本研究は、（Z01 AG000746-08）とファンコニ貧血研究基金を老化にNIH、国立研究所の学内研究プログラムによって部分的にサポートされていました。

掘る-TMPの調製<ol><li> 50mgの4&#39;-クロロ-4,5-の（0.18ミリモル）&#39; 、8-トリメチルソラレンおよび590 mgの乾燥した25mLの丸で4,7,10-トリオキサ-1,13- tridecanedi -アミン（2.7ミリモル）の混合窒素下-bottomフラスコ。 12時間、10mLのトルエン及び還流を加えます。減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去します。 <ol><li>シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製。クロロホルム、メタノール、及び28％アンモニア溶液（1：1：0.5 9）でカラムを溶出します。減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させ、そして回復純粋4「 - [N-（13-アミノ-4,7,10- trioxatrideca）]アミノメチル-4,5」、8-トリメチルソラレンのように粘性の淡黄色液体。 </li><li>でジゴキシゲニンNHSエステルを、5mgの（0.008ミリモル）と8-トリメチルソラレン - [[N-（13-アミノ-4,7,10- trioxatrideca）]アミノメチル-4,5 &#39;4の5.5ミリグラム（0.012ミリモル）の混合窒素下で乾燥した丸底フラスコ。 0.5mLの無水N、N-ジメチルホルムアミドを加える（DMF）AND 3.4トリメチルアミンμL、18時間50℃で撹拌しました。 </li><li>減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去します。 </li><li>ジクロロメタンの最小量の残留物を溶解させます。固定相としてのシリカゲルと水平取薄層板の下部に2μLスポットに溶液を適用します。クロロホルムで分取TLCを実行：メタノール：28％水酸化アンモニウム（8：1：0.1）。 </li><li>垂直エッジを除いてプレートをマスクし、短波長UV 254 nmのランプを有する生成物のバンドを識別する。スパチュラを用いてプレートから製品をこすりとクロロホルムを使用して、純粋な生成物を単離：メタノール：28％水酸化アンモニウム（8：1：0.1）の混合物。 </li><li>減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去。 50％エタノール1mL中の残留ペレットを溶解：すべての溶媒が蒸発するまでH 2 Oは、（約3時間）、遠心エバポレーターで50μLの1.5 mLチューブ（〜20のアリコート）における一定分量及び乾燥に分配します。 </li><li>遠心蒸発器で再びH 2 O及び乾燥：50％EtOH中の200μLの各アリコートを再溶解。 50％エタノール200μlに再度各アリコートを溶解：H 2 O、長期保存のために-20℃で遠心蒸発器と店舗ペレットで乾燥。 </li></ol></li><li> H 2 Oで1準備：H 2 O中に溶解掘る-TMPの100希釈し、250 nmでODを測定し使用するために、50％エタノール50μlにペレットを溶解します。掘る-TMPの吸光係数は25,000です。 -20℃で保存した場合に解決策は、約一ヶ月のために安定しています。各使用前に250 nmでODを測定することにより、濃度を確認してください。 <ol><li>ストック濃度を計算する：ABS×100×10（μMで）6 / 25,000 =濃縮。典型的には、ストック溶液は、約3mmです。培地に添加エタノールの体積を最小限にするために、この範囲内であることが重要です。 </li></ol></li></ol> 2.レーザーローカライズのDig-TMPのICL <ol><li> PESRSの窒素レーザー（337nm）を有する共焦点顕微鏡でrformレーザ局在は、365nmの線を放出し、0.7ナノワットの電力で、10Hzで3ナノ秒パルスを発射染料セルを通してポンピング。 </li><li> 35ミリメートルのガラスの側に縦のマークを作るマーキングペンで細胞培養皿底。皿の側にブラックストライプが交差の一方のアームの最上部にあるように、ダイヤモンドペンを用いて培養表面上のガラスの中心に十字を傷つけます。