We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

miniSOG細胞株の1世代<ol><li> 5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の2 mlを含む35 mmディッシュにU2OS（ヒト骨肉腫）細胞を増殖させます雰囲気。 </li><li>彼らはminiSOGとmCherryをのための配列を含むプラスミド構築物をトランスフェクション試薬19の製造業者のプロトコルに従って修復タンパク質をタグ付けされた精製されたトランスフェクションの質（A269 / 280比1.8〜2.0）でリポフェクション80％コンフルエントである場合には細胞をトランスフェクション。 miniSOG発現プラスミドは、ツィン・ラボから注文することができます<a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">。http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li>ソート蛍光活性化細胞によってminiSOGとmCherryをタグで組換えタンパク質を発現する細胞は、2日後にトランスフェクションをソートします。細胞を回収20を過剰発現している細胞を回避するために、中間蛍光強度を持ちます。 </li><li>培養10％FBSおよび選択剤G418（ジェネティシン）0.6 / mlのが補充されるDMEM培地10ml中で10cmのディッシュ上の陽性細胞。 </li><li>目に見えるコロニーがプレート上に出現した後、mCherryを陽性コロニーのための画面が倒立蛍光顕微鏡を使用して、恒久的なマーカーで（プレートの底部に）自分の周りの円を描きます。低倍率の空気対物レンズ（例えば、10倍）を使用して、慎重にコロニーを掻き、ゆっくりと滅菌千μlのピペットチップにそれらを吸引することにより、無菌技術を使用してクローンを選択します。 </li><li>選択したコロニーを展開し、10％のジメチルスルホキシドを補っステップ1.1で説明した成長培地を用いて、それらの一部を下に凍結。無菌の18×18 mm 2のカバースリップ上に成長しており、それらを暴露することによってDRF形成のための細胞をテスト放射線の2 Gyの。安定miniSOG mCherryをを発現して照射された細胞は、mCherryをを画像化するためのフィルタが設定され使用して蛍光顕微鏡で可視化したときに修復タンパク質は、DSBは典型的な焦点パターン特性を示さなければならないタグ​​付け。 </li></ol> 2.細胞培養<ol><li>安定miniSOGとmCherryをを表現する文化U2OS細胞は、ステップ1.1に概説された条件の下で修復タンパク質をタグ付け。 2mlのDMEMを含む35ミリメートル直径のガラスボトムディッシュに80％コンフルエントに細胞を増殖させます。プラスチックや使用されるプラスチックにカバースリップを添付接着剤が使用される樹脂の水溶液とアルコール溶液に耐性と耐性であることを確認してください！ </li><li>実験を行う前に、関心領域を識別するために、蛍光顕微鏡を用いて滅菌ダイヤモンドペンを用いてスクラッチすることにより異所性タンパク質を発現する細胞を含む約1mm 2の小領域の輪郭を描きます。あるいは、ガラス底皿tを使用帽子はカバーガラスに内蔵されたプリエッチングされたグリッドシステムとカバーガラスが含まれています。 注：ESIおよび蛍光顕微鏡写真21を組み合わせ 、高品質な相関顕微鏡を使用している場合は、カバーガラスの厚さは、油浸対物レンズとの互換性があることを確認してください。これは、厚さ1.5号（0.16〜0.18ミリメートル）を持っている必要があります。領域は、エッジ付近で発生する可能性がある樹脂の重合の問題を回避するために、TEMで検査するために皿の中央に近いエリアを選択してください（ポイント4.10から4.13を参照）。 </li></ol> 3. DNA損傷誘導<ol><li> 、ガンマ線を用いて細胞を照射放射線様薬剤を使用するか、（18,22または 23に記載されているように、 例えば ）共焦点顕微鏡にレーザーマイクロ照射による損傷を誘発。 </li><li>この例では、405nmのゾルを用いたセシウム137線源またはレーザmicroirradiateでガンマ線照射の2及び6 Gyを用いて細胞を照射します0.5 / mlのヘキストで20分間細胞を感作した後、共焦点顕微鏡のid固体レーザ。 </li></ol> 4.サンプル調製<ol><li> 0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中または暗所で室温で30分間、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.4中の4％パラホルムアルデヒド注意1mlで細胞を固定してください。 注意：パラホルムアルデヒドとカコジル酸ナトリウムは有毒です！手袋を着用し、適切に有害物質を廃棄してください。 </li><li> 4ミリリットルの0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液pH 7.4のリン酸緩衝液pH 7.4で細胞を2回洗浄します。 </li><li> 2ミリリットルの50mMグリシンで固定した細胞を治療、5 mMのアミノトリアゾールと30分間、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液または0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.4）中の10mMシアン化カリウムの注意（pH値をチェック！）未ブロックするために、アルデヒド基とは、バックグラウンドを増加させることができ、ヘム基によって生成された活性酸素種を抑制する。 