NS088206とES026892：この作品は、国立衛生研究所（NIH）補助金によってサポートされていました。 AKにAGKとディーンズ教授職にW.ユージンとリンダ・ロイド寄附も認めています。

動物やプロトコル手順の使用は、アイオワ州立大学（エイムズ、IA、USA）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、監督されました 1.混合グリア培養の成長<ol><li> 5.5インチのオペレーティングハサミで素早くの1- 2日齢の仔を刎ねる、そして氷上で50 mLチューブにすぐに頭を置きます。この断頭は、安楽死のモードであることに注意してください。 </li><li> 層流フードでは、頭蓋骨と4.5インチのストレートマイクロ解剖ハサミを使用して髄膜に小さな切開部を作ります。吻側端（鼻）に尾側端部から切断し始めます。断頭により形成された開口部を使用することによって皮膚の下に取得します。 <ol><li>切開をした後、側に半球の1を剥離。次いで、脳全体を除去するために、湾曲したまたはフックピンセットを使用します。 </li></ol></li><li> 0.25％トリプシンethylenediaminetetraacetを含む新しい50mLチューブ中脳（複数可）を浸し37℃の水浴中で15分間、酢酸（EDTA）を食べました。脳あたりトリプシンEDTAの2ミリリットルを使用してください。 </li><li>追加および除去することにより、新鮮な増殖培地（10％FBS、DMEM / F12、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％L-グルタミン、1％ピルビン酸ナトリウム、および1％非必須アミノ酸）と脳（単数または複数）を洗浄メディア。この4倍を繰り返します。 </li><li>各脳のために、増殖培地を含有する2つのT-75フラスコにプレート。そのため、チューブに脳あたりの成長培地の2ミリリットルを追加します。したがって、T-75フラスコ当たり増殖培地の8-9 mLでホモジナイズした脳の1 mLに等しくなります。 </li><li> 最大から最小にするために、異なる開口サイズのピペットと脳（複数可）を粉砕することによりホモジナイズします。脳組織は、次のピペットへの遷移を小さくなっていないことが表示されている場合。粉砕の最後に、懸濁液は可視チャンクと、明らかです。 <ol><li> 25 mlピペット、5mLのピペット、次いで10mLのピペットを順次使用。 </li></ol></li><li>各homogを渡し単一細胞培養にそれを作るために70μmのセルストレーナーを通してenous脳サスペンション。 </li><li>各ホモジナイズ脳、ステップ1.5（T-75フラスコ当たり増殖培地の8-9 mLでホモジナイズした脳の1 mL）に記載されているように、増殖培地を含むプレート2つのT-75フラスコのために。 </li><li> 6日後に増殖培地を変更し、16日目に分離するまでに成長。 </li></ol>ミクログリア細胞の単離2 <ol><li> 16日後、フラスコから成長培地を除去し、新鮮な50mLチューブに入れ。各T-75フラスコに3mlの0.25％トリプシンEDTAを加えます。オービタルシェーカー上でRTで5分間フラスコを振ります。 <ol><li>遠心分離5分間0.4×gで除去し、増殖培地と後の工程でトリプシンEDTA反応を停止するために使用します。 </li></ol></li><li> 5分間振とうした後、トリプシンEDTA反応を停止させる（新鮮または2.1.1から使用される媒体）増殖培地を4mLの最小値を加えます。 </li><li>確実にするために粉砕すること、すべてのCellsは切り離されています。 </li><li>粉砕後、単一細胞培養にそれを作るために70μmのセルストレーナーを通して細胞を渡す細胞計数を行い、次いで5分間0.4×gで細胞をスピンダウン。 </li><li>すべての100×10 6個の細胞（約15×T-75フラスコ）のために、細胞ペレットを再懸濁するために推奨培地（2％FBS、DPBS（カルシウム及び塩化マグネシウムを含まない）、1mMのEDTA）1mLのを使用。 注：すべての次のステップは、1 mLの分離に合わせて調整されています。 </li><li> 、5mLのポリスチレンチューブに乗り推奨メディアの1 mLを加え、メニスカスをマーク。 2.5 mlまでの推奨メディアを追加しても、このマークを付けます。推奨メディアを捨て、5mLのポリスチレンチューブに再懸濁した細胞を移します。 </li><li>浮遊細胞のすべての1 mLのためのラット血清の50μLを追加します。 RTで5分間インキュベートします。 </li><li>これらのコンポーネントは、プロプライエタリである成分Aの25μLと成分Bを25μLを混合することにより選択カクテルを調製します。 </li><li> 50を追加1;細胞に選択カクテルL。 RTで5分間インキュベートします。 注：純粋な文化のために、繰り返しステップ2.9（推奨しますが、必須ではありません）。 </li><li> 45秒間ボルテックスマイクロスフェア。サンプルの1ミリリットルあたりのマイクロスフェアの80μLを追加します。 RTで3分間インキュベートします。 </li><li>推奨メディアを追加することにより、ポリスチレンチューブに2.5mLの体積をもたらします。 </li><li>室温で3分間磁石にチューブを入れてください。純度を高めるために、インキュベーションを調整します。ゆっくりと、まだポリスチレンチューブ中に磁石を15 mLのチューブに推奨メディアを注ぎます。 </li><li>手順を繰り返し2.12 3回。追加の磁気インキュベーションは、純度を高めるために行うことができます。 </li><li>増殖培地の3ミリリットルを追加し、細胞カウンターを用いて細胞の数を数えます。 </li><li>従って、ポリ-D-リジン（PDL）の治療のためにコーティングされたプレートにプレート細胞。 inPDL被覆プレートに播種した後、細胞を48時間処置します。これは、細胞が分離のストレスから回復することができます。 注：チェ以前に15記載のように免疫細胞化学を用いて培養の純度をCK。 </li><li>増殖培地中のT-75フラスコ中で、主にアストロサイトを含有する陰性画分を（15 mLチューブに回収）、プレート。 </li><li> 37℃のインキュベーター中でのインキュベーションの少なくとも6時間後、培地を変更し、それはO / Nを成長させ。治療のために次の日アストロサイトを分割します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age:+from+origin+to+neuropsychiatric+disease.">Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).</li><li>Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derive+from+progenitors,+originating+from+the+yolk+sac,+and+which+proliferate+in+the+brain.">Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain.