このプロトコルは、堅牢な急性肺損傷を引き起こす肺炎の再現可能なモデルを提供します。このモデルの他の利点は、マウスの感染性ARDSまたは急性呼吸窮迫症候群を再現するために使用できることです。前述したように、このモデルは再現性が高く、急性肺損傷と治立の初期段階と後期段階を評価するために死亡率と損傷レベルを簡単に評価でき、治療戦略を評価するためのプラットフォームとして機能します。
このプロトコルは、肺損傷の診断または治療のための新しいアプローチを提供するものではありませんが、新しい治療法をテストできる信頼性の高いモデルであり、免疫学、肺疾患、感染症に関連する領域に特に有用です。この手法の利点の1つは、その再現性です。ただし、この技術を初めて実行する人は、カテーテルを気管内に挿入するのが難しい場合があります。
だからこそ、理想的には、この技術を学ぶ人々は安楽死した動物で練習を始めるべきです。まず、血液寒天プレートを加熱したシェーカーまたはインキュベーターで摂氏37度で10分間温めます。冷凍庫から新しいバクテリアストックバイアルを取り出し、バイアルが完全に解凍されるまで、摂氏37度の水浴で穏やかに攪拌して解凍します。
Oリングやキャップにぬるま湯で触れないでください。プレート上の細菌コロニーを手動でカウントするには、1倍から10〜6回目の希釈を行い、予め温めた血液寒天プレートで最後の希釈から200マイクロリットルをプレートします。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日、指定された式を適用して新しい細菌濃度を決定します。麻酔をかけたマウスを清潔で滅菌した面に置きます。マウスを切歯で吊るし、前肢をそっとテープで固定します。
首の部分を剃り、クロルヘキシジンと70%アルコールでその部分を消毒します。次に、手術用ハサミを使用して、気管を視覚化するために、1センチメートルの表在性正中線の首を切開します。脂肪組織が豊富に見られる場合は、脂肪組織を縦に丁寧に解剖して気管をイメージします。
舌を静かに外側に引き、口から20ゲージの血管カテーテルを導入し、カテーテルを気管に進めます。挿管を容易にするために、気管に穏やかな圧力をかけます。挿管後、マウスを人工呼吸器に接続して挿管を確認します。
人工呼吸器のパラメータを200マイクロリットルの潮汐量と毎分200ストロークに設定します。挿管を確認した後、マウスを呼吸器から外し、200マイクロリットルのピペット、ゲルローディングチップを使用して、血管カテーテルを通じて50マイクロリットルの細菌剤を慎重に注入します。取り付け後、マウスをマスクに再度接続して、呼吸を再開します。
マウスを人工呼吸器に30〜60秒間置いて、呼吸を監視します。ゆっくりとした呼吸パターンが観察された場合は、マウスをマスクに再度接続します。皮膚に接着剤を1滴加えて切開を閉じます。
皮膚のひだをまとめ、接着剤が乾くまで穏やかな圧力をかけます。安楽死させたマウスを仰臥位にして清潔な手術用ボードの上に置き、切歯で吊るします。マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーした後、はさみを使用して、気管を視覚化するために、小さな表面的な正中線頸部切除を行います。
20ゲージのカテーテルで気管をカニューレし、1ミリリットルのシリンジを使用して気管内に1ミリリットルのカルシウムを含まないPBSを慎重に追加します。肺を完全に拡張してから、同じシリンジを使用して液体を吸引します。.この手順を2回繰り返して、合計2ミリリットルです。
気管支肺胞洗浄液(BAL)を2ミリリットルのアリコートに移します。はさみを使用して、胸腔を開き、肺、心臓、気管を露出させます。横隔膜を慎重に解剖し、肺組織を挟まないように胸郭を取り外します。
腹部の大動脈を横断して、放血を可能にします。はさみを使用して右心室に約1〜2ミリメートルの小さな切開を行い、20ゲージのカテーテルを使用して5ミリリットルの冷たいPBSを注入することにより、肺組織を灌流します。灌流が成功すると、肺組織は白く青白くなり、PBSは腹部大動脈を通って血管内コンパートメントを離れます。
次に、肺を慎重に抽出し、気管から解剖します。あるいは、肺が組織学に使用されている場合は、20ゲージのカテーテルを慎重に挿入して、ホルマリン溶液で肺を最大25センチメートルまで膨らませます。肺が通気されたら、気管の下に長さ約5cmの3/O縫合糸を通し、ホルマリンが肺組織に留まるように2回しっかりと結びます。
肺を残りの組織からそっと切開し、10ミリリットルのホルマリン溶液を含む15ミリリットルの円錐管に入れます。BALを500G、摂氏4度で5分間遠心分離し、別のチューブ内の無細胞上清を除去します。100マイクロリットルの溶解バッファーを1分間加えて、赤血球を溶解します。
1ミリリットルのPBSを添加して溶解反応を中和します。BALを遠心分離し、上清を取り除いてから、ペレットを100〜300マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次に、自動セルカウントにより、0.4%トリパンブルーステインで細胞カウントを行います。
5ミリリットルの冷たいPBSを含む15ミリリットルの円錐形チューブで、組織から肺を静かに解剖します。解剖後、PBSから肺を取り出し、ペーパータオルを使用して乾かします。気管など、同じく抽出された他の組織から左右の肺を解剖します。
テキスト原稿に記載されているように消化カクテルを準備し、1ミリリットルの消化カクテルが入ったCチューブに肺を移します。.チューブを組織解離器に移し、肺組織の処理に標準化されたプロトコルに従ってください。解離後、10ミリリットルの冷たいPBSをチューブに加え、適切に混合します。
氷上の50ミリリットルの円錐管の上に70ミクロンのセルストレーナーを使用して、シングルセル懸濁液をろ過します。懸濁液を遠心分離し、上清を取り除きます。1mmのライジングバッファーを室温で1分間添加します。
次に、10ミリリットルの冷たいPBSを追加して溶解反応を停止し、上清を取り除きます。PBSで細胞を再懸濁し、自動細胞計数によりトリパンブルー染色による細胞計数を行います。マウスの細菌性肺炎誘発性肺損傷後、感染群は非感染対照群と比較して体重が減少した。
肺炎連鎖球菌またはSpnグループはベースラインに向かって体重を回復しましたが、肺炎桿菌またはKpn感染マウスは感染の6日後にゆっくりとした回復を示しました。BALタンパク質濃度とBALと肺の両方の総細胞数は、感染グループで著しく高かった。両方のモデルにおける炎症過程を示す代表的な組織学的切片は、接種後2日目、4日目、および6日目に取得され、Kpn感染マウスにおいて10日目でも持続的な肺胞炎症の証拠が示された。
Kpnに感染したマウスは10日目まで損傷を続け、Spnに感染したマウスは6日目までに肺の炎症を解消しました。Spn感染の6日後のマルチカラーフローサイトメトリーによる免疫細胞の状況は、顆粒球、間質性マクロファージ、単球、B細胞、およびナチュラルキラー細胞を含むT細胞の数の増加を示しました。この方法を試みる際には、カテーテルの挿入が複製可能な感染症を起こすための鍵となります。
これは、急性肺損傷の研究と解決のためのターゲットを特定するためのプラットフォームとして機能する信頼性の高い方法です。
