この研究の実験部分は、米国 - イスラエル国家科学財団（BM＆IL）、イスラエル科学財団（ISF）、ドイツ - イスラエル教プロジェクトプロジェクト（DIP）（BMへ）、およびバイオテクノロジー（BBSRCグラント番号：BB / M007006 / 1およびBB / D007585 / 1）からRCH

<ol><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/245/1314/203">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li>
<li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calphotin%3A+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+and+Ca2%2B+buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15694324">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li>
<li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Lond%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li>
<li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A+Neuroethol+Sens+Neural+Behav+Physiol%22%5BJournal%5D)">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li>
<li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li>
<li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li>
<li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/252/1335/223">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li>
<li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li>
<li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10747191">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li>
<li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li>
<li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://elsc.huji.ac.il/minke/publications/excess-g%16betae%13-over-g%16qalphae%13-%10-vivo%11-prevents-dark-spontaneous-activity-%10droso">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li>
<li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein%2C+phospholipase+C%2C+and+diacylglycerol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li>
<li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels%2C+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17234592">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li>
<li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18786361">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li>
<li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23066080">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00709805">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2%2B+channel+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li>
<li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li>
<li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9003779">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li>
<li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li>
<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+transform+glucose+to+alanine%2C+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li>
<li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li>
<li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2%2B+and+protein+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li>
<li>Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li>
<li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+block+by+Ca2%2B+underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