注意：シアン化カリウムは非常に有毒です！ W耳の手袋は、ボンネットの下で働くと十分に有害物質を廃棄してください。それはpHが検証され、正確であることが重要であるので、反応は、pHに非常に敏感です。 </li><li>相関顕微鏡法が所望される場合、倒立蛍光顕微鏡上で2Dまたは3Dのステップ2.2で選択された領域を記録します。 </li><li> 2ミリリットルのマイクロチューブに10 mgのジアミノベンジジン塩酸塩錠を配置することによって、1 mg / mlのジアミノベンジジン塩酸注意溶液を調製します。蒸留H濃塩酸（11.65 M）の2 Oおよび20μlの980μlを添加し、溶液が淡褐色半透明になるまで混ぜます。 7.0と7.6の間のpHに水酸化ナトリウムでpHを調整しながらの1mg / mlの最終濃度になるように0.1 Mリン酸または0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中にこの溶液を希釈液（pH 7.4を推奨）。 注意：ジアミノベンジジンが有毒です！手袋を着用し、適切に有害物質を廃棄してください。 </li><li>光酸化のために、Replace、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液またはリン酸緩衝液中1 mg / mlのジアミノベンジジン塩酸溶液2 mlのバッファー。光からこの溶液を保護し、酸素の溶解度を増加させるために4 O Cに氷上で冷却します。 （溶液中に挿入し、酸素ボンベに接続されたホースを使用）溶液に酸素をバブリングすることによって酸素を含む溶液を飽和。再びのpHを確認し、必要に応じて調整してください。 注：これは、pHが7.0およびpH 7.6の間であることを光酸化反応のために非常に重要です。 </li><li>慎重に40倍油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡上に固定された細胞を用いた料理をマウントして、関心のある領域に移動します。 GFPまたはCFPのためのフィルターキューブを使用して青色光とminiSOGタグエキサイト。 MiniSOGは473 nmの10で肩を448 nmで励起最大値を有します。 </li><li>でも緑miniSOG蛍光ヘクタール後に照明を続行完全に消失し、重合ジアミノベンジジンの茶色の光酸化物は、透過光路に出てくるまでです。酸化生成物は、細胞の大部分に表示されている場合には、光酸化を停止するために、蛍光照明をオフにします。 注：光酸化は、対物レンズ、フィルタ透過波長と効率、および照明源に応じて数分かかることがあります。 </li><li> Postfixの0.1 Mカコジル酸ナトリウムのpH7.4の緩衝液または30分間、リン酸緩衝液pH7.4中の2％グルタルアルデヒドの1 mlの細胞。 </li><li> 0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液pH 7.4または0.1でMリン酸緩衝液pH 7.4で20分間0.1％-0.5％の四酸化オスミウムを用いて細胞の膜を修正。 注：これは、膜を安定化するために必要な四酸化オスミウムの可能な限り低い濃度を使用することをお勧めします。重合DAB沈殿物はESI、強いによって直接検出することができ、窒素の高い密度を有するためオスミウム染色はminiSOGタグ化タンパク質を識別し、ESIにとって有害で​​あるかもしれない必要はありません。四酸化オスミウムは毒性が非常に強いです！ヒュームフードで作業し、適切に有害廃棄物を処分します。 </li><li> 30％、50％、70％、90％、98％、100％エタノールステップ（各5分）を​​用いて、エタノールシリーズを通して、細胞を脱水します。その後、1で細胞をインキュベートする：100％エタノールおよびアクリル樹脂（LRホワイト）の1ミックス100に少なくともさらに4時間、細胞をインキュベートする前に、細胞への浸透を容易にするために4時間シェーカー上に皿を置き％アクリル樹脂（LRホワイト）。 </li><li>樹脂を重合させるためには、カミソリの刃とコートアクリル樹脂アクセラレータとの縁で標識した2ミリリットルのマイクロチューブの蓋を遮断。アクセラレータだけ縁をカバーし、チューブ内に流れないことを確認してください。その後、慎重にパスツールピペットを用いて、LRホワイト樹脂で約2/3のチューブを埋めます。樹脂が接触ウィットに入らないように注意してくださいHリムの加速器！ </li><li>皿に細胞を浸透させた樹脂を外し、チューブの幅はほぼ完全に皿のガラス覆われた観察窓をいっぱいにするように直立マイクロチューブの上に逆さに皿を置きます。 </li><li>その後、チューブとカバーガラスを密閉チューブ内の樹脂は、現在のセルを覆うようにチューブを反転させる加速器のために1〜2分待ってください。 </li><li> 60℃のオーブンの中にチューブでシャーレを置き、12時間のためにそれを治します。 </li><li>ブロックが硬化されると、オーブンから添付樹脂充填マイクロチューブでシャーレを削除し、皿からマイクロチューブを分離します。液体窒素と熱水中で凍結融解サイクルによる分離を促進します。 </li><li>ガラスボトムディッシュを捨て、慎重にブロックを除去するために、かみそりの刃でマイクロチューブを切断してオープン。 </li><li>永久的なマーカーでブロックにラベルを付けます。 </li><li>トライにカミソリの刃を使用します以前にダイヤモンドやタングステンペンでマークされた領域が含まれています（または目的の細胞の領域が含まれています）1ミリメートル2地域が、何も残らないようにブロックをm個。 </li><li> 、ウルトラミクロトームでブロックをマウントトリミングナイフでブロックをトリミングし、ダイヤモンドナイフを用いて、約50nmの超薄切片を切りました。 </li><li>高透過300メッシュのグリッド上のセクションをピックアップ。これらのグリッドは非常に小さいグリッドバーを持っているので、興味のある領域での少ないセルをカバー。 </li><li>コー​​ト炭素の約0.2〜0.4ナノメートルとグリッド上のセクションでは、TEMの電子ビームの下でそれらの安定化を助けるためにカーボンコーターを用いて。 </li></ol> 5.電子顕微鏡<ol><li>エネルギーフィルタを装備していたTEMにグリッドをロードします。製造者の指示に従って顕微鏡及びエネルギーフィルタをチューニングした後、低倍率モード（通常伝送）のセクション上の細胞を検査し、比較しますそれら（ステップ4.4で得られた）ときに適切なデータを蛍光します。 </li><li>興味深い機能（DNA損傷トラックまたはDNA修復フォーカス）と核が発見されると、エネルギーフィルタリングモードに切り替えて、厚さマップを記録します。 注：この手順は、ゼロ損失とフィルタ処理されていない画像の記録が含まれています。 0.3までの厚さはフリーパス（入射ビームの電子の30％は、試料によって散乱されます）は、良好な元素マップを生成するのに十分薄いことを意味します。 </li><li>使用顕微鏡のエネルギーフィルタを制御するソフトウェアを使用して、要素のリンと窒素のレコード比マップ。また、20 eVでのスリット幅と、120 eVのエネルギー損失で20 eVのプリエッジ画像のスリット幅を175 eVのエネルギー損失でリン地図ポストエッジ画像を記録します。窒素マップ、また、35 eVでのスリット幅を有する358 eVでの35 eVのプリエッジ画像のスリット幅を有する447 eVのに記録後エッジ画像については。 注：画像形成された要素の内容以来（ホスホオルス及び窒素）が（約1％）、より良い信号対雑音比を有する画像を生成するために、「3ウィンドウ法」上の「比画像」（定性元素マップ）（元素マップを定量化）を選択し、相対的に低いです。 </li></ol> 6.画像処理<ol><li> （例えば、デジタル顕微鏡写真）を取得写真のファイル形式を扱うことができる画像処理ソフトウェアに元素比マップを開きます。マップを重ね合わと揃えた後、RGB画像のグリーンチャンネルに赤チャネルへの窒素マップとリンマップをコピーします。 </li><li>タグ付き画像ファイル形式（TIFF）ファイルとして合成画像をエクスポートします。 層 （例えば、フォトショップ）を使用することができ、画像処理ソフトで画像を開きます。 </li><li> 8ビット・データ・セット（0〜255）に画像内の最小値および最大値を再スケーリングすることにより、各チャネルのダイナミックレンジを調整します。 </li><li>使用した窒素マップ（のリン含有量を差し引きますタンパク質の分布を示す定性マップを生成するために「レイヤー」ウィンドウ）。 </li><li> 「インデックスカラー」に、前のステップで作成した核酸（リン）のマップとタンパク質（窒素）を変換した核酸分布を示すマップのCMYK色空間とシアンルックアップテーブルに黄色のルックアップテーブルを作成します非核地図を表示します。色は、二つの要素間の最大コントラストマップを生成するように選択されます。 </li><li>新しいイメージを作成し、異なる層としてリンとタンパク質の分布を示すマップをインポートします。お互いに重畳された両方の層を表示するには「スクリーン」透明度モードを使用してください。 </li><li>ステップ5.2で取得したゼロ損失画像を開きます。この画像は、従来のTEM像のように見えるだけで、試料に衝突することなく、試料を​​透過した電子を含んで記録された領域の画像を表しています。エクスポートTIFF画像としてこの画像。 </li><li>フォトエディタでエクスポートゼロ損失の画像を開き、元素マップを示す画像の最上層にコピーします。 「スクリーン」透明度モードを使用して画像の位置を合わせます。 </li><li>必要に応じて、閾値セグメントにゼロ損失画像miniSOGに由来する信号。上記のように別の層として得られる画像を追加します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometric+analysis+of+protein-+and+nucleic+acid-based+structures+in+the+cell+nucleus.">Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus.</a> Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).</li><li>Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Visualization+of+a+Protein+Nuclear+Architecture.">Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture.</a> Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).</li><li>Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microanalysis+of+biological+specimens+by+electron+energy+loss+spectroscopy+and+by+electron+spectroscopic+imaging.">High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging.</a> Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).