また、細胞を同じ焦点面になるようにクロスは、ガラスの成長表面上にマークされています。 </li><li> 70％のEtOHすすぎでマーキングした後、プレートを滅菌します。細胞を播種する前にドライ。 </li><li>クロスでのプレートの細胞（例えばHeLa細胞またはU2OSなどの標準的な実験室株）は1日か2日前に培養皿をマーク。細胞は活発に分裂し、実験の日に百分の50から70の合流する必要があります。均一ラベルDNAを1μMの5-クロロ-2-デオキシウリジン（CldU）で24時間インキュベートします。 </li><li>加えます20μMの最終濃度まで細胞培養培地へのH 2 O：50％EtOH中のDIG-TMP。 37℃にメディアを持参してください。掘る-TMPを平衡化させるために30分間インキュベーター内で細胞や場所にわたって培地（37℃、5％CO 2）に変更。 </li><li>細胞をインキュベートしている間、レーザがアクティブである視野のX / Y座標を確立します。レーザは、水平および対角線に沿ってミラー化スライドガラスをエッチングするためにソフトウェアによって指示された製造業者の較正手順に従います。 2行はレーザーがターゲットを打つことが可能なフィールドの境界を画定します。 </li><li>顕微鏡ステージ上に、制御されたCO 2及び湿度37°Cで、環境チャンバ内にプレートを置き、十字の交差点で60X油目的に焦点を当てます。 </li><li> 、ソフトウェアでシェイプツールと研究者によって確立されたROIに365 nmのレーザービームを向ける3のストライプを形成するために＆＃181;0.6μmとし、MX。 ROIの輪郭が十字の交差点のすぐ近くに位置する細胞の核内にカーソルが配置されています。核を介してレーザ途中を標的とするように、Z焦点面を調整します。 350〜370ナノメートルの範囲でレーザーを使用してください。 405nmのレーザーは、架橋19を誘導することができません。 注：我々は、微分干渉コントラスト（DIC）画像で核質と区別することができる核小体、外核質領域にROIを見つけます。 </li><li> （セルが暗くなり、その後消え）細胞を抹消するのに十分なレベルに電力設定値を増加させることにより、レーザの焦点及び活性を検証します。これは、顕微鏡を介して、次いで、カバーガラスを通って細胞内へのレーザのための妨げられない光路のために重要な診断です。 <ol><li> （これは各レーザー/マイクについて経験的に決定されなければならソラレンとICL誘発DDRを活性化させるのに十分なだけに電力設定を下げroscope組み合わせ）。 （γ-H2AXの形成によって監視）ソラレンの不在でDDRを活性化しないレーザー強度設定（ここでは1.7％）を使用します。 注：これは重要な決意であり、レーザ光源や光パス内のコンポーネントが変更された場合に設定が調整を必要とするかもしれません。 GFPの蓄積に従う迅速レーザソラレンストライプに（秒）募集されているが、単独のレーザに露出ROIしないどちらもそのようなXPC又はFAN1として修復タンパク質を、タグ付けされました。数分は他人のために必要とされる一方、DDRのいくつかのタンパク質は、数秒以内に表示されます。関心のある各タンパク質のための時間経過の決定を行う必要があります。また、レーザに露光されなかった細胞で応答するタンパク質のないストライプが存在しないことに注意してください。 </li></ol></li><li>フィールド内のすべてのセルは、クロスの交差点の近くに滞在し、新しいフィールドにプレートを移動標的にされた後。 </li><li> determに設計された実験では、インター病変距離の分布は、交差点の周囲20-25フィールド（4-5細胞/フィールド）レーザに細胞をさらすINE。ローカライズのICL近傍の複製パターンを分析するために、レーザ発射後、10μM5-ヨード-2-デオキシウリジン（IDU）で細胞をインキュベートします。 注：IDUとのインキュベーションの時間はある程度任意です。我々は（下記参照）を20分と短く、60分ほど長く使用してきました。より長いパルス（数時間）は、多くの場合、このように画像に単一フォークの進行状況を機会を失って、合体複数の複製路につながります。いくつかの実験において、CESは、複製トラクトのパルス標識続いて、DIG TMPへの曝露の前に標識DNAを均一するために24時間CldUで標識されます。 </li></ol> 3.