D. melanogaster光受容体への全細胞記録の適用は、TRPチャネル27,28,29およびINAD30,31,32スカフォールドタンパク質のような新規シグナル伝達タンパク質の発見および機能解明を可能にした。この技術の最初の導入以来、イオンのメカニズムと光応答の電圧依存性に関する長期的な基本的な問題を解決することができました。これは、膜電圧および細胞外および細胞内イオン組成を正確に制御する能力が付与されているために生じた19,28。 D. melanogasterにおけるパッチクランプ法の主な障害は、単離された眼球プリペアの脆弱性であった配給詳細な研究により、光伝達機構の完全性は、特に光暴露中のATPの連続的な供給に決定的に依存し、これがATPの大量消費をもたらすことが明らかにされている。残念なことに、パッチピペットで光受容体膜に到達するために必要な色素（ すなわち、グリア）細胞の機械的ストライピングは、ATP産生に必要な代謝産物の主要な供給源を排除する33 。記録用ピペットへの外因性ATPの適用は、大量のATPの必要性を部分的に満たすに過ぎない。 ATPの供給が不十分であれば、TRPチャネルの自発的活性化と、光活性化チャネルからの光伝達機構の解離が起こり、細胞のCa 2+が大幅に増加し、正常な光応答34,35が失われます。この一連の出来事は、解剖処置によってではなく、むしろATPの細胞枯渇による。この一連の事象の発生を防止し、正常な光応答を維持するために、光受容体は強烈な光に曝されるべきではなく、大量のATPを消費する。また、おそらくミトコンドリアのATP産生を促進するために、記録ピペットにNADを含める必要があります（18,36）。自発的および量子的なバンプの測定の場合、薄暗い光のみが使用されるので、上記の難点は最小限である。実際には、安定した全細胞記録を約20〜25分間維持することができるが、応答速度がこの期間に亘って低下する傾向がある。解離した個眼症の単一の調製物は、2時間まで生存し続けることができる。 単離された個体化調製物のさらなる欠点は、TRPの接近不可能性につながる微絨毛の接近不可能性であり、TRPLチャンネルを録音ピペットに接続し、シングルチャンネル録音を防止します。彼らが開発した方法を用いて、Bacigalupoらは、横紋筋からの単一チャネル活動を直接記録することに成功した37 。しかしながら、このチャネル活性は、組織培養細胞38で異種的に発現されたTRPLチャネルのものとは異なり、孤立した口角炎34から得られたショットノイズ分析に由来するTRPチャネル活性とは異なる。おそらく、解剖手順は、この方法を使用する際に光受容細胞を大きく損傷した。

100年以上前に開始されたショウジョウバエDrosophila melanogaster（ D. melanogaster）の広範な遺伝子研究は、複雑な生物学的プロセスの遺伝子解剖のための非常に有用な実験モデルとして、 D. melanogaster flyを確立した。以下に記載される方法論は、全細胞パッチクランプ記録の高いシグナル対ノイズ比とD.メラノガスター分子遺伝学の蓄積されたパワーとを組み合わせる。この組み合わせは、ネイティブ環境および単一分子の最高分解能の両方におけるイノシトール - 脂質シグナル伝達およびTRPチャネル調節および活性化のモデルとしてのD. melanogaster光形質導入の研究を可能にする。 D. melanogaster光受容体への全細胞記録法の適用は、無脊椎光伝達の研究に革命をもたらした。この方法はHardie 1によって開発されたもので、2 〜26年前にRanganathanらによって永久に命名され、 D. melanogasterの広範な遺伝子操作ツールを利用して、光伝達およびイノシトール - 脂質シグナル伝達のメカニズムを解明するためにそれらを使用するように設計された。最初に、この技法は、解剖プロセス中の光感受性の急速な低下および眼球の収量の低下が原因で、詳細な定量的研究が妨げられた。その後、パッチピペットにATPおよびNADを添加することにより、長期間の定量的記録のための調製の適合性が劇的に向上した。その後、分子レベルでのシグナル伝達機構の広範な特徴付けが実現された。 現在、 D.メラノガスターの光形質導入は、ホスホイノシチドシグナル伝達およびTRPチャネルを1分子分解能で生体外で研究することができるいくつかのシステムの1つである。これはD.メラノガスターの光伝達と私を作るこのメカニズムを非常に敏感なモデルシステムを研究するために開発した。このプロトコルは、 D. melanogaster網膜を解剖し、周囲の色素（グリア）細胞から単離された眼瞼を機械的に剥がす方法を記載する。これにより、光受容体細胞本体上にギガシールおよび全細胞パッチクランプを形成することが可能になる。幸いにも、ほとんどのシグナル伝達タンパク質は横紋筋に限定され、拡散しません。さらに、シグナルコンパートメントと細胞体3,4の間に位置するcalphotinと呼ばれる不動のCa 2+緩衝液と、微絨毛5の Na + / Ca 2+交換体（CalX）の高発現レベルがあります。一緒に、横紋筋肉へのタンパク質閉じ込め、カルホチン緩衝液、およびCalXの高発現は、必須成分の損失なしに、比較的長期間（ すなわち、 〜20分まで）の全細胞記録を可能にする光に対する高い感度を維持しながら、以下のプロトコルは、孤立した眼軟骨を得て、光伝達カスケードの本来の性質を保存するように見える全細胞記録を行う方法を記載する。解離したゴキブリ（ Periplaneta americana ） 6およびクリケット（ Gryllus bimaculatus ） 7眼瞼の全細胞パッチクランプ実験を、 D. melanogasterについて記載したのと同様に行った 。さらに、ファイルクラム（ Lima scabra ）およびスカラップ（ Pecten照射器 ）の解離した光受容体に対するパッチクランプ実験は、D。メラノガスター（ melanogaster ）で行われたものとはわずかに異なる方法で行われ、全細胞8および単一チャネル測定9 。ここでは、この技術を用いたD. melanogasterで得られた主な成果について述べる。ディスカッションiいくつかの落とし穴の説明とこの技法の限界点については触れていない。

<table><tbody><tr><td>10 mL syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe with elongated tip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &amp;micro;m PVDF filter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Capillaries (for omatidia separation)</td><td></td><td></td><td>Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2 small beakers</td><td></td><td></td><td>50 mL or less</td></tr><tr><td>2 paraffin film sheets</td><td>Parafilm M</td><td></td><td>~5 x 5 cm</td></tr><tr><td>Bath chamber</td><td>home-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td></td><td></td><td>22 x 22 mm No. 0</td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma</td><td>Paraffin &amp;ndash; polyisobutylene