我々は彼らのEMのスキルのために有用な議論のためのパトリックヘイデン（マテック）、そしてロバートスミスとジョージア健康科学大学のリビーペリーに感謝の意を表します。この研究は、DADにNIDCD助成金DC010187によって賄われていた

1。 EpiAirway組織のために生物学的安全キャビネットの準備<ol><li>にバックと手袋縛ら毛で、専用の白衣を着て、層流を開始します。 5分後、片側に（ピペット、チップ、遠心チューブなど）キャビネット内の任意のツールを移動、70％エタノールで生物学的安全キャビネットの内部とサッシをスプレーし、きれいなペーパータオルで拭いてください。 70％エタノールでもう一度洗浄インテリアをスプレーし、乾燥するために残す。クリーン側にツールを移動し、エタノールの手順を繰り返します。 </li><li>キャビネット内のエアロゾルのバリアピペットチップと専用のピペッターを使用してください。個別に包装された滅菌血清学的ピペットを使用するには、廃棄包装の外側を、層流を介して接続されての最後を渡すオープン分割し、キャビネット内にピペットをスライドさせます。 </li><li> EpiAirwayインサートは、滅菌ピンセットで処理する必要があります。場所6インチ精密チップ湾曲した自己シール滅菌袋とオートクレーブに鉗子を解剖。使用可能な状態に少なくとも6一日持つのに十分な準備をします。 </li></ol> 2。 EpiAirway組織の開梱<ol><li> 70％エタノールでバイオセーフティキャビネット内の作業面をスプレーし、きれいなペーパータオルで拭いてください。再びスプレーし、表面が使用前に乾燥させます。 EpiAirwayボックスを開き、発泡スチロールや梱包材を破棄する。 </li><li> EpiAirway抗生物質フリーの保守メディア、AIR - 100 - MM ABF（MM）は、マテック独自のものですとインサート付きキットで送信されます。バイオセーフティキャビネット内で、ラベルメディアのタイプと日付で6滅菌50 mlの遠心チューブ、およびキャップを緩めます。 70％エタノールでメディアのボトルをスプレーし、キャビネット内部に開きます。各チューブに新しい滅菌血清ピペットを用いて各チューブに分注しMM 25mlのは、4℃でキャップ、および店舗を締めます毎日MMの新鮮なアリコートを使用してください。 </li><li>カルシウムとマグネシウムと1の新鮮なボトルXダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D - PBS）を使用して、上記2.2を繰り返します。カルシウムとマグネシウムを含まないD - PBSを用いて再び繰り返す。 4ですべてのアリコート℃にて保存してください。 </li><li> EpiAirwayインサートAIR - 100℃の固体培地含有アガロースの上で4℃、24ウェルプレートに到着、および使用のための6ウェルプレートに配置する必要があります。エタノール耐性マーカーを使用して、日付と説明をそれぞれのプレートにラベルを付けます。各ウェルに4℃EpiAirwayのMMの代わりに1ミリリットル。その包装、70％エタノールでスプレー、およびバイオセーフティキャビネット内の場所から輸送プレートを取り外します。テープを外し、プレートを開きます。オートクレーブ鉗子を使用して、EpiAirwayインサート上の湿ったガーゼを取り除く。 </li><li> 6ウェルプレートのウェルにアガロースからそれを解放を支援するためにねじる運動を用いてオートクレーブピンセットで挿入、および場所をピックアップ。いくつかのアガロースは、トランスポートプレートの温度が周囲に増加し、特にとして、インサートに付着する場合があります。注意深くインサートからアガロースを削除するには、滅菌綿棒を使用してください。メンブレンに触れないようにしてください、と空気の泡が挿入下にトラップされていないことを確認してください。 5％CO 2で加湿37℃のインキュベーター内にプレートを置きます。 </li><li>共培養を開始する前に、インキュベーターで平衡化する組織のための少なくとも24時間を許可する。 </li></ol> 3。 EpiAirway組織のメンテナンス<ol><li>オートクレーブ鉗子を使用して、挿入をピックアップし、優しく組織にカルシウムとマグネシウムを予め温めておいたD - PBSを200マイクロリットルをピペッティングし、挿入を揺らし。角度で挿入を傾けて、挿入物の下部にある膜を保持するプラスチック製のリングと照らし合わせて滅菌P1000のピペットチップを置きます。組織には手を触れないでください。 D - PBSで洗浄し、標識滅菌クライオバイアルに配置吸引除去する。サンプルは-20℃で凍結し、後日ムチンおよび/またはサイトカイン発現についてアッセイされ得る。 </li><li>吸引し、新鮮なMMの1ミリリットルで置き換えることにより、毎日の基礎MMを変更します。各ウェルの新たな障壁のピペットチップを使用してください。一晩10％の漂白剤と使用されているメディアを扱い、廃棄する。 </li></ol> 4。 EpiAirway組織の接種<ol><li>チョコレート寒天培地上に凍結グリセロールストックから分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHi）の新鮮な培養からストリーク。加湿した5％CO 2インキュベーターで一晩成長する。 </li><li>翌日、約0.7のOD（600 nm）のカルシウムとマグネシウムで予め温めておいたD - PBSでNTHiの単一コロニーを懸濁します。積極的に前に光学密度を測定する渦。 NTHiのmlあたり光学密度の関係は、コロニー形成するユニット（CFU / ml）を0.2のODは、（600 nm）を約1.0 × 10 8 CFU / mlを等しいということです。したがって、0.7のOD（600 nm）は約3.5 × 10 8 CFU / mlである。このアルゴリズムは、接種する前に、各NTHi株に対して検証する必要があります。 </li><li> EpiAirway組織は、AIR - 100は0.6 cm 2および0.4ミクロンの膜の表面積とインサート上で成長されています。組織は、〜1.0 × 10 6〜8.0 × 10 5で構成されている&lt;/&gt;のセルのSup。 12 -このため、1.0 × 10 7 CFUの接種は、約10の感染の多重度に対応しています。接種するために、3.1のように各EpiAirwayインサートを洗い流した後、バイオセーフティキャビネット内の各EpiAirwayインサートの先端面に4.2で調製した細菌懸濁液28マイクロリットルを追加。基礎MMを接種しないでください。インキュベーターに各プレートを返します。 </li></ol> 5。 NTHi接種の定量化<ol><li>消毒に0.1％ゼラチン（PBS - G）、オートクレーブでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を調製します。各チューブに滅菌PBS - Gの接種、アリコート900マイクロリットルのOD（600nmで）に基づいて、目的の1:10希釈液とラベル滅菌済み1.5 mLエッペンドルフチュー​​ブ。 </li><li>接種NTHiを列挙するために必要なチョコレート寒天プレートの数を決定します。一時間のために上半分で休んでプレートの底に逆さまに空気のインキュベーター内でこれらのプレートを置きます。これは、NTHiのドロップメッキを容易に、37〜暖かい両方にプレート℃、表面が乾燥することができます。 </li><li> 4.2から最初の試験管に細菌懸濁液100マイクロリットルを添加することにより接種のシリアル1:10希釈を開始します。前に次を作る〜5秒間激しくボルテックス各希釈を。各希釈液の半分プレートを使用して、予め温めておいたと表面乾燥チョコレート寒天プレート上に10マイクロリットルのアリコートをドロップします。 5〜6個の10マイクロリットルのアリコートは、一緒に実行せずに各100mmプレートの半分に収まることができます。ときは加湿37の上下を逆に乾燥し、場所℃でCO 2インキュベーターで一晩。 </li><li>翌日、各ドロップ15〜30の別個の植民地を持っている希釈液をカウントし、NTHiの実際の実行可能な接種に戻って計算することによって、CFU / mlを決定する。 </li></ol> 6。 NTHiとの長期共培養<ol><li> 24時間ごとに、3.1のようにインサートを洗う、その後は-20細菌や凍結の同じ系統·今後の分析のための標識クライオバイアルにCを接種されている各組織の洗浄液をプール。これらのサンプルは、ドットブロットまたはELISA法によるサイトカインの発現のためのムチンの存在を検定することができる。また、mRNAおよび定量PCRのために伐採することができる組織は、目的の遺伝子に行うことができます。 3.2のように毎日の基礎MMを変更します。共培養の期間中継続する。 </li></ol> 7。 EpiAirway組織の収穫<ol><li>カルシウムとマグネシウムを含まないD - PBSでサポニンの新鮮な1％の溶液を調製、ろ過滅菌し、37℃に温めて</li><li> 37℃にカルシウムとマグネシウムなしで、MMとD - PBSの別の50 mlチューブを温める</li><li> 5.1のように希釈チューブを準備するだけでなく、インサート番号とNTHi株で標識インサートごとに空の滅菌済み1.5 mLエッペンドルフチュー​​ブ、。 </li><li> EpiAirwaysが付着し、内面化の両方の生物を含むトータル細胞関連細菌、いずれかの、または唯一の内部化細菌のために収穫することができる。 </li><li>ドロッププレート細胞関連または5.2のように空気インキュベーターで一時間NTHi、ラベルや乾燥を侵略するために必要なチョコレート寒天プレートの数を決定します。 </li><li>総細胞関連細菌を回収するために、カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBSの200マイクロリットルで三回EpiAirwaysの頂端表面を洗い流した後、インサートを傾けて、基底膜から残りのMMをすすぐ。最初の洗浄は、後で分析するために凍結することができます。以下の洗浄を捨てる。 </li><li>新鮮な6ウェルMMなしプレート、および各組織の頂端表面上に7.1から滅菌1％サポニン溶液のピペット250マイクロリットルで洗浄したインサートを配置。 10分間インキュベーターに戻す。 </li><li>インキュベーターから削除、および滅菌P1000ピペットチップを使用して、使用して往復運動、インサートの端から組織を除去するために円を描くように続いて膜から組織をスクラブ。大口径の滅菌P1000のピペットチップを使用して、7.3で作成した空のラベルが付いたチューブにサスペンションを配置。インサートの頂端表面上にカルシウムやマグネシウムを含まないD - PBS 250マイクロリットルを追加。 </li><li>収穫する、残りの組織があるかどうかを判断する倒立位相差顕微鏡を用いてインサートを調べる。必要に応じて、大口径の滅菌P1000のピペットチップを使用して7.8からチューブに、この懸濁液を追加し、別の滅菌P1000ピペットの先端で再びスクラブ。カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBSを用いて1ミリリットルにチューブの合計量をもたらす。 </li><li> 1分間トップスピードで激しくボルテックス細胞懸濁液。 26ゲージの針を備えた滅菌1 mlシリンジを使用して、針を通して注射器に、懸濁液を吸引除去する。ゆっくりと泡を作成しないように注意しながら、針を3回通過サスペンションを渡します。精力的に再び1分間ボルテックス。 </li><li> 7で調製した最初の希釈チューブに大口径のピペットチップ、場所懸濁液100マイクロリットルを使用する。3。 5秒間激しくボルテックスして、シリアル1:10希釈を行います。ドロッププレート表面乾燥チョコレート寒天プレート上に所望の希釈液。 </li><li>のみ内部化された細菌を回収するために、カルシウムまたはマグネシウムなしで、D - PBSを200マイクロリットルを各インサートを3回洗浄。最初の洗浄を保持して凍結する。 100マイクログラム/ mlの最終濃度に予め温めておいたMMに硫酸ゲンタマイシンを追加。収穫されるインサートごとにメディアの1.5 mlを調製。ゲンタマイシン含有MMと基底MMを交換し、頂端表面にゲンタマイシン含有MMの300マイクロリットルを追加。一時間に戻って、CO 2インキュベーターにプレートを置きます。 </li><li>頂端表面からゲンタマイシン含有MMを削除して、カルシウムとマグネシウムなしで予め温めておいたD - PBSでインサートの先端面と基底膜を洗浄。 7.7から7.11のように進んでください。 </li></ol> 8。代表的な結果： NTHiによる5日間共培養した後、（A.）感染していないEpiAirway組織と（B.）組織の走査電子顕微鏡写真を図1に示されています。NTHiによる長期共培養は根尖に重大な損傷が発生しない組織、EpiAirwayモデルの有用性を強調。組織内部の時間の経過とともに定量化内部化された細菌の数を示すグラフを図2に示されています。両方の結果は非常に再現性がある、NTHi宿主-病原体を研究するための人間の上気道のin vitroモデルにおける EpiAirway組織に一貫性と生物学的に関連すること相互作用。 <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。EpiAirway組織の走査型電子顕微鏡。 A.非感染制御の組織。 NTHiと共培養の五日後にB.組織。頂端表面に有意な損傷は、感染した組織で観察されていません。 <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。NTHiの数はEpiAirwayの共培養中に経時的に内面化。株をR2866は、各指定された時点で内部化された細菌のために伐採約1.0 × 10 7 CFU /インサート（0日）、で接種した。バーは、n = 3が、少なくとも二重に複製表します。エラーバーはSDです。