細胞の収穫とDNAの繊維の延伸<ol><li> 、ステージからプレートを取り外し培地を除去し、そしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。 PBS溶液を除去。商用トリプシンの10μLのドロップを置きますガラス表面の中央に十字の交差点に/ EDTA溶液。 </li><li>室温（RT）で3~4分間インキュベートした後、ピペットチップに剥離した細胞とのトリプシン溶液を描きます。トリプシンを中和する必要はありません。 </li><li>シラン処理ガラス顕微鏡スライドの一端に細胞とトリプシン/ EDTAの滴を置き。溶解細胞および0.5％SDS溶液10μLを添加することによってDNAを放出し、プールの周囲を乾燥させ、ピペットチップで穏やかに混合し、室温で3~4分間インキュベートします。 </li><li>スライドを傾け20ºと液体は最後まで実行することができます。 DNA繊維を流れる液体の流体力学的な力によって延伸/伸長されます。スライドを空気乾燥（約10分）とすると3に修正：10分間、1つのメタノール/酢酸。再び定着液と空気乾燥からスライドを削除します。この時点で、彼らは、-20℃で、70％EtOH中で無期限に保存することができます。 70％エタノールから除去して、NEの前に空気乾燥さ許可XTステップ。 </li><li> PBSでスライドを洗浄し、次いで、室温で1時間、2.5 M HCl中で変性。この治療法は、DNAが抗体に組み込まハロゲン化核酸塩基がアクセスできるように脱プリン化します。 </li><li> 0.4 Mトリス-HCl、pH7.4中のスライドを中和します。 5分ごとにPBS / 0.5％のTween-20（PBST）で二回洗浄します。 </li><li>ブロックは、PBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）および10％ヤギ血清をスライドします。スライド上に均一にブロッキング溶液を広げ、室温で1時間インキュベートしパラフィンで穏やかにスライドを覆います。 </li><li>各スライドをラット抗ブロモデオキシウリジン（具体CldUが検出）一次抗体をブロッキング溶液で200倍希釈1のピペット100μL。スライド上に均一に希釈を広げ、室温で1時間加湿チャンバー内でインキュベートするパラフィルムで穏やかにスライドを覆います。パラフィルムを外し、5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li>各スライドのブロッキング溶液中：（100 1）ヤギ抗ラットアレクサフルオロ647希釈のピペット100μL。カバーパラフィルムで軽くスライドし、RTで45分間インキュベートします。 5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li> ：200希釈（1時40分）マウス抗ブロモデオキシウリジンは（LDUとCldUを検出するこの二重特異性は、インキュベーション前にラット抗BrdUのによりCldUの遮断を必要とする）一次抗体およびウサギ抗DIG抗体（1のピペット100μL ）各スライドのブロッキング溶液です。パラフィルムで穏やかにスライドをカバーし、室温で1時間加湿チャンバー内でインキュベートします。 5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li> （1：100）、ヤギ抗マウスアレクサフルオロ488およびc（1：5,000）で希釈のピペットで100μLのヤギ抗ウサギプローブ（ 例えば 、Qドット655）は、各スライドのブロッキング溶液です。パラフィルムで軽くスライドを覆い、室温で45分間インキュベートします。 5分間ずつPBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li>ペーパータオル上に過剰PBSTを排出します。各スライド上に退色防止封入剤の50μLを追加し、カバースリップでカバーしています。画像や店舗用-20℃で48時間以上いいえ。 </li></ol>蛍光顕微鏡による4.ファイバーイメージング<ol><li> FITC、Cy5でおよびQドット655の検出が取り付けられ、完全に電動フィルタホイールを有する倒立顕微鏡上で63X対物レンズを介して画像取得を行います。励起フィルター425 nmであり、発光フィルターは、発光ピーク20を中心とする20nmのと655 nmです。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