mixture</td><td>To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td></tr><tr><td>Ground</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-1288</td><td>Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td></tr><tr><td>Headless micro dissection needle</td><td></td><td></td><td>Entomology, 12 mm</td></tr><tr><td>Micro dissecting needle holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vise</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td><td></td><td>Dumont #5, Biology&amp;nbsp;</td><td>0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td></tr><tr><td>Stereoscopic zoom Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>Cold light source</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Filter (Color) for cold light source</td><td>Schott</td><td>RG620</td><td></td></tr><tr><td>Delicate wipers</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-T10P</td><td>Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP 85</td><td>Huxley-Wall Style Micromanipulator</td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>home made</td><td></td><td>Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td></tr><tr><td>Anti-vibration Table</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Osilloscope</td><td>GW</td><td>GOS-622G</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-8P</td><td>Pinch valve control system</td></tr><tr><td>Perfusion valve controller</td><td>Scientific instruments</td><td>BPS-8</td><td></td></tr><tr><td>Suction system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Device</td><td>Axopatch-1D</td><td></td></tr><tr><td>Head-stage</td><td>Molecular Device</td><td>CV - 4</td><td>Gain: x 1/100</td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Device</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Device</td><td>10</td><td>software</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Molecular Device</td><td>10</td><td>software</td></tr><tr><td>Light source (Xenon Arc lamp)</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda LS</td><td></td></tr><tr><td>Light detector</td><td>home made</td><td></td><td>phototransistor</td></tr><tr><td>Filter wheel and shutter controller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td><td></td></tr><tr><td>Filters (Natural density filter)</td><td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td></td></tr><tr><td>Filter (Color)</td><td>Schott</td><td>OG590, Edge filter</td><td></td></tr><tr><td>Xenon Flash Lamp system</td><td>Dr. Rapp OptoElecftronic</td><td>JML-C2</td><td></td></tr><tr><td>Light guide</td><td></td><td></td><td>Quartz&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pulse generator</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71, Inverted</td><td></td></tr><tr><td>Red illumination filter (Microscope)</td><td></td><td></td><td>RG630 / RG645 &amp;oslash;45mm</td></tr><tr><td>Microscope objective</td><td>Olympus</td><td>X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>iXon DU885K</td><td></td></tr><tr><td>NIS Element&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td>software</td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; indicator</td><td>Invitrogen</td><td>Calcium green 5N</td><td></td></tr><tr><td>Excitation &amp;amp; emission filters and dichroic mirror</td><td>Chroma</td><td>19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td><td></td></tr><tr><td>Vertical