</a> Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).</li><li>Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).</li><li>Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+new+roles+for+the+synaptic+stripper.">Microglia: new roles for the synaptic stripper.</a> Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson's+disease.">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).</li><li>Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+is+genetically+implicated+in+Parkinson's+disease.">Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 302, 89-102 (2015).</li><li>Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+p38alpha+MAPK+is+critical+for+LPS-induced+neuron+degeneration,+through+a+mechanism+involving+TNFalpha.">Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha.</a> Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).</li><li>Panicker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fyn+Kinase+Regulates+Microglial+Neuroinflammatory+Responses+in+Cell+Culture+and+Animal+Models+of+Parkinson's+Disease.">Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease.</a> J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).</li><li>Moehle, M. S., West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+and+M2+immune+activation+in+Parkinson's+Disease:+Foe+and+ally?.">M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally?.</a> Neuroscience. 302, 59-73 (2015).</li><li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease.">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype.">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li><li>Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+isolation+of+murine+microglia+by+mild+trypsinization.">High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization.</a> Glia. 44 (3), 183-189 (2003).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+CNS+myeloid+cells+and+their+roles+in+neurodegeneration.">Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration.</a> Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).</li><li>Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma, ., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+cell+sorting:+a+fast+and+effective+method+of+concurrent+isolation+of+high+purity+viable+astrocytes+and+microglia+from+neonatal+mouse+brain+tissue.">Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).</li><li>Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+receptor+signaling+in+the+brain+immune+system.">Adenosine receptor signaling in the brain immune system.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).</li><li>Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+thrombin+receptor+modulates+inflammation+and+astrogliosis+to+improve+recovery+after+spinal+cord+injury.">Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury.</a> Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).</li><li>Ay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+epigenetic+regulation,+and+functional+characterization+of+Prkd1+gene+promoter+in+dopaminergic+cell+culture+models+of+Parkinson's+disease.">Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