レーザーローカライゼーション技術は、明視野顕微鏡で表示されている核を有する接着細胞を使用する必要があります。我々は、ポリリジンまたはコラーゲン、またはより複雑な混合物のような細胞接着製剤でガラス表面に、例えば一次リンパ球、又はAD293などの緩く付着培養細胞などの非接着細胞を、取り付けることを試みました。これらの治療は、表面に細胞を結合することができるが?...

DNAはまた、それはまた、酸化的代謝によって産生される内因性ラジカル種に襲われるなど、放射線、紫外線、環境有害物質、燃焼生成物、などの外因性物質から一定の攻撃の下にあります。これらのすべては、化学的または物理的DNA 1の完全性を破壊する可能性があります。ゲノムにおける摂動は、病変の修復に関与するタンパク質とマイクロRNAのない場合は、何千、何百ものDNA損傷応答（DDR）、リクルートおよび翻訳後修飾カスケードを活性化することができ、細胞周期、アポトーシス、老化、および炎症経路の調節2。 DDRについての私たちの情報のほとんどは、DSBは用いた研究から来ています。これは、生きた細胞3のゲノムDNAに、配列特異的な休憩を含め、休憩を導入するための技術の利用可能性に大部分です。また、propensit免疫蛍光法によって表示することができDDRタンパク質、巣を誘導する切断のyは、タンパク質の応答の動態と要件を識別するために非常に役立っています。 DDRを研究するための重要な技術の一つは、生きた細胞4の核に「関心領域」にDSBのストライプを指示する（ROI）のレーザービームを使用ボナーや同僚、によって導入されました。実際に、彼らはDDRのタンパク質が免疫蛍光法によって識別することができたに長い焦点を作成しました。これは、レーザ曝露された細胞におけるリン酸化ヒストンH2AX（γ-H2AX）の強力なストライプのそれらの実証によって示されました。それ以来、レーザーアプローチは、DSBはによって誘発されるDDRの多くの研究で採用されてきました。パワフルで人気の、そして劇的な免疫蛍光画像のソースが、病変のアイデンティティを心配することなく、観察可能な結果を​​生成するために、ほとんどの実験ではレーザー強度を調整することに留意すべきです密度、または間隔。確かに、これらの見積りを行うことが困難な場合があります。したがって、それらは主にレーザー5によってDNAに導入された病変の多数にもかかわらず、無視されます。これは、文献6には多くの矛盾に貢献しています。 DSBは対照的に、DNAのほとんどの化学修飾は、DDRタンパク質の離散病巣の形成を刺激しません。これは、病変の周波数の私達の現在の理解の光の中で重要です。培養中のヒト細胞がS期7、8、9中大きく形成され、細胞周期あたりのような多くの50のDSBを招くと推定されています。少数の非増殖細胞に形成されています。これは、セル/ 1日目、10あたり数万である核酸塩基の損失または変更イベントの数とは対照的です。したがって、我々は、最大で約知っていますDDRは比較的まれであるイベント、および集計にはるかに共通している螺旋歪曲病変によって誘発されるものについてあまりにより誘発されます。 ゲノムDNAの共有結合修飾に対する細胞応答についての質問に対処するために、我々は固有のDDR誘導活性を有していたDNA付加体を歪まリックスで動作するように望んでいました。さらに、実験デザインや解釈を容易にするために、我々は時間にその導入に関して制御することができた構造に興味を持っていたと可視化に適しました。したがって、我々はソラレンに基づいた戦略を開発しました。サイトで：ソラレンはよく5&#39; TAを好む光活性DNAインターカレーターを特徴としています。長波紫外線（UVA）光にさらされない限り、このようなナイトロジェンマスタード及びマイトマイシンC（MMC）のような他の架橋剤とは異なり、それらはDNA反応性ではありません。インターカレート分子は螺旋歪ま間架橋を生成するために、反対の鎖上のチミン塩基（のICLと反応します）11。私たちの実験で使用したトリメチルソラレンではほとんどの製品が形成されていない比較的少ないモノ付加物が（10％未満）が生成されているのICL、12、および一方の鎖上の隣接する塩基間の鎖内架橋があります。彼らは複製および転写、ソラレンおよび他の架橋剤を強力にブロックされているので、シスプラチンとMMCのように、一般的な化学療法で使用されています。したがってソラレンヘリックス歪ま構造によりDDRの活性化に続いて、また、臨床的重要性を有する化合物に対する細胞応答への洞察を提供した研究を可能にしました。 私たちは、トリメチルソラレンは（DIG）をジゴキシゲニンにリンクされた試薬を合成し、植物ステロールは、哺乳動物細胞中に見出され、頻繁にimmunotagとして使用されていません。光活性化のための要件は、生細胞中の核に定義されたROIにおけるソラレンのICLのレーザ光（波長365nm）によって局在化を可能にします。これらは、IMMで表示することができますディグタグに対するunofluorescence。 DNA修復およびDDRタンパク質はのICL 13、14ローカライズレーザのストライプ状に現れました。 DSBを生成するために使用される高レーザ強度によって活性化DDRは、単離されたまたはクラスタ化された損傷15,16に起因するかもしれません。その結果、はるかに低い濃度で存在し、自然に病変を発生するために、これらの実験からの結果の関連性は、不確実です。 DNAにおけるソラレン付加頻度と間隔について同様の質問に対処するために、我々は、DNAの繊維技術17とimmunoquantumドットを利用しました。量子ドットは、蛍光色素よりもはるかに明るい光への曝露によって漂白されていません。従って、それらはしばしば単一分子イメージング18、蛍光色素が不十分明るいされるアプリケーションのために使用されます。個々のDNA繊維は、Gに延伸することができますLASSスライド前細胞収穫にインキュベーション中に組み込まれるヌクレオシド類似体に対して免疫蛍光によって表示することができます。我々は、DIGソラレンで細胞を処理し、レーザマイクロ照射にROIを露出します。繊維は、細胞から調製し、個々のDig-ソラレン付加物はimmunoquantumドットで可視化することができます。比較的短い時間（20-60分）類似体ヌクレオシドに細胞を曝露することレーザ局在のICLの近傍における複製トラクトの表示を可能にします。