</li><li>Leapman, R. D., Ornberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).</li><li>Simon, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spectroscopic+imaging.">Electron spectroscopic imaging.</a> Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).</li><li>Egerton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).</li><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+thickness+correction+of+EFTEM+phosphorus+maps.">Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps.</a> Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).</li><li>Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+molecules+employing+horseradish+peroxidase+as+reporter+enzyme+for+protein+localization+in+the+electron+microscope.">Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope.</a> Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLoS biology. 9, e1001041 (2011).</li><li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+foci:+H2AX+and+the+recruitment+of+DNA-damage+response+factors.">Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).</li><li>Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+Rad51+recombination+protein+in+somatic+cells+after+DNA+damage+and+its+localization+in+synaptonemal+complexes.">Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).</li><li>Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hMre11+and+hRad50+nuclear+foci+are+induced+during+the+normal+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).</li><li>Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+imaging+of+changes+in+the+structure+and+spatial+organization+of+chromatin,+gamma-H2A.X+and+the+MRN+complex+within+etoposide-induced+DNA+repair+foci.">High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).</li><li>Kruhlak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+chromatin+structure+and+mobility+in+living+cells+at+sites+of+DNA+double-strand+breaks.">Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).</li><li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones.">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).</li><li>Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sorting+conditions+for+the+selection+of+stable,+high-producing+mammalian+cell+lines.">Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines.</a> Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).</li><li>Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+spectroscopic+imaging+of+chromatin+in+situ.">Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ.</a> Methods in enzymology. , 375-456 (2004).