Name: peptide scanning-assisted identification of a monoclonal antibody-recognized linear b-cell epitope
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope at JoVE.com

The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.

モノクローナル抗体の作製<ol><li>培養物を5％CO 2補充37ºCで175Tフラスコ中の無血清培地中のRG-M56マウスモノクローナルハイブリドーマ細胞2。媒体の色は、インキュベーションの5日後に黄色になるときに、上清を収集します。 注：ハイブリドーマ細胞は、ウシ胎児血清からの抗体の混入を避けるために、無血清培地で培養しました。 </li><li> 4ºCで30分間、4500×gで上清を遠心し、細胞破片ペレットを捨てます。 </li><li> 5 mLのカラム（50％スラリーとして供給される）プロテインGアガロースの2 mLを加え、氷冷PBSの10樹脂体積（10mL）で平衡化。 </li><li>抗体上清の負荷200 mLをカラムに（ステップ1.2）とパススルーを捨てます。 </li><li>それを洗浄するために列に氷冷PBSの10 mLを加え。二回繰り返します。 </li><li>プロテインG-関連抗体を溶出するカラムに50 mMグリシン、pHが2.7の10ミリリットルを追加します。コル10倍の中和緩衝液（1Mトリス、1.5 MのNaCl、および1mM EDTA、pH8.0）を100μLを含むマイクロチューブに900μLの分画をLECT。 </li><li> -20ºCで0.03％のNaN 3で50％グリセロール中で精製された抗体を保管してください。 </li></ol> 2.構築およびシリアル切り捨てられた組換えタンパク質の発現<ol><li> （10倍のPfu緩衝液の5μL、各dNTP 0.2mMの、0.2μMのフォワードプライマー3、0.2μMリバースプライマー3、2 mMのMgSO 4を、のpET20b-1A59 3プラスミドDNA 1ngの、および2.5 U：PCR反応混合物を準備しますPfu DNAポリメラーゼの単位）。 50μLの最終容量までのddH 2 Oを追加します。 <ol><li>自動サーマルサイクラー中で実行したサンプル次のパラメータを使用して：サイクル1（5分94ºC）。サイクル2-36（30秒94ºC、30秒間63ºC、60秒72ºC）。サイクル37（7分72ºC）。 </li></ol></li><li>以下の制限酵素消化を容易にするために、PCR精製キット5を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物を抽出します。 </li><li> んで IおよびXho I制限酵素でPCR増幅DNA断片を消化し、NdeIおよびのXhoI酵素切断PET-20B（+）ベクターにこれらのDNA断片の各々を連結。 6 大腸菌 DH-5α-コンピテント細胞にコンストラクトを変換します。 <ol><li> PCR増幅DNAまたはPET-20bの1μgの消化緩衝液（20 mMトリス酢酸、10mMのMgの（CH 3 COO）2、50mMのKCH 3 COO、および1mM DTT、pHは7.9）での消化混合物を準備しますNdeIおよびXhoI制限の（+）ベクターDNA、および2 Uは、20μLの最終容量で酵素。 </li><li>優しく消化混合物を混合し、すぐにスピンダウン。制限SITの完全な切断を確実にするために、乾燥槽中で2時間、37ºCでインキュベートしますエス。 </li><li>以下のプラスミドの構築を容易にするために、PCR精製キット5を用いて、制限酵素消化DNA断片を抽出します。 </li><li>予め消化、PCR増幅DNAの100 ngの、予め消化のpET-20bの10 ngの（+）とライゲーションバッファー（66 mMトリス、5mMのMgCl 2、1mMのATP、および5mM DTT、pH7.5）を内ライゲーション混合物を準備しますベクターDNA、および10μLの最終容量で5 UのT4 DNAリガーゼ。 </li><li>優しく連結混合物を混合し、すぐにスピンダウン。水浴中で18時間、16ºCでインキュベートします。 </li><li> DH-5α-コンピテント細胞の100μLにライゲーションサンプルの10μLを入れ、30分間氷上でマイクロ遠心チューブを配置する前に、穏やかに混合します。ヒートショック7を誘導するために90秒間42ºCで乾燥浴中にマイクロチューブを入れてください。すぐに2分間氷上にチューブを移します。 </li><li>ルリア - ベルターニ（LB）ブロス（1％バクトトリプトン、0.5％バクト酵母extracの900μLを追加管にT、および0.5％のNaCl、pH7.0）に。 150 rpmで45分間振盪しながら37ºCでインキュベートします。 10分間4000×gでの遠心分離により細胞をペレット化し、上清を捨てます。 </li><li> LBブロスの50μLでペレットを再懸濁し、100μg/ mLのアンピシリンを含む予め温めたLBプレート上に各変換を広げます。 16時間37ºCでプレートをインキュベートします。 </li><li> 200μLチップを用いて、単一のコロニーをピックアップし、ゆるくキャップした15 mLチューブに100μg/ mLのアンピシリンを含むLBブロス3mLの中にそれを配置します。 150rpmで12時間振盪しながら37ºCでインキュベートします。 </li><li>各培養物からプラスミドDNA 8を抽出し、シーケンス9を確認するために、T7プロモーターとT7ターミネータープライマーを用いて配列決定します。 </li></ol></li><li>配列確認後、当社による大腸菌のBL-21（DE3）株にYGNNVコートタンパク質遺伝子の長さを変化させて、これらのpET-20bは（+）プラスミドからDNA 10ngの変換ヒートショック法7る。手順に従ってください2.3.6-2.3.8変換を実行します。 </li><li>ゆるくキャップした15 mLチューブに100μg/ mLのアンピシリンを含む3mLのLBブロスに各形質転換した大腸菌 BL-21細胞からの単一コロニーを転送します。 150 rpmで振盪しながら37ºCで培養物をインキュベートします。 </li><li>文化のOD 600が約0.6のとき25ºCに文化を冷却し、組換えタンパク質の発現を誘導するために最終濃度0.4mMになるようにIPTGを追加します。 200 rpmで振盪しながら25ºCで余分4時間培養をインキュベートします。 </li><li>マイクロ遠心チューブに培養液を1mLを転送します。 1分間12,000×gの遠心分離により細胞をペレット化し、上清を捨てます。 </li><li>マイクロピペットでピペッティングすることによって、およびダウン変性緩衝液100μL（8M尿素、20mMリン酸ナトリウム、及び0.5MのNaCl、pH7.4）中で細胞ペレットを再懸濁します。活発ボルテックスで混和します。 注：サンプルゾルutionsは今、半透明の少し粘着性、およびドットブロットハイブリダイゼーションアッセイのために準備する必要があります。 </li></ol>重複ペプチドの3設計と合成<ol><li>設計と各ドットブロット法によりRG-M56 mAbのエピトープ領域を絞り込むためにYGNNVコートタンパク質の195から338のaa領域からの10アミノ酸残基によって、その後継と重なる3シリアル20量体ペプチドを合成します。 </li><li>ドットブロット法により195から206アミノ酸のエピトープ領域を絞り込むために、次の合成ペプチドに6アミノ酸残基のオーバーラップで3 3 8マーペプチド（195 VNVSVLCR 202、197 VSVLCRWS 204、および199 VLCRWSVR 206）を設計し、合成します。 </li><li>設計と3 7マーを合成（196 NVSVLCR 202と195 VNVSVLC 201）、6量体（195 VNVSVL 200、196 NVSVLC 201、および1その隣接するペプチド上に97 VSVLCR 202）、および5量体ペプチド（195 VNVSV 199、196 NVSVL 200、それぞれ197 VSVLC 201、及び198 SVLCR 202）6のオーバーラップを有する、5、4アミノ酸残基は、最小限にしますドットブロットによるエピトープ領域。 </li></ol> 4.ドットブロットハイブリダイゼーション<ol><li> 10mg / mLの最終濃度になるようにジメチルスルホキシド（DMSO）中の各合成ペプチドを溶解させます。 注：合成ペプチドの多様な溶解性を克服するために、すべての合成ペプチドは、DMSO中に溶解されるべきです。 DMSOは完全に疎水性又は親水性ペプチドを溶解する良溶媒です。 </li><li> 2分間メタノールでポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜を浸します。 注：PVDF膜は、DMSOに耐性の100％までです。他の人はそうではないかもしれません。 </li><li>ために修飾Towbin緩衝液（25 mMトリス、192 mMグリシン、0.1％SDS、pHが8.3）でPVDFメンブレンを平衡化2分。 注：10〜20％（v / v）のメタノールの転送結果を改善するように改変Towbin緩衝液に添加することができます。 </li><li>修正されたTowbin緩衝液でクロマトグラフィー紙を洗浄します。クロマトグラフィーペーパー上にPVDF膜を配置します。修正されたTowbinバッファが次のステップに進む前に、PVDF膜表面から消失するまで待ちます。 </li><li> 10μLチップでメンブレンに各ペプチドサンプルの2μLを追加します。 10分間クロマトグラフィーの紙にPVDF膜に空気が乾燥します。あまりにも多くの拡散を避けるために、膜上にゆっくりと徐々に各ペプチドサンプルを追加します。 </li><li>穏やかに振盪しながら室温で30分間、5％脱脂乳でTBST緩衝液（0.05％（v / v）のTween-20を、20mMのトリス、および150mMのNaCl、pH7.4）中で膜をブロックします。 </li><li>膜への5％脱脂乳でTBST緩衝液1,000：1の最終希釈でRG-M56モノクローナル抗体を追加します。穏やかに振盪しながら1時間、37ºCで膜をインキュベートします。 </li><li>そう抗体を除去リューション。穏やかに振盪しながら5分間、TBST緩衝液中で膜を洗浄します。二回繰り返します。 </li><li>膜を5％脱脂乳を有するTBST緩衝液で5,000：1の最終希釈で二次抗体（ヤギ抗マウスIgG、Fcを、アルカリホスファターゼ結合）を加えます。穏やかに振盪しながら1時間、37ºCで膜をインキュベートします。 </li><li>抗体溶液を廃棄してください。穏やかに振盪しながら5分間、TBST緩衝液中で膜を洗浄します。二回洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>暗所で15分間、室温でBCIP / NBT基質溶液を有する膜を開発。信号が表示されたときのddH 2 Oで膜を洗浄することにより現像を停止します。 </li><li>膜を空気乾燥し、画像システムを用いたドットブロットの画像を取り込みます。 </li><li>画像解析ソフト3を使用して、各ドットブロットの強度を測定します。 </li></ol> 5.アラニンスキャニングと交代<ol><li> 3アラニンおよびメティを設計・合成onine置換ペプチド。 VAVSVLCR 202、195 VNASVLCR 202、195 VNVAVLCR 202、195 VNVSALCR 202、195 VNVSVACR 202、195 VNVSVLAR 202 8-merペプチド195 VNVSVLCR 202のために、アラニンで各アミノ酸残基を交換し、合成ペプチド195 ANVSVLCR 202、195、および195 VNVSVLCA 202 。 VNVSVMCR 202 SJNNV遺伝子型エピトープペプチド195を作成するために、メチオニンへのaa残基のロイシン200を交換してください。 </li><li>アラニンスキャニングおよび置換変異誘発は、ドットブロッティング実行するために第4節に従ってください。 </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest related to this report.

