このプロトコルにより、in vivo特性を厳密に模倣する条件でミクログリアを培養することができます。磁気セルソーティング技術を使用して、私たちのプロトコルは、培養培地に血清を使用せずに、in vitroでわずか2日間ミクログリアを刺激することを可能にします。まず、小さなハサミを使用して、15〜20ミリメートルの矢状縫合糸に従って、首から鼻までの皮膚を切ります。
頭蓋骨と平行な大孔で先端を挿入します。両側から目まで切ります。小さなハサミで目の間を切り、頭蓋骨と脳を頭から切り離します。
2つの鉗子で、頭蓋骨を嗅球の近くでつかみ、慎重に頭蓋骨を引き裂きます。かみそりの刃で、小脳と嗅球を取り除き、脳を2つに切ります。カルシウムとマグネシウムを含まない40ミリリットルのHBSSを含むペトリ皿に脳片を置きます。
この表に従って解離混合物を調製する。12個の脳片をCチューブに移し、解離チューブあたり総重量1.2グラムにします。次に、加熱しながらCチューブをディソシエーターに置きます。
最適化された NTDK プログラムをディソシエータで起動します。20秒間遠心分離します。ピペッティングを3回行うことで機械的解離を完了します。
ストレーナーが取り付けられた4本の15ミリリットルチューブにセルを移します。カルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのHBSSでストレーナーをすすぎます。10分間遠心分離し、10ミリリットルのピペットで上清を除去する。
カルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのHBSSを慎重に加え、ペレットを再懸濁します。再度、遠心分離し、上清を除去する。ペレットを6ミリリットルのソーティングバッファーで再懸濁します。
遠心分離を繰り返し、上清を捨てる。次に、200マイクロリットルのCD11bマイクロビーズ溶液を加え、摂氏4度で15〜20分間チューブをインキュベートします。インキュベーション後、ペレットを6ミリリットルのソーティングバッファーで再懸濁します。
遠心分離を繰り返し、ペレットを8ミリリットルのソーティングバッファーで再懸濁します。次に、セパレーターのポッセルプログラムに従って、8つの列を準備します。一度に1ミリリットルの細胞懸濁液を加えることによって細胞をカラムに通す。
1ミリリットルのソーティングバッファーで、滅菌溶出プレート上でCD11b陽性細胞を溶出します。細胞を50ミリリットルのチューブにプールします。遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの冷たいミクログリア培地で再懸濁します。
CD11b陽性細胞をカウントします。細胞を冷たいミクログリア培地に再懸濁して、ミリリットルあたり650, 000〜700, 000細胞の最終濃度を得ます。懸濁液を細胞培養プレートに分注します。
プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。翌日、培地を予熱したミクログリア培地と交換し、一晩インキュベーションを繰り返します。このステップの前に細胞を刺激し、刺激の最後の3時間の間に貪食アッセイを実行します。
この表に従って、セルあたり50ビーズの比率でビーズの数を計算します。ビーズ混合物を調製する。チューブを摂氏37度の水浴中で1時間インキュベートする。
10分ごとに渦を巻きます。各ウェルに、計算された量のビーズ溶液を加え、3時間インキュベートします。このアプローチを使用して、インターロイキン-1ベータ、インターフェロンガンマ、またはリポ多糖などの炎症誘発因子による刺激後にミクログリアの食作用活性を評価しました。
6〜24時間の刺激後、蛍光Cy3ミクログリアビーズを共焦点顕微鏡で分析した。6時間後、ミクログリアはインターロイキン-1ベータとインターフェロンガンマ条件下でのみCy3ビーズを貪食し始める。24時間後、両方の種類の刺激でCy3蛍光が増加し、食作用活性の増加が強調されました。
ミクログリア培養物の純度はフローサイトメトリーによって上昇し、選別後の細胞生存率の増加を示しました。フローサイトメトリーおよびRT-qPCR細胞集団マーカーを用いて、生後8日目にマウス脳からCD11b陽性細胞を選別する前後を分析した。これらの解析により、ミクログリアのCX3CR135、希突起膠細胞のO4またはOLIG2、ニューロンのNeuNまたはシナプトフィジン、星状細胞用のACSA-2またはGFAPなど、さまざまな脳細胞集団が区別されました。
CD11b抗体を用いた細胞選別後、ミクログリアのみが得られた。カラムに懸濁液を添加しながら非常に穏やかにピペットでピペットを装着することは、目詰まりを防ぎ、機械的細胞死を避けるために重要です。この方法の後、ミクログリア刺激の効果を確認するために、西洋血液やLuminexなどのトランスクリプトームプロテオミクス、さらには免疫化学を行うことができます。
