レーザーフリーのヒドロキシルラジカルタンパク質のフットプリントにより、タンパク質相互作用部位および確認変化の領域の同定が容易になり、タンパク質凝集、構造、安定性の研究が加速します。インラインラジカル線量測定により、有効なヒドロキシルラジカル負荷をリアルタイムで調整でき、リアルタイムラジカル線量測定により、実験時間と貴重なサンプルを節約しながら、ラベル再現性を向上させることができます。まず、250マイクロメートルの内径シリカキャピラリーをシリカ切断石で27インチに切断し、毛細管の端部にきれいなストレートカットを確認します。
長さ約15ミリの2つの窓を作成します。毛細管の下端から、ポリイミドコーティング90ミリメートルを焼き払い、線分解窓を作成し、225ミリメートルの線虫窓を作成します。ナットとフェルールの円錐の端のすぐ先に毛細管の下端を挿入します。
キャピラリーをポート5に加え、レンチで指をしっかりと向こう側に締めます。光起こしモジュールの光起細胞キャップをまっすぐ引き出して取り外し、キャピラリーを所定の位置に保持する磁気的に取り付けられた金属マスクを取り外します。左側のタブを押して、ドーシメーターセルを開き、右に開いて、行量計セルをスイングします。
キャピラリーを所定の位置に保持する磁気マウントクリップを取り外します。次に、毛細管を光度細胞の基部にある溝付きチャネルに配置し、毛細管のウィンドウを光度セルウィンドウで中央に配置します。キャピラリーを置き、磁気マスクを追加します。
光のキャップを元の位置に戻します。線量計セルの基部にある溝付きチャネルに毛細管を配置し、2番目のキャピラリーウィンドウを線量計セルの中央にある小さな開口部の中央に配置します。片方の手でキャピラリーを所定の位置に持ち、キャピラリーを所定の位置に保持する位置に2つの磁気クリップを置きます。
クリックが閉じるまで、ドーシメータ セルを閉じます。最後に、製品コレクターのキャピラリーリフトの上にナールノブを通して毛細管を挿入し、キャピラリーをバイアルの底のすぐ上まで伸ばします。カッターを使用してテフロンチューブの所望の長さをカットし、きれいなストレートカットのために端を確認します。
ナットの 1 つを通して新しい射出ループの一方の端を挿入し、チューブの端に新しいフェルールを配置します。ナットとフェルールを所定の位置に保持し、チューブを注入バルブのポート6に挿入して、底を打つまで押し出します。ナットをレンチで締め、ナットとフェルールがしっかりと配置されていることを確認します。
両端にナットと固定フェルールが付いたら、一方の端をポート3に緩やかにねじ込み、もう一方の端をポート6にねじ込みます。一度位置に入ったら、両側をしっかりと引き締め、4分の1がレンチで指をしっかりと回します。流体モジュールを起動してレーザーフリーHRPFシステムをオンにし、続いて光分析モジュール、量計モジュール、製品コレクター、およびシステムコンピュータを起動します。
システムソフトウェアを起動します。十分にシリンジポンプのバルブ位置からバッファの10ミリリットルにチューブを沈めます。廃棄物の位置からチューブを、シリンジポートのポート2から空の容器にチューブを向け、廃棄物を収集します。
製品コレクターカルーセルにHN6とマークされた位置に1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管を置きます。25マイクロリットルのHPLCグレードの水を負荷位置に設定して注入ループを5回リンスします。システムの残りの部分をフラッシュするために注入弁を手動で回します。
コントロールソフトウェアで[処理]を選択して、液滴が形成されるまで水の流れを開始します。2ミリモルアデニンと10ミクロモルタンパク質を含む溶液を作ります。その後、0.3 ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルカタラーゼと 35 ミリモル メシアニン アミドを使用してクエンチ溶液を作る.
200マイクロリットルマイクロチューブにクエンチ溶液のアリコート25マイクロリットル。過酸化水素を200ミリモルに希釈し、氷の上に置きます。制御ソフトウェアのゼロボルトでフラッシュ電圧を開始します。
このゼロボルト制御は、対象となるタンパク質の任意のバックグラウンド酸化を決定します。[データの自動ゼロの開始] を選択し、[処理] を [準備完了] を選択します。最後に、注入弁を負荷位置まで下げて下さい。
製品コレクターカルーセルの位置にクエンチ溶液を置き、製品バイアルをシステム制御ソフトウェアの1つに変更します。注入の直前に、アデニンの12.5マイクロリットルとタンパク質混合物を12.5マイクロリットルの過酸化水素と混ぜ合わせます。混合物を上下にピペットして混ぜ、すぐに回転させます。
混合の10秒以内に注入ポートを使用して、この溶液の25マイクロリットルを注入します。注入弁を注入位置に切り替え、サンプルが処理されている間待ちます。制御ソフトウェアでフラッシュ電圧を750ボルトに上げ、ラベル付け手順を繰り返します。
次に、各サンプルの吸光度を記録します。まず、[選択]をクリックし、ピーク吸光度の開始と終了を手動で選択します。使用可能なスペースに、サンプルの説明を書きます。
取得したすべてのデータに対してこの手順を繰り返します。データをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、各電圧のアデニン吸光度の平均変化を計算します。すべてのサンプルを採取した後、注入バルブを負荷位置に下げて注射器ポートとサンプルループを洗い流し、25マイクロリットルのHPLC水を5回注入します。
注入弁を注入位置まで回し、残りのシステムをHPLC水で洗い流します。フラッシュされたら、フローを停止し、システム制御ソフトウェアを終了し、製品コレクタ、ドーシメータモジュール、光起調モジュール、そして最後に流体モジュールから始めてモジュールをオフにします。酸化の際、265ナノメートルでの紫外線吸収度の減少に使用されるアデニン。
緩衝液2はラジカルスカベンジャーを含有し、これは緩衝液1と比較してアデニン吸光度の変化を減少させる。アポミオグロビンは、プラズマランプ電圧を4つ上昇させると過酸化水素とアデニンの存在下で改変した。6個のペプチドが検出され、265ナノメートルにおけるアデニン吸光度の変化に対する酸化の直線的な増加を伴った。
これら6つの酸化ペプチドは、ミオグロビンの結晶構造上に標識されている。高圧プラズマランプから検出される酸化の程度は、レーザーベースの方法よりもはるかに高いです。この増加は、高圧プラズマランプの広いスペクトルUV発光スペクトルから生じます。
広いUVスペクトルを生成することにより、高圧プラズマランプは過酸化水素の吸光度ドメインと重なり合い、Kr FエキシマーレーザーおよびNd YAGレーザーと比較して、過酸化水素の光分解を通じてヒドロキシルラジカルのより効率的な生産をもたらす。高圧プラズマランプは、Kr Fエキシマーレーザーを用いて通常観測されるものを超えてヒドロキシルラジカルの生産を大幅に増加させます。100 ミリモル過酸化物を使用すると、高レベルのバックグラウンド酸化を引き起こす可能性があります。.
タンパク質系が過酸化物酸化の影響を受けやすい場合は、濃度を10ミリモルまで低下させます。HRPFの不可逆的なラベルは、長いプロテアーゼ消化を含む下流のサンプル処理を可能にし、多重化のためのタンデムマスタグを追加し、2Dクロマトグラフィーを行い、ペプチド検出を改善し、構造情報を調整することができます。