このプロトコルは、mAb-認識線形エピトープを同定するための迅速かつ簡単な手法を提供しています。考慮ペプチド合成およびペプチド合成の生産効率のコストを考えると、ウイルスコートタンパク質の抗原性領域は、ペプチドスキャン分析の前に直列に切り捨て組換えタンパク質を発現させることによって減少しました。 10 kDaの50の間の分子量を有する組換えタンパク質は、容易にこのシス...

免疫系では、V、D、およびJセグメントの再結合は、抗体が、病原性感染からホストを保護するために、種々の抗原に結合するための相補性決定領域（CDR）の多大な変化を作成することを可能にします。抗原に対する抗体の中和防衛は、抗体のCDRと抗原のエピトープとの間の空間的な相補性に依存します。したがって、この分子間相互作用の理解は、予防ワクチンの設計および治療用ペプチド薬剤の開発を支援します。しかしながら、この中和相互作用は、単一の抗原からの複数の抗原性ドメインにより、その結果エピトープ決意プロセスをより複雑にする抗体の複数のCDR、の両方によって影響され得ます。幸いなことに、骨髄腫細胞と個々の抗体産生細胞を融合ハイブリドーマ技術の開発は、秒細胞の恒常分割バッチを可能にしますモノクローナル抗体（mAb）として知られている網一つの特定の抗体、1。ハイブリドーマ細胞は、特定抗原の単一の抗原性ドメインに結合するために、これらの純粋な、高親和性モノクローナル抗体を産生します。確立された抗原 - 抗体、ペプチドスキャンを含むいくつかの方法の関係で、その対応するモノクローナル抗体を用いて抗原のエピトープを決定するために用いることができます。合成ペプチド技術における最近の開発は、ペプチドスキャン技術をよりアクセスし、実行することがより便利になりました。簡単に述べると、重複する合成ペプチドのセットは、標的抗原の配列に従って製造されたmAbのハイブリダイゼーションのための固体支持膜に関連しています。ペプチドスキャンは、抗体結合領域をマッピングするための簡単な方法を提供していますが、また、エピトープペプチドと抗体のCDRの各アミノ酸残基との間の結合相互作用を評価するために、残留物をスキャンまたは置換によりアミノ酸（AA）突然変異誘発を促進するだけでなく。 2、3、4を使用して、黄色のハタ神経壊死症ウイルス（YGNNV）コートタンパク質の線状エピトープの効率的な同定のためのプロトコルについて説明します。プロトコルは、mAb製剤、連続切断型組換えタンパク質の構築および発現、合成重複ペプチドの設計、ドットブロットハイブリダイゼーション、アラニンスキャニング、および置換突然変異を含みます。ペプチド合成の高いコストを考えると、直列に所望の標的タンパク質の組換えタンパク質を切り捨てるステップは、変更された、および合成ペプチドアレイドット - ブロット分析を行った前の抗原性領域は、約100〜200アミノ酸残基に絞りました。

<table><tbody><tr><td>Hybrid-SFM medium</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos&#039;s Phophate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu DNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>EP0502&amp;nbsp;</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>NdeI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>XhoI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>pET-20b(+) vector</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH-5&amp;alpha; competent cell</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL-21(DE3) competent cell</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB broth&amp;nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthio-&amp;beta;-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td><td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Agarose Fast Flow</td><td>Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 Image System</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler thermal cycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide scanning-assisted identification of a monoclonal antibody-recognized linear b-cell epitope

免疫系による抗原エピトープの同定は、ワクチン及びペプチド薬物の開発を容易にすることができる中和抗体の防御機構の理解が可能になります。ペプチドスキャンは直接的モノクローナル抗体（mAb）によって認識される線状エピトープをマッピングする簡単かつ効率的な方法です。ここで、著者らは、中和モノクローナル抗体を使用して神経壊死症ウイルスコートタンパク質の抗原認識のために直列に切り捨て組換えタンパク質、合成ペプチドの設計、およびドットブロットハイブリダイゼーションを含むエピトープ決意方法を提示します。この技術は、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜上に合成ペプチドとモノクローナル抗体のドットブロットハイブリダイゼーションに依存します。 RG-M56モノクローナル抗体により認識されるウイルスコートタンパク質の最小の抗原性領域は、6量体ペプチドエピトープにペプチドマッピングをトリミングステップ・バイ・ステップによって絞り込むことができます。また、アラニンスキャニング変異誘発、残渣サブstitutionエピトープを構成する各アミノ酸残基の結合重要性を特徴付けるために実施することができます。エピトープ部位に隣接する残基は、ペプチドのコンホメーションの調節において重要な役割を果たすことが見出されました。同定されたエピトープペプチドは、X線回折研究および機能競合のために、または治療のためのエピトープペプチド - 抗体複合体の結晶を形成するために使用することができます。

この実験の目的は、mAbを用いて、ドットブロッティングを通じてエピトープを同定することでした。迅速かつ効率的にモノクローナル抗体によって認識される抗原性領域を絞り込むために、C末端での6×His融合タグを有する完全長およびシリアル切り捨てYGNNV組換えコートタンパク質は、 大腸菌 pET発現システム10（ 図1A）から発現?...