古いミクログリアの単離方法は、種々のタンパク質に適していない限られた回復を有するウェスタンブロットによって分析し、RNAは、定量RT-PCRにより解析します。差動付着および軽度のトリプシン処理の方法は、低ミクログリア収率13、14、15を有する2つの一般的なアプローチです。列ベースのCD11bのアプローチは、低い回...

ミクログリアのc-kit + / CD45-から分化中胚葉起源のMybの非依存常駐マクロファージは、卵黄嚢1,2の血島前駆細胞をerythromyeloidれます。発生学的ミクログリアは、中枢神経系（CNS）のコロニーを形成した後、それらは、分枝形態3にアメーバからの遷移します。そのダイナミックな波及効果は、潜在的な侮辱4のための健全な脳実質を探るため、これらの成人ミクログリアは、監視者として分類されています。ミクログリアのみCNS細胞集団の約10％に寄与するものの、お互いの中のタイルへの能力は実質4、5の最大スキャンを保証します。そのようなαシヌクレイン6,7およびアミロイドβ8、又はP等の危険関連分子パターン（DAMPS）そのようなリポ多糖（LPS）9としてathogen関連分子パターン（のPAMPs）は、古典的アメーバ様活性状態への復帰及び一酸化窒素の産生、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターロイキン1βによって特徴付けられる炎症反応を促進するミクログリアを活性化（IL-1β）、IL-6、IL-12、およびケモカインCCモチーフリガンド2 9、10、11。病原αシヌクレインを蓄積してきたパーキンソン病などの神経炎症条件において、神経変性サイクルをさらにミクログリア7の古典的な活性化を促進し、より凝集αシヌクレインを放出するドーパミン作動性ニューロンの死から作成されます。周辺のマクロファージと同様に、ミクログリアはそれらに強力を与える、あるいは抗炎症性サイトカインIL-4およびIL-10の存在下で活性化する能力をも有していてもよいです神経の修復を促進し、炎症2、11の減衰IAL。別にCNSにおける免疫学的役割から、ミクログリアは、開発中のシナプスを剪定することにより、神経回路の重要な調節因子として記載されています。例えば、Cx3cr1- KOマウスは、低密度ミクログリア及び樹状突起棘、未熟シナプス、及び後進CNS 12の電気パターンの過剰につながる減少シナプス剪定を有します。 CNSの恒常性にこれらの生理学的な複雑さとミクログリアの多様な機能的役割を理解することは、神経変性疾患を標的に治療薬を探索するために重要です。 神経免疫学の分野では、in vitroの実験が原因機構研究のための大きな可能性を非常に望ましい、低メンテナンスコスト、およびより少ない時間と労働集約的であるために。 Furthermo再、細胞集団を単離する能力は、所定の条件の下で、それらの標的細胞の機能性を描くことが重要です。多数のミクログリアの分離方法が存在するが、それらは幅広い実験13、14、15のために比較的高い数値と純度を得る能力によって制限されています。例えば、分化11B（のCD11b）のクラスタは、単球、マクロファージおよびミクログリア16の一般的な表面マーカーです。 CD11bを利用することによって、磁気分離の方法は、第一〜99.5％の純度および新生児脳17あたり〜1.6×10 6ミクログリアを得たカラムベースの手法として説明しました。我々の研究室では、最近、我々はフィコエリトリン（PE）にコンジュゲートモノクローナル抗体のCD11bをタグ付けすることによってポリスチレンチューブ中で行わカラムフリーのCD11b磁気分離法15を 、開発しました。二重特異性secondaPEとPEおよびデキストラン複合体にRY抗体。一度結合し、デキストラン被覆磁性粒子は抗体複合体のデキストラン端に結合する、導入されます。最後に、ポリスチレンチューブは、ミクログリアを単離するための磁石内に配置されます。このアプローチは、新生児の脳当たりしかし〜97％までの純度を低下させるコストで〜3.2×10 6ミクログリアの収量を倍増しました。 本明細書において、我々は、迅速かつ精製カラムフリーのCD11b磁気分離プロトコル（ 図1）を実証します。 CD11bを磁気分離キットの価格は同じであるので、この改良された方法は、私たちの元の列フリー法と同様に実現可能なまま。終了時間は、細胞生存および収率を最大に重要であることができる半分に低減されます。注目すべきは、この最適化された方法により達成純度は〜&gt; 99％、当研究室が開発した15元の列のない方法で達成純度を超える顕著な改善です。最も重要なことは、CD11bを-PE光から離れるインキュベートする必要性を排除し、蛍光顕微鏡検査のために赤色チャネルの使用を可能にする、利用されません。最後に、元のCD11bの方法のように、高収率および高純度の星状細胞の画分は、この改良された方法で得られます。アストロサイトは、彼らの恒常性維持機能が病態生理学18との関係で不可欠であるという考えにつながる、CNSの中で最も多数のグリア細胞です。これらのグリア細胞は、神経膠に彼らの捜査の可能性を例示する、栄養サポートを提供し、血液脳関門を形成する神経伝達物質の恒常性の維持、傷害、神経保護に対応してグリアの傷を形成し、学習と記憶、および神経炎症などの多様な生理機能に役割を果たしています生物学19。ミクログリアとアストロサイトの形態と機能はG、共焦点顕微鏡、ウェスタンブロッティング、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を介して確認されていますriess亜硝酸塩アッセイ、およびルミネックス多重サイトカインアッセイ。このプロトコルにより提供される改良は、in vitroの実験のために重要であるすべては、ミクログリアやアストロサイトの純度、赤チャネルの利用可能性を持つ蛍光顕微鏡のより広範なアプリケーションに関連する自信を増加し、時間を節約できます提供しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EasySep CD11b Separation Kit II</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13H469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility

