li> 1×商用プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む750μLのdH 2 Oで4倍のサンプルバッファー250μLに希釈します。ボルテックスし、氷上で寒さ。 </li><li>クリーンダウンスホモジナイザーの30ストロークで1 mLの1Xの氷冷BN-PAGEサンプル緩衝液中に標的組織20mgを均質化します。 注：この実証実験では、標的組織が全体のラットの脳組織です。均質化の後、試料を可溶化した膜タンパク質の電気泳動を可能にするために、中性洗剤等の2％ジギトニンで処理してもよいです。 </li><li> 1.5mLのマイクロ遠心チューブにホモジネートを転送し、そして不溶性の細胞内容物をペレット化するために30分間、14,000×gで遠心分離。 AFTERの遠心分離は、氷の上にきれいなチューブに上清をデカント。 </li><li>ビシンコニン酸（BCA）または類似のタンパク質定量アッセイを用いて上清のタンパク質濃度を測定するために、製造業者の指示に従います。 </li><li>ホモジネート試料（単数または複数）が、界面活性剤が含まれている場合、0.25％クマシーにホモジネート溶液をもたらすのに十分な、水溶液中の5％クーマシーブルーG-250の量を加えます。 </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> ランニングバッファーを1×500mLのを作るために0.002％クーマシーブルーを含有する475ミリリットルのdH 2 Oに25 mLの20倍ブルーネイティブ（BN）泳動緩衝液ストック（1.0Mビス-トリス、1.0 Mトリシン、pHが6.8）を希釈します。 <ol><li>サンプルは界面活性剤が含まれている場合、代わりに0.02％クーマシーを含有する1×ランニングバッファー250mLのと何を含まない別の250ミリリットルを加えます。 </li></ol></li><li> 4°Cまで冷却バッファ（S）。 </li><li>きれいにし、製造者の指示に従ってカセットを注入ポリアクリルアミドゲルを組み立てます。 </li><li&gt;標準レシピ7に記載の BNポリアクリルアミドゲル（10％Tスタッキング層、6％T解決層）を注ぎ、そしてウェルコームを置き。 </li><li>ゲルが重合した後、のdH 2 Oを用いてカセットをリンスし、製造者の指示に従って電気泳動装置を組み立てます。 </li><li> ウェルコームを取り外し、1×BN-PAGEランニング緩衝液で井戸を埋めます。サンプルがロードされるまで緩衝液で全内部チャンバを充填避けます。 <ol><li>サンプルは界面活性剤を含む場合は、0.02％クーマシーブルーを含有する緩衝液でウェルを満たします。 注：4°Cで、手順2.7から2.9を実行します。 </li></ol></li><li>ゲルローディングチップを用いて、所望のウェルに20μgのタンパク質を含有するホモジネートの体積をピペット。未使用のウェルに1×BN-PAGEサンプル緩衝液の等量をピペット。 注：に追加したホモジネートの適切な量を計算するためにBCAアッセイから決定されたタンパク質の濃度を使用し井戸。 </li><li> サンプルがロードされた後、1×BN-PAGEランニング緩衝液を用いて、内部チャンバを充填します。ゲルが完全にバッファに沈めていることを確認します。次に、製造者によって示されるレベルに1×ランニングバッファーと外側室を満たします。 <ol><li>サンプルは界面活性剤を含む場合は、0.02％クーマシーブルーを含有する1×緩衝液、及び染料を含まない1×ランニングバッファーと外側チャンバと内部チャンバを充填します。 </li></ol></li><li>電源に電極を接続し、染料バンド層を解決するに〜2cmに進行するまで、150 Vでゲル中のタンパク質を電気泳動。停止し、電源を切断します。 </li></ol> 3.架橋注：4°Cで、手順3.1から3.6を実行します。 <ol><li>電気泳動装置を分解し、ゲルカセットのガラス板を分離します。スタッキング層を取り外して捨てます。 </li><li>注意深くだけ染料前面の下縁下ゲルを切りました。取るこのカットとして滑らかで真っ直ぐとして可能にするように注意し、その後ゲルの未使用部分を捨てます。これは、ホモジネート試料中のすべてのタンパク質が含まれていますポリアクリルアミドゲルの〜2cm幅、水平方向のストリップを、残します。 </li><li>ゲルストリップの縁に沿って任意の未使用部分を切り取ります。 </li><li>注意深く小さな容器に10mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にストリップを配置し、そして穏やかに平衡化する30分間章動によって混合します。 </li><li>平衡化後、破棄し、別の10 mLのPBSに置き換えます。