リンパ球トランスマイグレーションは、免疫応答の重要な特徴です。したがって、このプロトコルは、研究者が明確に定義されたin vitroシステムにおけるリンパ球の移動性を評価することを可能にするので重要である。この技術の主な利点は、グループ2の先天性リンパ球細胞、またはILC2のような最近定義された細胞における移行を誘発する効果を決定するために様々なケモカインを評価できることである。
第二の利点は、特定のケモカイン経路を遮断することを目的とした阻害剤または生物学的療法が、動物でより高価な実験を行う前に、この方法によって試験され得る点である。まず、1群につき2~3匹の動物を使用して、安楽死した卵子処理の雄マウスおよび雌マウスから肺および脾臓を切除することから始める。切除した組織を、組織の種類と動物の性別に応じて分離解離チューブに入れる。
肺組織を500マイクロリットルの肺解離培地に解離チューブに入れ、チューブを自動組織解離器に入れ、肺プロトコルを使用して解離する。合計 2 回、これらの手順を繰り返します。脾臓組織を解離するには、完全なRPMI培地を500マイクロリットルの解離器に入れ、脾臓プロトコルを使用します。
今後、滅菌技術を用いた生体安全キャビネットで働き、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して各解離組織を濾過し、50ミリリットルの円錐管に集めます。肺の均質化物を含む解離チューブを5ミリリットルの追加の肺解離培地、脾臓ホモジナートを含むチューブを5ミリリットルの完全なRPMIでリンスし、対応する組織に使用されるフィルターを通して内容物をフィルタリングする。肺組織をさらに解離するために、肺均質化物を5%の二酸化炭素を含む摂氏37度インキュベーターで15〜30分間インキュベートする。
その後、肺と脾臓の均質体、および遠心分離機の両方に完全なRPMIの5ミリリットルを追加します。上清を捨て、同性動物群の脾細胞と肺細胞を含むペレットを1つの50ミリリットル円錐形チューブに結合する。各チューブに完全なRPMIの10ミリリットルを加え、再中断します。
自動セル カウンターを使用してセルの合計数を決定します。分離バッファー内の 1 ミリリットル当たり 1 億セルにオスおよびメスの細胞懸濁液を調整し、その後 5 ミリリットルポリスチレン チューブに追加します。2つの先天性リンパ球細胞を、原稿に記載されている全細胞の2/3から分離した後、残りの細胞をCD4陽性T細胞分離手順に使用する。
CD4陽性T細胞の分離を開始するには、ラット血清をCD4 T細胞濃縮懸濁液に加える。その後、細胞サンプルに分離カクテルを加え、室温で10分間インキュベートします。渦急速な球を30秒間、細胞サンプルに加え、1ミリリットル当たり75マイクロリットルの希釈を達成する。
穏やかに混ぜ、室温で2分1/2分間インキュベートします。サンプルを約2ミリリットルの分離バッファーで最大3ミリリットルで上に置き、5ミリリットルのチューブを8チャンバーの容易な分離磁石に入れ、室温で5分間インキュベートします。次に磁石を前方にチップし、各セル懸濁液を清潔な5ミリリットルチューブにピペットします。
各チューブに1.5ミリリットルの無血清RPMIと遠心分離機を加えます。上清を注ぎ、無血清RPMIで1ミリリットル当たり1000万細胞でCD4陽性T細胞ペレットを再懸濁する。プロトコルのこの部分を開始するには、原稿に記載されているように、ILC2およびCD4陽性T細胞の両方の実験に必要なトランスウェル挿入物の数を決定する。
24ウェルプレートの中央列からピペットチップと手袋をした手を持つ同じ24ウェルプレートの上下の列に3ミクロンのトランスウェルインサートをそっと動かします。CCL17を備えた500マイクロリットルの移行培地を、24ウェルプレートの真ん中の行の井戸の1/3に追加します。CCL22を含む500マイクロリットルの移行メディアを別の1/3の井戸に追加します。