ミクログリアは、中枢神経系傷害への一次対応者です。しかし、多くの神経炎症の調節におけるその役割については不明のまま。ミクログリアは、炎症性ストレスを調査中で、マクロファージと同様に機能する中胚葉細胞です。古典（M1型）および代替（M2型）マクロファージの活性化にも良く、これらの表現型は、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病などの神経炎症の状態で持っている根本的な相互作用を理解するための努力にミクログリアに拡張されました。 試験管内の実験では初代ミクログリアを利用生体内環境に拡張することができる迅速かつ信頼性の高い結果を提供しています。これはin vivoでの実験を超える明らかな利点ですが、最適な純度の十分な収量を達成しながら、ミクログリアを分離することが課題となっています。現在使用されている一般的な方法は、どちらかは、低回収率、低純度、またはその両方に苦しみます。ここで、我々はDEM時間の半分の量の高い細胞の回復と強化された純度を実現し、カラムフリーのCD11b磁気分離法の改善onstrate。私たちは、神経炎症および神経変性を研究する目的のための主要なミクログリアの分離の非常に有用なモデルとして、この最適化された方法を提案します。

ミクログリアはIIは、高純度を持っているのCD11b陽性選択キットを用いて単離し初代マウスミクログリアは、上述したプロトコルを用いて単離し、単離の純度を確認するために、ポリ-D-リジンでコーティングしたカバースリップ上に播種しました。十千個の細胞をウェルあたり播種し、免疫細胞化学分析は、単離されたミク?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility at JoVE.com

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

rapid-refined-cd11b-magnetic-isolation-primary-microglia-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K ビュー.  Iowa State University. ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。 

ビデオ: Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

The Use of Magnetic Resonance Spectroscopy as a Tool for the Measurement of Bi-hemispheric Transcranial Electric Stimulation Effects on Primary Motor Cortex Metabolism

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of neurological and psychiatric disorders such as stroke and depression. Yet, the mechanisms underlying its ability to modulate brain excitability to improve clinical symptoms remains poorly understood 33. To help improve this understanding, proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) can be used as it allows the in vivo quantification of brain metabolites such as &#947;-aminobutyric acid (GABA) and glutamate in a region-specific manner 41. In fact, a recent study demonstrated that 1H-MRS is indeed a powerful means to better understand the effects of tDCS on neurotransmitter concentration 34. This article aims to describe the complete protocol for combining tDCS (NeuroConn MR compatible stimulator) with 1H-MRS at 3 T using a MEGA-PRESS sequence. We will describe the impact of a protocol that has shown great promise for the treatment of motor dysfunctions after stroke, which consists of bilateral stimulation of primary motor cortices 27,30,31. Methodological factors to consider and possible modifications to the protocol are also discussed.

This article aims to describe a basic protocol for combining transcranial direct current stimulation (tDCS) with proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) measurements to investigate the effects of bilateral stimulation on primary motor cortex metabolism.

一次運動野代謝に及ぼすバイ半球経頭蓋電気刺激効果の測定のためのツールと​​しての磁気共鳴分光法の利用

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of ...

神経科学

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

経頭蓋交流電流刺激オンライン結合による一次運動野の経頭蓋磁気刺激の効果

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

成人ラット尿膀胱からの一次ニューロンとグリアの分離と培養

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

要約

さらに動画を探す

この動画の章

一次運動野代謝に及ぼすバイ半球経頭蓋電気刺激効果の測定のためのツールとしての磁気共鳴分光法の利用

経頭蓋交流電流刺激オンライン結合による一次運動野の経頭蓋磁気刺激の効果

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリミクログリアの分離

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

マウスの主なオリゴデンドロサイトの特異的・迅速免疫分離

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

成人ラット尿膀胱からの一次ニューロンとグリアの分離と培養

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

要約

さらに動画を探す

この動画の章

一次運動野代謝に及ぼすバイ半球経頭蓋電気刺激効果の測定のためのツールと​​しての磁気共鳴分光法の利用

経頭蓋交流電流刺激オンライン結合による一次運動野の経頭蓋磁気刺激の効果

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

成人ラット尿膀胱からの一次ニューロンとグリアの分離と培養

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

一次運動野代謝に及ぼすバイ半球経頭蓋電気刺激効果の測定のためのツールとしての磁気共鳴分光法の利用

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリミクログリアの分離

マウスの主なオリゴデンドロサイトの特異的・迅速免疫分離