ピペット500μLの25mM DSPはPBSにジメチルスルホキシドに溶解し、そして30分間、上記のように（ステップ3.4）混合を続けます。 </li><li> DSP溶液をオフに注ぎます。未反応のDSPをクエンチするために、2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.375 Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス-HCl）、pHが8.8の10ミリリットルを加えます。 15分間章動を続行します。 </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li>ゲルストリップが急冷されている間、SDS-PAを準備標準的な方法9に従ってGEゲル溶液。重合試薬を追加しないでください。 </li><li> 急冷した後、室温にΒΝゲルストリップを返し、新しいゲルカセットの中にストリップをキャスト。 <ol><li>これを行うには、慎重にゲルをピックアップし、クリーンゲルカセットのスペーサプレートの上に置きます。 </li><li>オリエントストリップ色素フロントの底部（ 即ち 、BN-PAGE中に遠くに移動側は新たなカセットの上部に最も近いなければならない新たなカセットの上部に最も近いので、ゲルストリップは、その前から反転されなければなりませんオリエンテーション）。 図3を参照してください。 </li><li>その上縁があっても、カバープレートの上端がされる場所であるようにストリップを配置する（ すなわち 、それは新たなゲルの上部にあるであろう）。色素の先端がガラス板の水平エッジに平行であることを確認します。 </li><li>トンの余地を残し、スペーサ壁の一つに対して切除されたストリップの一方の側を押してくださいゲルのために彼の他の側面を注入すると、タンパク質の標準またはラダーをロードします。 </li><li>ゲルストリップの下端は、任意のギザギザや不均一な領域が含まれている場合は、慎重にそれらを切り取ります。存在する場合、それらは、ゲル中にトラップ気泡が注ぐだろう。 </li><li>ゲルストリップが正しく配置されると、スペーサプレートの上にカバープレートを置きます。閉じ込められた気泡を押し出すために穏やかな圧力を適用します。 </li><li>製造業者の指示に従ってゲル注入装置を組み立てるために続けます。 </li></ol></li><li>分離ゲル緩衝液に重合試薬を追加し、及び血清学的ピペットを使用して、調製したゲルカセットにそれを注ぎます。スタッキング層のための余地を残すために、切除したBN-PAGEゲルストリップ下の約2 cmのゲルカセットを記入してください。 </li><li>注ぎゲルの上に100μLのブタノールを追加し、解決層の重合のために30分を許可します。ブタノールをオフに注ぎます。 </li><li> スタッキングゲル溶液に重合試薬を追加します。 serologを使用してiCalのピペット、ゲルカセット内の残りのすべての空のスペースを埋めるためにスタッキング層を注ぎます。 <ol><li>それはゲルストリップの下の空間を満たすように、スタッキング層が注がれ、気泡がトラップされないようにゲルカセットを傾けます。 </li><li>スタッキングゲル緩衝液はゲルストリップの下の空のスペースを埋めるように、徐々にレベル足場にゲルカセットを返します。 </li><li>ほぼオーバーフローそれまでは、次のスタッキングゲル緩衝液を用いて切り出したゲルストリップに空きスペースを埋めるために続けます。 </li></ol></li><li>スタッキング層は、30分間重合することができます。 注：ゲルが重合されている間10×SDS-PAGEのランニング緩衝液（250mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、1.9 Mグリシン、1％SDS）を作ります。これはまた、予め作られ、室温で保存することができます。 </li><li> 1xの作業バッファを作るために450ミリリットルのdH 2 Oに50 mLの10倍のSDS-PAGEランニングバッファーの株式を希釈します。 </li><li>スタッキング層が重合した後、注入からゲルカセットを除去装置は、のdH 2 Oでリンスし、そして製造者の指示に従って電気泳動装置を組み立てます。 </li><li>次いで、製造業者によって示されるレベルに外側チャンバを満たす、1×SDS-PAGEのランニング緩衝液で完全に内部チャンバを充填します。 </li><li>次分子量ラダーまたは適切なタンパク質標準で切り出し、ゲルストリップにスペースをロードします。 </li><li>電源に電極を取り付け、そしてクマシー色素がゲルをオフに実行すると120 V.でサンプルを電気泳動、停止して電源を切断します。 </li><li> 10結合抗体によるエレクトロ及びタンパク質検出の標準的な方法を用いてゲルを分析します。 </li></ol>