<table><tbody><tr><td>Digoxigenin NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Chloro-psoralen</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>TLC plates</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Flass glass column 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>With Volocity Software</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&amp;nbsp;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>with a Nitrogen pulsed laser&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dye cell</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 dye</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>New Comer Supply</td><td>Part # 5070</td><td>New Silane Slides</td></tr><tr><td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 in 40</td></tr><tr><td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 in 200&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit anti Dig antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 in 5,000</td></tr><tr><td>AF647- goat anti Rat IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>AF488-goat anti mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&amp;nbsp;with Axiovision software</td></tr><tr><td>Q-dot 655 filter</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

DNA損傷応答（DDR）が広範囲に生細胞におけるレーザーマイクロビーム照射による二本鎖切断（DSB）の研究で特徴づけられています。 DDRは、ストランド間のDNA架橋（のICL）を含む共有結合性DNAの修飾を歪まヘリックスするために、同様に定義されていません。私たちは、生きた細胞の核に、immunotaggedソラレンのレーザー光活性化により、ローカライズのICLによって刺激DDRを、研究してきました。付加物の分布と複製フォークの出会いについての基本的な問題に対処するために、我々は他の二つの技術とレーザー局在を組み合わせます。 DNAの繊維は、多くの場合、短いパルスの間に組み込まれたヌクレオシド類似体の免疫蛍光による複製フォークの進行状況を表示するために使用されます。 Immunoquantumドットが広く、単一分子イメージングのために使用されてきました。新しいアプローチでは、レーザ局在のICLを有する細胞からのDNAの繊維は、顕微鏡スライド上に拡散されます。タグ付きのICLはimmunoquantumドットと目に表示されます電子間の病変の距離が決定します。 ICLと複製フォークの衝突を可視化することができ、さまざまな出会いのパターンを識別し、定量化しました。

レーザ局在掘る-TMP（ 図1A）のICLは、ソラレンに連結されたDIGタグに対する免疫蛍光によって表示することができます。レーザは、任意の輪郭の領域に衝突するように指示することができるが、ストライプは、細胞内の「自然な」形状ではなく、正規の信号が容易に起因する一次または二次抗体による非特異的結合にアーチファクトから区別することがで?...