</li><li>Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+contributes+to+DNA+double-strand+break+repair.">Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair.</a> Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).</li><li>Mortusewicz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+RNA+polymerase+II+cofactor+PC4+to+DNA+damage+sites.">Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites.</a> J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).</li><li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling.">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).</li><li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress.">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li><li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells.">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li><li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprint+of+'Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+(QuEST).">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESIは、それが具体的にリンが豊富な領域をマッピングすることが可能であるため、核内でクロマチンとリボの異なる状態を調べるための優れたツールとして機能することができます。それは深く、電子顕微鏡によって得ることができる詳細の量を増大し、非特異的な対照的な方法に依存していません。 ESIの1つの欠点は、同じ加速電圧で、従来のTEMより薄いセクションを必要とすることです?...

近年1以上の光学顕微鏡の大幅な進歩にもかかわらず、細胞生物学者は、まだ解像度のギャップに苦しんでいます。これは、巨大分子複合体の協調相互作用を伴う基本的な細胞プロセスにおける構造と機能の関係の理解を制限する（例えば、クロマチンリモデリング、DNA修復、RNA転写およびDNA複製で）。透過電子顕微鏡（TEM）は、必要な分解​​能を提供だが、それはまた、視覚化構造の生化学的組成を決定することができる一方で、特定のタンパク質を標識するために、構造的にできないので、これらのプロセスを定義するために挑戦してきました。核構造を区別するのに役立つ内部の膜が存在しない場合には、核が特に困難となっています。電子分光イメージング（ESI）は、DNA、RNA、およびPROTの同時検出および区別を可能にすることにより、これらの制限のいくつかを解決しますEINベースの核構造2-5。 電子分光イメージング。 電子顕微鏡での高感度と分解能で元素の分布をマッピングするためには、非弾性的に試料6の要素の内殻電子との相互作用を介して散乱された電子を選択画像分光計を使用することができます。エネルギーの要素固有の量が試料中の原子のイオン化の結果として失われるので、これらの電子は、電子顕微鏡に取り付けられた分光計を用いて分離し、可視化することができます。このように、試料と相互作用した電子のスペクトルの分析は、 試料 7の元素組成に関する定性的および定量的情報を明らかにする。試料を通過する際にエネルギーを失わない電子は、電子エネルギー損失の「ゼロ損失ピーク」に見出されますスペクトル。これらの電子の存在量は、試料の質量、密度および厚さに関係し、試料に衝突または試料を通過する間にエネルギーを失うことなく、試料を​​通過する電子から構成されています。この情報は、試料8中に存在する特定の元素の原子数の絶対的な定量化のために有用であり得ます。 生物学的サンプルは不十分TEMの入射ビーム中の電子を偏向する光素子の大部分から構成されているため、重金属塩を使用する染色方法は、試料のコントラストを生成するために適用されなければなりません。これらの造影剤の多くの特異性および特異性が可能な複数の染色を可視化することができないことがないことは、核の研究において、従来の電子顕微鏡の値を制限しています。 ESIは、特に細胞核の構造の研究のために、従来のTEMを超える大きな利点を持っています。これは、タンパク質複合体の核タンパク質複合体を区別するために、および核酸のそれらの濃度に基づいて、種々の核タンパク質複合体を解決するためのDNA-及びRNAを含む高分子複合体のリンが豊富な性質を利用することが可能です。残りの生物学的物質は、窒素の存在量に基づいて画像化することができます。異なる解剖学的構造内のマッピングだけでこの2つの要素とそれらの分布と相対量の分析は、核に関する多くの情報を提供してくれます。例えば、それは、クロマチンとリン存在量を示すマップでリボソームを同定することは容易です。 interchromatin空間、核膜孔複合体、および核小体は、一方で、簡単に窒素マップ画像で検出することができます。 