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	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li><li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry.">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting.">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li><li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis.">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li><li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).</li><li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions.">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li><li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking:+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure.">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li><li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+of+extended+biological+structures:+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+[35S]dithiobis(succinimidyl+propionate).">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II.">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li></ol>

著者は、開示することは何もありません。

タンパク質間相互作用は、生き物が行っすべてのタスクのために重要です。このため、彼らは厳しい調査と研究の対象となっています。多量-PAGEは、捕捉分離、およびタンパク質複合体の広い範囲を分析するための新規な方法です。我々は以前に疾患関連タンパク質のαシヌクレイン11のoligimerizationを研究への適用可能性を実証しています。しかし、 図2に示され...

<html>正常な細胞機能は、タンパク質-タンパク質相互作用1、2に依存しています。その結果、ヒトの疾患は、しばしば、種々のタンパク質複合体3の組立及び動作の摂動によってマークされます。このような相互作用を特徴付ける能力は極めて重要です。これらの相互作用を検出するための現在の手段は、多くの場合、それらの相互作用パートナーのプルダウンに続いて、標的タンパク質の精製を必要としています。従来の精製は、分画遠心分離、沈殿、及び/又はクロマトグラフィー4によって達成されます。これらの方法は、時間がかかる各標的タンパク質のために変更しなければならない、としばしば低い収率につながります。近代的な精製法は、捕捉分子5に結合されたビーズを搭載したカラム上の免疫沈降または抽出し、タンパク質をターゲットにするペプチドタグの融合を伴いますこれは多くのタンパク質に拡張可能であるが「&gt; 6。、それは潜在的にそれらの通常の結合パートナーに対する親和性の異なる構築物をもたらす、標的の配列の改変を必要とする。いくつかのタンパク質-タンパク質相互作用の微妙な性質は、この方法が適用できない場合があり手段多くのシナリオである。さらに、タンパク質 - タンパク質相互作用をマッピングするために使用されるプルダウンアッセイは、制限された自由度とベイトタンパク質の非天然レベルに起因する正確な細胞画像を、キャプチャしないことができます。 理想的には、タンパク質複合体は、精製またはプルダウンを必要とせず、その天然状態で検出することができました。ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN-PAGE）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にあまり変性の代替として開発され、そして生物学的サンプル7からのいくつかのタンパク質との複合体の分離を可能にしました。しかし、BN-PAGE中のタンパク質は、LARに基づいて分離しますサイズ、電荷、立体構造、および他の分子との会合を含む変数のGE番号。これらの要因の相互作用は、多くの場合、タンパク質の同時分離、凝集体形成、および不十分なタンパク質バンドの解像度をもたらします。二次元ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、いくつかを解決し、すべてではないが、これらの問題8の。 天然の分離に関連する合併症を回避するために、何人かの著者は、組織溶解物4のタンパク質複合体を捕捉するために、例えばジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなアミン反応性架橋試薬（DSP）を使用します。これらの治療の溶解物は、変性およびタンパク質複合体の本来のサイズと化粧を維持しながら、SDS-PAGEによって分離することができます。しかしながら、架橋試薬ので、別の分子の近接性に基づいて、および組織溶解物中のタンパク質は、多くの自由度を有し、確率的に相互作用することができ、非特異的バックグラウンドの交差反応特に濃縮したサンプルでは、​​リンカーが高くなります。これは解釈が難しい結果につながる可能性があります。 ここでは、複合体混合物中のタンパク質集合体を分離および検出するために、マルチマー - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（マルチマー-PAGE）と呼ばれるハイブリッドBN-PAGE / SDS-PAGE法の使用を実証する。最初に、細胞溶解物をBN-PAGEを介してポリアクリルアミドゲルに懸濁する。次いで、溶解物含有ゲルを架橋試薬DSPと反応させる。疑似的に固定化され、ゲル上でわずかに分離された場合、タンパク質は非特異的に反応する可能性が低くなり、バックグラウンドの架橋剤の反応性が低下する。架橋後、ゲルバンドを摘出し、SDS-PAGEにより分離する。次いで、得られたゲルを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に典型的に関連する任意の手段によって分析することができる。この方法は、未精製の組織ライセート中の天然タンパク質複合体の分離および検出を可能にし、追加の精製またはプルダウを必要としないn個。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;epsilon;-Aminocaproic acid</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP from goat</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid assay kit</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescence substrate kit</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiobis(succinimidylpropionate)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Dry nonfat milk</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>For titration. Caustic.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>For PVDF membrane activation. Toxic.</td></tr><tr><td>Monoclonal anti &amp;alpha;-synuclein IgG from rabbit</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&#039;,N&#039;-tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>SDS solution (10% w/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 microplate reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL dounce homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic tissue homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples