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Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

レーザーはしばしばDNA損傷に対する細胞応答の研究で使用されています。しかし、彼らは、その間隔は、周波数、および複製フォークとの衝突はめったに特徴付けされていない病変を生成します。ここでは、レーザーローカライズ間架橋と、これらのパラメータの決意を可能にアプローチを説明します。

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Research

JoVE Journal

Genetics

6.6K ビュー.  National Institute on Aging, National Institutes of Health. レーザーはしばしばDNA損傷に対する細胞応答の研究で使用されています。しかし、彼らは、その間隔は、周波数、および複製フォークとの衝突はめったに特徴付けされていない病変を生成します。ここでは、レーザーローカライズ間架橋と、これらのパラメータの決意を可能にアプローチを説明します。 

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Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

がん研究

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

遺伝学

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

生化学

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of biosensing devices. We report on a protocol of using KrF and ArF lasers irradiating Si (001) samples immersed in a liquid environment with low number of pulses and operating at moderately low pulse fluences to induce Si wettability modification. Wafers immersed for up to 4 hr in a 0.01% H2O2/H2O solution did not show measurable change in their initial contact angle (CA) ~75&#176;. However, the 500-pulse KrF and ArF lasers irradiation of such wafers in a microchamber filled with 0.01% H2O2/H2O solution at 250 and 65 mJ/cm2, respectively, has decreased the CA to near 15&#176;, indicating the formation of a superhydrophilic surface. The formation of OH-terminated Si (001), with no measurable change of the wafer&#8217;s surface morphology, has been confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy and atomic force microscopy measurements. The selective area irradiated samples were then immersed in a biotin-conjugated fluorescein-stained nanospheres solution for 2 hr, resulting in a successful immobilization of the nanospheres in the non-irradiated area. This illustrates the potential of&#160;the method for selective area biofunctionalization and fabrication of advanced Si-based biosensing architectures. We also describe a similar protocol of irradiation of wafers immersed in methanol (CH3OH) using ArF laser operating at pulse fluence of 65 mJ/cm2 and in situ formation of a strongly hydrophobic surface of Si (001) with the CA of 103&#176;. The XPS results indicate ArF laser induced formation of Si&#8211;(OCH3)x compounds responsible for the observed hydrophobicity. However, no such compounds were found by XPS on the Si surface irradiated by KrF laser in methanol, demonstrating the inability of the KrF laser to photodissociate methanol and create -OCH3 radicals.

We report on a process of in situ alteration of HF treated Si (001) surface into a hydrophilic or hydrophobic state by irradiating samples in microfluidic chambers filled with&#160;H2O2/H2O solution (0.01%-0.5%) or methanol solutions using pulsed UV laser of a relative low pulse fluence.

液体環境におけるパルスUVレーザー照射によるシリコン表面の濡れ性の選択エリア変更

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

工学

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes in protein structure, protein-protein interactions, or protein-ligand interactions. HRPF utilizes hydroxyl radicals (&#9642;OH) to irreversibly label a protein&#8217;s solvent accessible surface. The inherent complexity, cost, and hazardous nature of performing HRPF have substantially limited broad-based adoption in biopharma. These factors include: 1) the use of complicated, dangerous, and expensive lasers that demand substantial safety precautions; and 2) the irreproducibility of HRPF caused by background scavenging of &#9642;OH that limit comparative studies. This publication provides a protocol for operation of a laser-free HRPF system. This laser-free HRPF system utilizes a high energy, high-pressure plasma light source flash oxidation technology with in-line radical dosimetry. The plasma light source is safer, easier to use, and more efficient in generating hydroxyl radicals than laser-based HRPF systems, and the in-line radical dosimeter increases the reproducibility of studies. Combined, the laser-free HRPF system addresses and surmounts the mentioned shortcomings and limitations of laser-based techniques.

This protocol presents a method to use inline radical dosimetry and a plasma light source to perform flash oxidation protein footprinting. This method replaces the hazardous UV laser to simplify and improve the reproducibility of fast photochemical oxidation of protein studies.

レーザーフリーヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントによるタンパク質の高次構造解析

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

免疫・感染学

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

生物学

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

要約

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マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

液体環境におけるパルスUVレーザー照射によるシリコン表面の濡れ性の選択エリア変更

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

レーザーフリーヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントによるタンパク質の高次構造解析

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

要約

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マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

液体環境におけるパルスUVレーザー照射によるシリコン表面の濡れ性の選択エリア変更

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

レーザーフリーヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントによるタンパク質の高次構造解析

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射

マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査