ミニ一重項酸素発生システム（miniSOG） それが取るので、ESIは、 その場でのクロマチン構造で勉強するための強力な技術を表していますリンと窒素の元素組成における特性の比の利点は、元素組成は、通常、タンパク質複合体の異なる集団の間で区別するために使用することができません。ナノメートル範囲の小さな金粒子で標識された抗体は、広く、個々の分子の位置をマッピングするために使用されてきました。金粒子は、通常、二次抗体に結合しているので、一次抗体によって検出されるエピトープの周囲に約20nmの円周内に表示されます。埋め込み後の試料では、抗体は、セクションの表面に露出されるエピトープを検出することができます。それは、抗原の存在を証明し、細胞の特定の解剖学的構造に関連することが可能であるがエピトープの大部分が樹脂によって覆い隠されているので、得られた情報は、不完全です。全体を通して、抗原へのアクセスを許可し、蛍光顕微鏡検査のために使用されるものと同様のプロトコルを使用する技術を、事前に埋め込みサンプルの全体の深さが、典型的には脂質膜の除去を必要とアルデヒドで固定することができない成分を除去する抗体が細胞に侵入することを可能にするために必要とされる透過化のステップ。また、超微細構造の保存のための好適なアルデヒド固定液、グルタルアルデヒドは、一般的にエピトープを破壊し、その結果、パラホルムアルデヒドは、一般的に必要とされます。これは、タンパク質 - タンパク質架橋にあまり効果的です。金ナノ粒子で標識された抗体の別の欠点は、金が弱いコントラストを有するサンプルの興味深い構造の詳細を隠すことができ、強いコントラストを作成し、非常に電子密度の高い材料であることです。 発現したタンパク質タグとして緑色蛍光タンパク質（GFP）の出現は、細胞生物学の質問に答えるために、蛍光顕微鏡の使用を変えてきました。小さ ​​な蛍光ドメインを有するタンパク質をタグ付けすることは、生体内でその分布のマッピングを可能にします</eM&gt;の構造を変更することができる透過性手順を必要とせずに。電子顕微鏡法に細胞内のタンパク質の分布をマッピングするためにタンパク質タグを使用してエレガントな原理を変換するために、システムは、関心のある構造に近い信号を生成し、TEMのコントラストを生成することができることが必要でした。重合したジアミノベンジジンは、しばしば、抗体結合を検出するために、組織学に使用される染色あります。この染色は、通常、二次抗体にコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を用いて堆積されます。反応は信頼性の高い結果を生成するが、HRPは、 セル 9の細胞質ゾルに触媒活性ではありません。その解像度はナノゴールド法10よりも悪いようにHRPの反応生成物も生成部位から離れて拡散することができます。これらの問題を回避するために、フラッシュ/ ReAsHシステムが11を開発しました。これは、テトラシステインモチーフを保有する組換え融合タンパク質で構成されています。このモチーフは、との結合ができますbiarsenic蛍光団。励起されると、結合したFlashやReAsHは、標識タンパク質の現場ですぐに沈殿するポリマーへの反応性の高い一重項酸素を生成するので、photoconvertジアミノベンジジン（DAB）することができます。 DABポリマーは、電子密度で四酸化オスミウムで染色することができ、TEMでの組換え融合タンパク質の分布をマッピングするために使用することができます。 2011年には、シュウら 10は、蛍光灯や448 nmの青色光で励起されたとき、多くの一重項酸素ラジカルを生成することが可能であるシロイヌナズナのフラビンタンパク質由来の小さな106アミノ酸の融合タグで構成されていminiSOGシステムを発表しました。それらの一重項酸素ラジカルは11免疫標識された抗体よりもかなり近いタグタンパク質の表面に近くポリマーを形成する光酸化ジアミノベンジジンを使用することができます。フラッシュ/ ReAsHシステムは、フルオロをもたらす必要があるがクロムと光変換を行う前に、細胞へのジアミノベンジジン、miniSOGシステムのみジアミノベンジジン、光を必要とし、加えて、ジアミノベンジジンを重合で約2倍の効果があります。ここで、miniSOGはDNA修復フォーカスの超微細構造をマッピングするために、ESIと組み合わせて使用​​されます。 DNA修復巣（DRF） 彼らは転座と遺伝情報の損失につながることができますので、未修復のDNA二本鎖切断は、細胞への深刻な脅威をもたらします。今度は、これが老化、癌、及び細胞死をもたらすことができます。 DNA二本鎖切断修復に関与している多くのタンパク質は、DNA二本鎖切断12-14の周りに組み立てる病巣に蓄積します。それらの機能は不明であるが、それらは、DNA二本鎖切断を含み、DNA二本鎖切断修復の部位である、核内の部位を表します。 DNA修復FOC私（DRF）は、蛍光顕微鏡によって特徴付けられており、それらはDNA損傷12,15のためのバイオマーカーとして役立ちます。これらは、二本鎖切断のサイズに大量の相対的であり、最近の超解像顕微鏡研究は、それぞれ16を集中内の分子のサブ区画のいくつかの証拠を明らかにまで比較的均質と考えられました。これらの部位は組織化されている方法を理解するために、互いに対して基礎となる生物学的構造のすべてを可視化することが必要です。これは、蛍光顕微鏡検査によって達成さが、電子顕微鏡17,18を介して可能であることはできません。ここでは、この方法は、DNA二本鎖切断修復の超微細構造を探索するために、この組み合わせアプローチの可能性を示すためにminiSOG法により電子分光イメージングを組み合わせることが記載されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD&#160;</td>