単一タンパク質やペプチドを精製し、研究するための多くのよく開発された方法があります。しかし、ほとんどの細胞機能は、それらの結合は、非共有結合および精製技術により、容易に乱されるので、多くの場合、調査が困難であるタンパク質複合体の相互作用のネットワークによって行われます。この作業は、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて修飾されていない組織から天然タンパク質複合体を安定化し、分離する方法を記載しています。組織溶解物は、タンパク質がゲルに短い距離を移動するまで、電流が印加され、非変性ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル上にロードされています。移行されたタンパク質を含むゲルストリップは、次いで、切除し、共有結合タンパク質複合体を安定化アミン反応性架橋試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、と共にインキュベートします。架橋複合体を含有するゲルストリップは、次いでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにキャストされ、そしてT彼複合体が完全に分離されています。この方法は、それが安価で習得が容易であることを意味、技術と最も分子生物学者になじみの材料に依存しています。それは十分に非常に大きな複合体を分離する能力が制限され、かつ普遍的に成功していないものの、この方法は、十分に研究された複合体の多種多様をキャプチャすることができた、と関心の多くのシステムに可能性が適用されます。

この実証実験では、多量-PAGEは、全ラット脳溶解液で行われました。得られた分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜にブロットし、次いで複合体を形成することが知られているタンパク質に対する抗体でプローブしました。 図1は、2つの手段によってプロトコルの検証を示します。まず、架橋されたタンパク質が観察されたより?...

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Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K ビュー.  Michigan State University. 新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。 

ビデオ: Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

生化学

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

生物学

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

タンパク質相互作用を発見したHaloTag技術を用いたタンパク質機能の特性評価

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

要約

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Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオセンサーから解放

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

のタンパク質複合体の同定

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

タンパク質相互作用を発見したHaloTag技術を用いたタンパク質機能の特性評価

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

要約

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Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

のタンパク質複合体の同定

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

タンパク質相互作用を発見したHaloTag技術を用いたタンパク質機能の特性評価

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオセンサーから解放