このプロトコルは、細胞周期の段階を考慮に入れて、DNA損傷修復タンパク質の空間的および時間的な配置を理解するのに役立ちます。細胞周期の判別のために、他の細胞周期同期法によってもたらされるアーチファクトを回避するS相のマーカーとして蛍光タンパク質タグ付きPCNAを用いる。これは、レーザーベースのマイクロ照射と組み合わせることで、タンパク質キネティクスを修復するDNA損傷に比類のない時空間的な分解能を与えます。

私たちのプロトコルの日常的な利用に成功することは、共焦点イメージングの基本的な知識に基づいています。マイクロ照射の24時間前に、4ウェルチャンバーカバーガラス上の培地を1ミリリットルに500マイクロリットルの4番目の細胞に合計8%10から4番目の細胞にプレートします。マイクロ照射の1時間前に、通常の成長培地を、OLAParibまたはDMSOなどの車両制御のいずれかを含むイメージング媒体と交換する。

イメージングの少なくとも4時間前に、環境チャンバーと顕微鏡部品をオンにします。加熱、二酸化炭素供給、湿度調整器のスイッチを入れ替えます。顕微鏡に細胞を移す前に、レーザーラインと一緒に光源を初期化します。

顕微鏡の目的に油を注い、顕微鏡の下にチャンバーカバーガラスを置きます。非同期集団でS相細胞を選択するには、S相でタグ付けされたPCNAの固有の局在パターンを眼球に調べ、マイクロ照射に十分なS相細胞を有する視野を選択する。関連するソフトウェアを使用してバイナリ行を挿入することにより、マイクロ照射の対象領域を設定します。

必要な行数と間隔を設定するには、[バイナリ]をクリックし、[線、円、楕円を挿入]を選択して希望の行数を描画し、ROI をクリックしてこれらのバイナリラインを刺激 ROI に変換し、ROI にバイナリを移動して、いずれかの ROI を右クリックして、刺激 ROI S1 として使用を選択します。これらの線は、セルの核を通過するように視野に入れる。マイクロ照射の前に、後で分析するためにPCNAの病巣を識別するために、A1 LFOVコンパクトGUIおよびA1 LFOVスキャンエリアウィンドウに必要なパラメータを設定し、続いてキャプチャボタンを押して、視野の高い解像度の画像を撮ります。マイクロ照射を設定するには、ND刺激タブを開き、タイムスケジュールウィンドウにアクセスして一連の刺激前画像を取得し、ガルヴァーノスキャナを使用して一連の刺激後画像を取得します。

タイム スケジュール ウィンドウに 3 つのフェーズを設定します。取得および刺激カラムで、3つの相に対する取得、刺激、および取得をそれぞれ選択する。刺激フェーズの場合は、S1 を ROI として設定します。

Galvano XY ウィンドウで、405ナノメートルレーザーラインに100%レーザー出力を設定し、マイクロ照射のドウェル時間を設定します。目的の時間枠と間隔のタイムラプスイメージングを設定するには、タイムスケジュールA1 LFOVコンパクトGUIとA1 LFOVスキャンエリアウィンドウを使用します。レーザーパワーの割合、ゲイン、オフセットの設定を最適化して、A1 LFOV コンパクト GUI ウィンドウでのイメージング中の写真の消血を減らします。

タンパク質の運動に応じて、タイムスケジュールウィンドウで第3相取得行の所望の間隔と持続時間を設定することにより、画像間の間隔または全時間経過の期間を延長または短縮する。マイクロ照射とその後のタイムラプスイメージングを実行するには、今すぐ実行を押します。タイムラプスイメージングの最後に、刺激ROIを別々の画像として保存し、分析に使用される下流のソフトウェアでマイクロ照射の座標を特定するのに役立ちます。

PCNAは、G1およびG2相の核内で完全に均質な分布を有する。S相では、PCNAはDNA複製の部位に局部化し、核内の明るいスポットとして視覚化することができる。初期S相細胞では、スポットは比較的小さく、細胞の核全体に均等に分布している。

S期中に進行する一方で、斑点はぼやけ、核と核長体の周囲に向かってより多くの局地化を行う。後期Sフェーズでは、スポットは数が減少しますが、PCNAが後期複製サイトに集中するにつれてますます大きくなっていきます。1,000マイクロ秒の滞納時間のような低用量のエネルギーは、二本鎖破断応答者であるEGFP-FBXL10の採用を誘発しないが、酸化DNA損傷の部位に採用される塩基切除修復経路タンパク質であるNTHL1-mCherryの採用を誘導するのに十分である。

3,000マイクロ秒の滞納時間で、EGFP-FBXL10とNTHL1-mCherryの両方が募集され、酸化病変と二本鎖破断の両方を発生させるレーザー出力を実証します。EXO1bは約1分間に蓄積およびマイクロ照射部位の最大レベルに達し、その後、ゆっくりとDNA病変から離脱し始める。オラパリブの存在下では、1分間でのレーザーストライプでのEXO1bの蓄積は、車両制御と比較して有意に少ない。

顕微鏡が加熱するのに十分な時間を与えられ、一貫した結果を確保するために各実験に最適な培養と条件が重要です。さらに、特定のDNA病変を検査するために、異なるDNA損傷レポーターでレーザー設定を最適化することが重要です。マイクロ照射後、分画、免疫沈降、ChIPなどの古典的な生化学的方法で結果を検証することを検討してください。

これらのアプローチは、より大きな細胞集団をサンプリングし、したがって統計的強度を提供する。