			<td>not made for immersion objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White: acryl resin</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White accelerator</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td>
			<td>SPI</td>
			<td>1161123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten-Point Lab Pen</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>41148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater 208carbon</td>
			<td>Cressington</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra microtome Leica EM UC6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS5</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Micrograph V.2.30</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSOG-Constructs</td>
			<td>Tsien-Lab</td>
			<td></td>
			<td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDC1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rad52 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium 137 radiation source &#34;MARK 1&#34;</td>
			<td>&#160;(J.L. Shepherd &#38; Associated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FiJi</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife ultra 35&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming Knife ultratrim</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>12300</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>16020</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Medigas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-1,2,4-triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>207810</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>15058</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>71960</td>
			<td>Caution Sharp!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

光学分解能透過型電子顕微鏡における特定のタンパク質の集団を同定する課題には限界が細胞生物学における障害となっています。多くの現象は、簡略化システムインビトロ分析により説明と完全に理解されるために、特に1nmから0.1μmの間の範囲内で、 その場で追加の構造情報を必要とすることはできません。ここで、電子分光イメージング、タンパク質および核酸の分布の同時マッピングを可能にする、透過電子顕微鏡法、および発現タグ、miniSOGは、DNA二本鎖切断修復巣の構造と組織を研究するために組み合わされます。

ESI 従来のTEM像と核（ 図1）のESIの画像を比較すると（例えば、 図7-1）を容易に識別することができる解剖学的構造の劇的な増加を明らかにしています。クロマチンリッジは黄色で表示され、それがマウス細胞中でchromocentersを識別することは非常に簡単です。予め組み立てられたリボソームは既にリンが豊富でRNAに加え...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI at JoVE.com

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

10.0K ビュー.  University of Alberta. Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

ビデオ: Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

生物学

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

非トランスジェニック無脊椎動物における単一ニューロン分解能を用いたネットワークダイナミクスを記録するためのフォトダイオードベースの光学イメージング

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...