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Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

peptide-scanning-assisted-identification-monoclonal-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K ビュー.  Academia Sinica. Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

ビデオ: Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

生化学

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

免疫・感染学

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules play important roles in surveying cells for structural and functional integrity, inducing immune regulation, and limiting immune responses to viral infections. Additionally, functional augmentation of Qa-1-restricted CD8+ T cells through epitope immunization has shown therapeutic effects in several autoimmune disease animal models, e.g. experimental allergic encephalomyelitis, collagen-induced arthritis, and non-obese diabetes. Therefore, there is an urgent need for a method that can efficiently and quickly identify functional Qa-1 epitopes in a protein. Here, we describe a protocol that utilizes Qa-1-restricted CD8+ T cell lines specific for an overlapping peptide (OLP) library for determining Qa-1 epitopes in a protein. This OLP library contains 15-mer overlapping peptides that cover the whole length of a protein, and adjacent peptides overlap by 11 amino acids. Using this protocol, we recently identified a 9-mer Qa-1 epitope in myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). This newly mapped MOG Qa-1 epitope was shown to induce epitope-specific, Qa-1-restricted CD8+ T cells that enhanced myelin-specific immune regulation. Therefore, this protocol is useful for future investigation of novel targets and functions of Qa-1-restricted CD8+ T cells.

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b molecules. Immunization with Qa-1-binding epitopes has been shown to augment tissue-specific immune regulation and ameliorate several autoimmune diseases. Herein we describe an overlapping peptide library strategy for the identification of Qa-1 epitopes in a protein.

蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Tetrameric Fluorescent Antigen Arrays for Single-Step Identification of Antigen-Specific B Cells

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and the use of four-arm, fluorescent PEG-antigen conjugates to selectively identify antigen-specific B cells through avid engagement with cognate B cell receptors. Using modular click chemistry and commercially available fluorophore kit chemistries, we demonstrated the versatility of preparing customized fluorescent PEG-conjugates by creating distinct arrays for proteolipid protein (PLP139-151) and insulin, which are important autoantigens in murine models of multiple sclerosis and type 1 diabetes, respectively. Assays were developed for each fluorescent conjugate in its respective disease model using flow cytometry. Antigen arrays were compared to monovalent autoantigen to quantify the benefit of multimerization onto PEG backbones. Finally, we illustrated the utility of this platform by isolating and assessing anti-insulin B cell responses after antigen stimulation ex vivo. Labeling insulin-specific B cells enabled the amplified detection of changes to co-stimulation (CD86) that were otherwise dampened in aggregate B cell analysis. Together, this report enables the production and use of fluorescent antigen arrays as a robust tool for probing B cell populations.

This protocol details the customizable production and use of fluorescent probes for labeling antigen-specific B cells.

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and ...

生物工学

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct functional subsets based on the cytokines they secreted: for example, IFN-&#947; for CD4 T helper 1 cells, IL-4 and IL-13 for CD4 T helper 2 cells, IL-21 for CD4 T follicular helper cells, and IL-17 for CD4 T helper 17 cells. Analysis of hepatitis B virus (HBV)-specific CD4 T cells based on cytokine secretion after HBV-derived peptides stimulation could provide information not only about the magnitude of HBV-specific CD4 T-cell response but also about the functional subsets of HBV-specific CD4 T cells. Novel approaches, such as transcriptomics and metabolomics analysis, could provide more detailed functional information about HBV-specific CD4 T cells. These approaches usually require isolation of viable HBV-specific CD4 T cells based on peptide-major histocompatibility complex-II multimers, while currently the information about HBV-specific CD4 T-cell epitopes is limited. Based on an HBV-derived peptide matrix, a method has been developed to evaluate HBV-specific CD4 T-cell responses and identify HBV-specific CD4 T-cell epitopes simultaneously using peripheral blood mononuclear cells samples from chronic HBV infection patients.

Based on a hepatitis B virus (HBV)-derived peptide matrix, HBV-specific CD4 T-cell responses could be evaluated in parallel with identification of HBV-specific CD4 T-cell epitopes.

ペプチドマトリックスに基づくHBV特異的CD4 T細胞応答の解析とHLA-DR制限CD4 T細胞エピトープの同定

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

生物学

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

要約

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結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチドライブラリを重複

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Tetrameric Fluorescent Antigen Arrays for Single-Step Identification of Antigen-Specific B Cells

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

ペプチドマトリックスに基づくHBV特異的CD4 T細胞応答の解析とHLA-DR制限CD4 T細胞エピトープの同定

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

要約

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結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Tetrameric Fluorescent Antigen Arrays for Single-Step Identification of Antigen-Specific B Cells

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

ペプチドマトリックスに基づくHBV特異的CD4 T細胞応答の解析とHLA-DR制限CD4 T細胞エピトープの同定

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発

蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチドライブラリを重複