この方法は、単一細胞レベルでのミクログリア遺伝子発現の公平な捕捉を可能にし、健康で病気の脳におけるミクログリアの分子不均一性を解明するのに役立つ。この技術の主な利点は、異なる脳領域からのミクログリアの迅速な分離のための詳細な手順を提供し、効率的に深いシーケンシングのための単一細胞RA6ライブラリの再生ベースを生成する方法を示しています。この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているとおりに必要なすべてのバッファとソリューションを準備し、氷の上で冷やします。
マウスを安楽死させ、首を切った後、小さなはさみを使って頭の皮膚を切り開いて下の頭蓋骨を露出させます。次に、矢状縫合糸、ラムドイド型縫合糸、および冠状縫合糸を切断する。鉗子を使用して組織を損傷することなく頭頂骨と足間骨の両側を引き離し、慎重に脳を中程度のAを含む解剖ペトリ皿に移動させます。
小脳と皮質葉と脳幹を分離するために55番鉗子を使用してください。その後、55番鉗子を使用して、海馬と線条体を皮質から慎重に解剖し、各組織を別々のコレクションペトリ皿に移します。まず、カミソリの刃を使用して、各脳領域を1立方ミリメートル未満の細かい部分に切り刻みます。
先端を切り落とした1ミリリットルのピペットを使用して、組織片を冷やされたDounceホモジナイザーに移します。目に見える塊がなくなるまで、6〜10フルストロークでDounceホモジナイザーのピストンをゆっくりとねじることによって組織を均質化します。次いで、解約した組織を70マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの管に移す。
各Dounceホモジナイザーとピストンを合計6ミリリットルの冷媒Aでリンスし、遠心分離のために15ミリリットルのチューブにリンスを移します。遠心分離機単細胞懸濁液は400g、摂氏4度で5分間、5時に休憩を取る。3ミリリットルのMCSを備えた磁気セパレータで、1つの大きな枯渇カラムと3つの大きな選択カラムをリンスします。
組織サンプルの遠心分離が完了すると、ピペットを出してペレットを乱すことなく上清を捨てます。RNase阻害剤を含むMCSバッファ内の細胞を再中断します。皮質および小脳からの再懸濁細胞を含む各チューブにミエリン除去ビーズの100マイクロリットルを加え、海馬および線条体から再懸濁細胞を含む各チューブに50マイクロリットルのミエリン除去ビーズを加える。
氷上のチューブを10分間インキュベートします。この後、皮質細胞を含むチューブにMCSを加え、その体積を最大2ミリリットルにし、残りのチューブに1ミリリットルまでの体積を持ち込みます。カラムがすすいバッファーの空になったら、2 ミリリットルの皮質細胞を大きな枯渇カラムに、互いのセル懸濁液を 1 ミリリットルずつ別々の大きい選択列にロードします。
次に、大きな枯渇カラムを1ミリリットルのMCSバッファで洗浄し、各洗浄に1ミリリットルのMCSバッファを使用して各大きな選択カラムを2回洗浄します。丸底FACSチューブに35マイクロリットルストレーナーキャップを介して細胞をフィルタリングします。これらのチューブを400倍gで遠心し、5分間摂氏4度で細胞をペレット化する。
その後、上清をゆっくりと注ぎ、ティッシュペーパーにチューブの端をささげます。FACSバッファーの300マイクロリットルで各チューブ内の細胞を再懸濁します。まず、マウスFC受容体ブロック試薬を5マイクロリットルずつ各チューブに加えます。
氷の上で5分間インキュベートします。次に、CD45 PEサイズ7の1マイクロリットルとCD11B BV421の1マイクロリットルを各チューブに加えます。室温でシェーカーにチューブを10分間インキュベートします。
この後、2 ミリリットルの FACS バッファーを加えて洗浄します。遠心分離機は400倍gで、摂氏4度で5分間細胞をペレットする。各チューブ内の細胞を、RNase阻害剤の1マイクロリットルとヨウ化プロピジウム0.5マイクロリットルを含むFACSバッファーの400マイクロリットルで再懸濁します。
標準的なFACS手順に従って、100マイクロメートルノズルを備えた単一の生きたミクログリアを、各ウェルに4マイクロリットルのライシスバッファーを含む96ウェルPCRプレートにソートします。簡単にプレートを渦巻き、ベンチトップ遠心分離機を使用してそれらを回転させます。図書館の準備までマイナス80度でプレートを保管してください。
先に進む準備ができたら、氷の上にプレートを解凍します。サーマルサイクラーを使用して最初の転写を行い、cDNAを生成し、テキストプロトコルで概説されているように、追加のエキソヌクレアーゼ消化ステップでcDNAを増幅します。この後、各ウェルに18マイクロリットルの磁気ビーズを加えてcDNAを精製します。
磁気スタンドにプレートを5分間インキュベートします。その後、上清を取り除き、1回の洗浄ごとに80マイクロリットルのエタノールを使用して作りたての80%エタノールでサンプルを2回洗浄します。タグメンテーションを実行するには、ナノリットルのピペット加工機を使用して、各cDNAサンプルの0.4マイクロリットルを、ライブラリ調製キットのTn5タグメンテーション試薬の1.2マイクロリットルと共に、摂氏55度の384ウェルプレートで10分間混合します。
タグ化反応を停止するには、室温で0.4マイクロリットルの中和バッファーを5分間加えます。次に、384個のインデックスと1.2マイクロリットルのPCRをサンプルに混合し、テキストプロトコルで概説されているようにライブラリを増幅します。同じ384ウェルプレートからすべての個々のライブラリを一緒にプールし、最終的なプールされたライブラリを浄化するために磁気ビーズを使用します。
本研究では、ミクログリアは、成体マウスの脳半球の皮質、小脳、海馬、線条体から分離される。調製した細胞懸濁液を顕微鏡下で調べるには、トリパンブルーとヘモサイトメーターを用いて、抗体染色を行う前にミエリン除去の収率、細胞生存率、および有効性を推定する。この時点での総細胞数は、皮質の場合は30,000以上、他の組織では5,000以上である必要があります。
細胞の90%以上は、ミエリンの破片を少なくして生存可能であるべきである。FACS マシンは、通常 CD45 低と CD11B 陽性であるミクログリアを並べ替えるために使用されます。正常な分離は、少なくとも皮質組織のために、すべての生きた単細胞から80%以上のミクログリアを生成する必要があります。
個々のミクログリアがリシスバッファーに取り込まれると、RNA が放出され、その後 cDNA に逆転転写され、23 サイクル増幅されます。キャピラリー電気泳動プラットフォームとして、フラグメントアナライザと高感度NGSフラグメントキットは、サイズ分布に関する迅速かつ正確な情報と、96ウェルプレートの各ウェルに存在するcDNA分子の量を提供します。500と5,000の塩基対の間のスミアを示し、一定の濃度閾値を超えているサンプルは、ライブラリを作るために使用することができます。
サンプルは、1細胞当たり100万個以上の生読み取りの深さに配列され、単細胞RNAシーケンシング方法論の検出力を飽和させます。マッピング率が約60%以上2の場合、1個のミクログリア細胞につき000個の遺伝子を検出できます。この分離法から生成された以前に公開されたデータは、独立した実験から再現され、配列配列された集団全体でミクログリア特異的遺伝子を検出するための感度を実証する。
単一のミクログリア転写の情報を使用すると、研究者は関心のある文脈でユニークな細胞集団を発見し、これらの新たに同定された集団の機能的関連性をさらに研究することができます。