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	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このメソッドは、空気 - 液体界面における原発性ヒト呼吸器組織の生物学的に関連する背景に長期的な宿主 - 病原体相互作用の調査が可能になります。ここでは、感染微生物としてNTHiを使用しましたが、時間をかけて許容細胞毒性を導入しない任意の細菌の相互作用は、この方法で定量することができる。 EpiAirwayモデルはまた、ウイルス、薬物、または化学物質に影響を与える人間の上気?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th></tr><tr><td>サポニン</td><td>カルビオケム</td><td> 558255 - 25GM </td><td>カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBS中の1％は、滅菌フィルタ</td></tr><tr><td> 1 Xダルベッコのカルシウムとマグネシウムとリン酸緩衝食塩水</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 Xダルベッコのカルシウムまたはマグネシウムなしでリン酸緩衝食塩水</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway抗生物質フリーの組織</td><td>マテック</td><td> AIR - 100 - ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway抗生物質フリーのメンテナンスのメディア</td><td>マテック</td><td> AIR - 100 - MM - ABF </td><td>キットに同梱</td></tr><tr><td> 10Xリン酸緩衝食塩水</td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> 1Xに希釈して使用前に</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td> JTベイカー</td><td> 2124〜01 </td><td> 1 X PBSおよびオートクレーブで0.1％の最終濃度に追加</td></tr><tr><td> Difco社製GCミディアムベース（チョコレート寒天培地） </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> 500ミリリットルのddH 2 O、60℃まで冷却のオートクレーブ36グラム</td></tr><tr><td> BBLヘモグロビン（チョコレート寒天培地） </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> 60〜クールな500ミリリットルのddH 2 Oでオートクレーブ10グラム、° Cと上記のGC培地のベースとミックス</td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleXの濃縮（チョコレート寒天培地） </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> ° Cおよび再水和IsoVitaleX 10mlを追加し、チョコレート寒天プレートに注ぐ55のGC培地のベースとヘモグロビンの混合物を冷却する</td></tr><tr><td>解剖鉗子、先端の細い、湾曲した</td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td>セルフシール滅菌袋</td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン、10 mg / mlの</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 519Z </td><td>殺すゲンタマイシン用EpiAirwayのMMに10マイクロリットル/ mlを追加</td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

