csBN-MS技術の開発の中心的な目標は、様々な種類の組織および器官の形質膜でおよび全体のシグナル伝達の根源となるタンパク質複合体の組織および組み立てへの包括的なアクセスを得ることであった。csBN-MSは現在、特に膜タンパク質に関して、天然タンパク質複合体およびそのサブユニット組成の分析に対して最高の分解能の汎用性を提供しています。csBN-MS技術はげっ歯類の脳内の膜タンパク質集合体の複雑な混合物を分析するために開発されたが、それは容易に生物学的サンプルの任意のタイプの分析に適応することができる。
私たちの方法の重要なステップの1つは、ゲル片の埋め込みとスライス前の切断面への正しい位置合わせです。これは、解析の解像度を低下させるので、引き裂くか、ゲルを圧縮しないように注意し、それが切断面に傾いないことを確認してください。当社の csBN-MS 技術には、良い結果を得るには重要ないくつかの実用的なステップがあります。
これらの手順を単に記述するよりも、詳細に実行する方法を示す方が簡単です。この手順を開始するには、ポンプによって駆動される攪拌2チャンバー勾配ミキサーを使用して、線形または双曲線細孔勾配ゲルをキャストする。テキストプロトコルで概説されているように、フロントミキシングチャンバーとリザーバーチャンバーのためのソリューションを準備します。
攪拌機を起動し、前面チャンバーの溶液に30マイクロリットルのAPSと2.5マイクロリットルのTEMEDを加えます。次に、ポンプを起動し、フロントバルブを開きます。約1分後、90マイクロリットルのAPSと5マイクロリットルのTEMEDを貯留槽に加え、チャンバー接続を開きます。
ゲルを室温で少なくとも24時間ゆっくりと完全に重合させ、均質な細孔サイズ勾配を生成する。湿らせた場合、重合ゲルは摂氏4度で最大1週間直立して保存することができます。次に、0.5 と 2.0 ミリグラムのタンパク質を分離するための適切なスペースをガラスプレートの間に挿入して、ローディング スロットを準備します。
スロットは、少なくとも3センチメートル幅でなければなりません。ランニングバッファーの場合は、50ミリモルトリシン、50ミリモルビストリス、および0.01%クマシーG-250からなる立ちカソードバッファーを準備します。50ミリモルビストリからなる標準的なアノードバッファーを準備します。
約2.5ミリグラムの膜と2ミリリットルの可溶化緩衝液を氷上に1%非変性洗剤を含む。その後、130,000倍Gで11分間超遠心分離機を行う。400,000倍Gで1時間超遠心することにより、短い50%20%スクロースステップ勾配に可溶化物を濃縮する。
この後、チューブの底部からショ糖勾配を収穫し、0.05%クマシーG-250を可溶化物に加え、サンプルをゲルにロードします。テキストプロトコルで概説されているように、3段階の電圧プロトコルを使用して、摂氏10度で一晩で準備BN-PAGEを実行します。ゲルを実行した後、ガラスプレートの間に保管しながら、文書化の目的でゲルをスキャンします。
ゲル分離の品質を検査します。次に、プレートを解体し、対象の車線セクションを切除します。30%エタノールと15%の酢酸でレーンを2回30分間固定します。
埋め込み培地のサンプルを移し、軌道シェーカー上のスローモーションでゲルスラブを維持しながら、少なくとも2時間浸漬し、平衡化することができます。次いで、固定ゲルレーンを、タンパク質移行フロント、またはバンドパターンと正確に平行なセクションに切断する。取り扱いが容易になるプラスチック製のフィルムサポートに各セクションを配置します。
車線を下部に閉じられ、上部に中央に穿ゲートされたストッパー付きのオープンチューブに車線を移し、両方ともゲルセクションの上下端に正確に整列します。液体窒素に気筒を短時間浸し、凝固を迅速に開始します。透明埋め込み媒体は数秒以内に固まり、色が白くなります。
埋め込み媒体で空洞を満たし、液体窒素にシリンダーを短時間浸し、マイナス20度で数時間完全に凍結させます。分解後、プラスチックフィルムを取り外し、組み込みゲルセクションのブロックを冷却された金属シリンダーに移します。シリンダーは直径が大きく、埋め込み媒体で外側に密封される。
それは平らなサポートの上に置かれる。埋め込み媒体でシリンダーを充填し、前に述べたように完全に凍結します。円柱の反対側でこの手順を繰り返して、同一平面下サーフェスを持つソリッド ブロックを取得します。
次に、ブロックをシリンダーから取り外し、埋め込み媒体を使用して、あらかじめ冷却された金属ホルダーに接着します。金属ホルダーを冷凍機に挿入します。ホルダーは、スライス面に対して慎重に整列する必要があります。
ブロックをスライスプロセスに最適な温度に平衡化します。この収穫後、ゲルは、0.25ミリメートルのステップサイズの最終的な所望の厚さで次々とスライスし、低タンパク質結合特性を有する反応管に個別に移します。次いで、スライスは、トリプティックダイジェストおよび質量分析に供される。
このプロトコルは、低いタンパク質を発現する非ミトコンドリア膜への高分解能複合体プロファイリングの適用を拡張する。複雑な分離は、非常に少ない移行アーティファクトを有する強く染色されたタンパク質バンドを示す。質量および保持時間におけるペプチドシグナルの偏差は、偽陽性ピーク体積割り当ての非常に低い率を示す。
実行するバリエーションは、ピークボリュームデータセットの再スケールによって簡単に排除されます。得られたペプチド強度情報は、その後、相対的な豊富さの2545タンパク質プロファイルを再構築するために使用されます。タンパク質複合体の分解能に対するゲルサンプリングステップサイズの関連性は、隣接するスライスのデータセットを結合することによって評価された。
0.25ミリメートルでは、TPC1関連の複雑な集団のサイズ分離は、ウェスタンブロット分析の結果とうまく一致しています。2つ以上のスライスを結合すると、TPC1の複雑な亜集団の差別が廃止されます。最後に、分析は、よく特徴付けられる複合体に関する情報を提供し、新しいサブユニットと複雑なアセンブリの存在を示しています。
フェリチンの場合、相対的な存在量のために調整されたサブユニットプロファイルは、異なる重鎖/軽鎖ストイチオメトリを有する少なくとも3つの複雑なアイソフォームの存在を示唆している。対照的に、ニカリン-ノモ1複合体、ガンマ-セクレターゼコア複合体、およびGPI-トランスアミダス機械は、そのコアサブユニットの全サイズ範囲にわたる固定豊富比を示し、追加のタンパク質との関連から独立している。csBN-MS分析の重要なパラメータは、サンプル生化学、BNゲル品質、埋め込みおよびスライス中の適切な位置合わせ、および取得したMSデータの品質によって決定される複合体の効果的な分解能です。
csBN-MSとタンパク質およびサンプルの同位体標識を組み合わせると、異なる病態生理学的、生物学的、または発達状態における複合体学的比較が可能になります。げっ歯類の脳から膜上で行われたcsBN-MSは、サブユニット組成とその機能に関する受容体、イオンチャネル、トランスポーターの巨大な多様性を明らかにし、ネイティブ調製物における3D構造の分析に役立ちます。