そして最後に、最後の1/3のウェルにケモカインを含まない無血清RPMIの500マイクロリットルを加える。プレートの蓋に、下の井戸に置かれた適切なトランスマイグレーションメディアの名前を明確にラベル付けします。次に、トランスウェルのインサートを様々な治療法を含むウェルに戻します。
各インサートの上部ウェルにCD4 T細胞またはILC2の100マイクロリットルをそっと加え、トランスウェルズで細胞懸濁液を上下に混ぜたりピペット化したりしないようにします。プレートの蓋に各ウェルに配置されたセルタイプを明確にラベル付けし、セルが追加された日付と時刻を書きます。すべてのセルがメディアと共に Transwell インサートに配置されるまで、プレートからトランスウェル挿入物を取り外すから、このプロセスを繰り返します。
関心のある細胞が単離されると、最も重要なステップは、特にウェルに配置されたケモカインおよび細胞タイプを追跡し、細胞を最上部のチャンバーに穏やかに加え、最後に48時間のインキュベーション中にトランスマイグレーションプレートとの不必要な接触を避けることです。プレートを5%の二酸化炭素を含む37°Cインキュベーターにそっと入れ、48時間インキュベートし、インキュベーション期間中にプレートとの接触を最小限に抑えます。インキュベーターからプレートをそっと取り外した後、中央の列からすべてのTranswellインサートを真上または下の空の井戸に取り除きます。
トランスウェルの上部および下部のウェルから、セルタイプと複製数を持つ CCL17、CCL22、またはメディアで上または下にラベル付けされたチューブにセルを収集します。1x PBSの500マイクロリットルで底の井戸をすすい、対応するチューブにそれを集め、そして上の井戸のために同じことをする。室温で5分間378回gのチューブを遠心分離する。
ピペットを使用して上清をすべて静かに取り除き、T細胞とILC2ペレットを50マイクロリットルの1x PBSで再懸濁します。細胞懸濁液の10マイクロリットルを除去した後、0.4%トリパンブルーの90マイクロリットルを加える。自動セル カウンターのセルをカウントします。
また、各サンプルについて、ミリリットル当たりの生存率と細胞数の割合を記録し、上部および下部チャンバーの治療1回あたりの細胞の総数を決定します。CCR4発現をCD4陽性T細胞とILC2の両方でフローサイトメトリーで評価した場合、男性と女性の宿主の間に違いはなかった。しかし、ILC2に基づく細胞単位でのCCR4の発現は、CD4陽性T細胞と比較して高かった。
トランスウェル装置の底部チャンバを未処理の細胞培養培地で満たしたとき、CCL22、またはCCL17を含む培地を含む培地は、培地制御条件下で移行した細胞の14%未満であった。CCL22に応答して、両方の細胞タイプは、それらが男性または女性の宿主からのものであったかどうかに関係なく、CCL22に応答した。また、CCL22は、雄ILC2においてCCL17よりも大きな移動を誘導した。
一方、CCL17は、培地単独と比較して、メスCD4 T細胞およびILC2の有意な移動を誘導した。CCL17治療は、男性CD4陽性T細胞または男性ILC2の培地と変わらなかった。最適でない条件下では、CD4細胞を含むプレートが最初の24時間室温にとどまり、その後インキュベーターに移動すると、CCL22およびCCL17に移行しなかった。
さらに、細胞の生存率は、下部チャンバ内の細胞に対して顕著に低く、最適な結果を達成するためにこのプロトコルに記載されている正しい温度および条件を使用することの重要性を示した。トランスマイグレーション手順が完了すると、メディア制御井戸と比較して関心のあるケモカインへの有意な移行が見られます。有意な移行が見られない場合、処置が正常に機能しなかったか、リンパ球が問題のケモカインに反応しないと仮定することができる。
この技術は、これらのリンパ球が広範囲の生体内治療を受けているときにリンパ球の移行を理解するために広く使用することができる。