2、分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHi）は呼吸器粘膜1の再発や慢性感染症を引き起こす可能性が人間に適応したグラム陰性細菌である。これらの生物が呼吸組織上および内部に生存するメカニズムを研究するために、細菌やヒトの細胞の成功を長期的な共培養を行うことができるモデルが必要となります。我々は、気液界面、EpiAirwayモデル（マテック、アッシュランド、マサチューセッツ州）に上げ、一次ヒト呼吸器上皮組織を使用してください。これらは、タイトジャンクショ​​ン、繊毛とnonciliated細胞、ムチンを産生、および感染症に反応してサイトカインを産生する能力を保持する杯細胞を含む非不死化、高分化型、3次元の組織です。 人間の上気道の in vitroモデルで 、この生物学的に関連は多くの方法で使用することができ、この方法の全体的な目標は、時間をかけてNTHiと定量細胞に関連すると内面化細菌とEpiAirway組織の長期的な共培養を行うことです。 。同様に、共培養感染のムチン産生とサイトカインプロファイルを決定することができます。このアプローチは、多くの現在のプロトコルで、既存の方法を改良したものを長時間3を介して細菌感染をサポートすることができるではないヒト細胞の水中単層またはトランスウェル培養を、使用してください。生物が覆っている媒体に複製することができるたとえば、、これは実験を逮捕、細胞毒性と宿主細胞の損失の許容できないレベルになることがあります。 EpiAirwayモデルは長期的な宿主 - 病原体相互作用の特性評価が可能になります。さらに、EpiAirwayのソースではなく不死のラインよりも、正常なヒト気管気管支細胞であるため、それぞれの構造でと機能4の両方に実際の人間の上気道組織の優れた表現です。 この方法の場合は、EpiAirway組織は、配信前に2日間の抗微生物及び抗真菌化合物の離乳オフ、およびすべてのプロシージャは抗生物質フリーの条件下で行われています。細菌および初代ヒト組織の両方が同一の生物学的安全キャビネット内で使用されている、と長時間共培養しているので、これは、特別な考慮が必要となる。

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

このメソッドは、EpiAirways、気液界面で成長させた初代ヒト呼吸器上皮組織、生物学的に関連するとの共培養の拡張細菌の特性評価を可能に<em&gt; in vitroで</em&gt;モデル。アプローチは、長期の共培養に従順であるすべての微生物を使用することができます。

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K ビュー.  Mercer University School of Medicine. このメソッドは、EpiAirways、気液界面で成長させた初代ヒト呼吸器上皮組織、生物学的に関連するとの共培養の拡張細菌の特性評価を可能に in vitroでモデル。アプローチは、長期の共培養に従順であるすべての微生物を使用することができます。

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

免疫・感染学

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル<em&gt;インビボ</em&gt;炎症反応の長期モニタリング

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

ショウジョウバエ蛹内炎症性細胞動態の長期的な体内の追跡

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...