pipette puller</td><td>Narishige&amp;nbsp;</td><td>Model PP83</td><td>Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td></tr><tr><td>Horizontal pipette puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td></td></tr><tr><td>Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>3 mm trough or square box</td></tr><tr><td>Capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>borosilicate glass capillaries</td><td>1 x 0.58 mm</td></tr></tbody></table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞電圧クランプ記録は、 無細胞視覚伝達の分野に革命をもたらし、イノシトール - 脂質シグナル伝達および一過性受容体電位（TRP）チャネルを単一分子レベルで研究するためのD.メラノガスター分子遺伝学の使用を可能にした。少数の研究室がこの強力な技術を習得し、高度に制御された条件下での光に対する生理学的反応の分析を可能にする。この技術により、細胞内および細胞外の培地を制御することができます。膜電圧;ならびに種々のイオン性またはpH指示薬などの薬理学的化合物の細胞内および細胞外媒体への迅速な適用が含まれる。例外的に高い信号対雑音比で、この方法は、暗い自発的および光誘起単位電流（ すなわち、自発的および量子的バンプ）および巨視的光誘起電流（LIC）を罪から測定することを可能にするgle D. melanogaster光受容体。このプロトコルは、電気生理学的および光学的記録の両方を含むこの技術を実行するために必要なすべての重要なステップを詳細に概説している。浴室内のインタクトで生存可能なエクスビボで隔離された眼軟化の達成のためのハエの網膜切開術が記載されている。全細胞および蛍光イメージング測定を行うために必要な装置もまた詳細に記載されている。最後に、拡張された実験中にこの繊細な調製物を使用する際の落とし穴について説明する。

記載された方法は、定義された条件下で、光に対する巨視的応答を生成するために合計される自発的および光誘発量子隆起を生成する基本単位電流の正確な記録を可能にした。また、重要なシグナル伝達分子（ 図3および5 ）14,15,16,17,18に欠損を有する野生型および突然変異体ハエの比較も可能にした。さらに、二イオン条件下で逆電位を測定する能力は、TRPおよびTRP様（TRPL）チャネルの基本的な生物物理学的特性を明らかにした18,19。 TRPの細孔領域におけるアミノ酸置換の影響を測定し、そのCa 2+を修飾した透磁率20 。 パッチクランプ全細胞記録によって得られる光応答は、少なくとも4桁の光強度に直線的に依存する。これは、ERGおよび細胞内記録方法を用いて解決することはできなかった。したがって、増加する強度の簡単なフラッシュに対する一連の応答および強度応答関数のプロットは、光度の増加に伴うフラッシュ応答の厳密な直線性を明らかにした。厳密な直線性は少なくとも数百pAまで保持されますが、その後はリニアリティであるのか、またはブレークダウンするクランプ制御であるのかは議論の余地があります（ 図6 ）。これらの結果は、光に対する巨視的応答が、光（ すなわち、量子隆起）に対する単一応答の線形合計であることを示唆している。 光刺激indを薄暗くする電圧記録を用いてよく確立されている大部分の無脊椎動物種では個別の電圧変動（ すなわち量子隆起）が生じる。 D.メラノガスターの量子バンプは、バンプ18の頂点に〜15個のTRPチャネルと〜2個のTRPLチャネルが協調して開かれた結果生じる。それぞれのバンプは単一光子の吸収によって生成されるが、より強い光に対する巨視的応答はこれらの基本応答の合計である14,21。バンプは、刺激条件が同一であっても、待ち時間、時間経過および振幅において著しく変化する。バンプ生成はポアソン統計によって記述される確率論的プロセスであり、それによってそれぞれが効果的に吸収される光子は1つのバンプのみを引き出す。シングルフォトン - シングルバンプ関係では、カスケードの各ステップに効率的な「ターンオン」メカニズムだけでなく、同様に効果的な「ターンオフ」メカニズムも含まれている必要があります。機能上の利点は、非常に敏感な光子計数器であり、視覚系によって要求される感度および時間分解能の両方に非常によく適した高速過渡応答を有する。効率的なターンオフメカニズムの必要性は、活性フォトピグメント（ すなわち、メタロドプシン、M）またはそのターゲットである Gqαが不活性化に失敗し、光がオフになった後も継続してバンプが連続的に生じる場合に明らかになる3 ） 15,22,23,24 。 バンプは、微絨毛におけるTRP / TRPLチャネルの協同的活性を表す。このように、チャネル活性化の仮説は、協調チャネル活性化も説明すべきである。最近Hardieらは、光が光受容体の急速な収縮を誘発することを実証しており、光感受性eチャネル（TRP / TRPL）は機械的にゲートされていてもよい25 。この機械的活性化は、PLC媒介PIP 2加水分解によって放出される観測されたプロトンと一緒に、TRP / TRPLチャネルの開口を促進し、バンプ生成の協同的性質を説明する。現在、 D. melanogaster光受容体は、ホスホイノシチドシグナル伝達およびTRPチャネルをインビボで研究することができるいくつかのシステムの1つであり、 D. melanogaster光形質導入を作成し、このメカニズムを研究する方法論が非常に貴重なモデルシステムである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> 図3：inaC P209およびinaD P215突然変異体は、光および単一量子隆起の巨視的応答の遅い応答終結を明らかにする。 （ A ）単離したオマチジウムプレパ全細胞記録の間に、蛍光Lucifer Yellow CH色素（励起：430nm;発光：540nm）で満たされたパッチピペットを用いて定量する。蛍光色素は単一の光受容体細胞体を拡散して標識し、光受容体細胞体はそれらの細長い軸索から引き離されるが生存能力を維持することに留意されたい。この調製は、全細胞同時記録および画像化実験に適している。 （ BD ）上部パネル：WT、 inaC P209 、およびinaD P215突然変異体ハエにおける連続的な薄暗い光（オープンバー）に対する全細胞電圧クランプ量子塊応答 。バンプのゆっくりとした終結が、WTハエと比較してinaC P209およびinaD P215突然変異体で観察される。以下の挿入図は、単一のバンプの拡大された形状を示しています。下部パネル：上記野生型の500ms光パルス（1.5×10 5光子/秒）に対する標準化全細胞応答の巨視的応答を記録した<html>突然変異体ハエ。 （EG）上のパネル：野生型、 arr2 3 、およびninaC P235突然変異体ハエの単一光子応答を誘発する短時間（1ms）の薄暗い光に対する全細胞電圧クランプされた量子バンプ応答。単一の光子吸収に応答して、 arr2 3およびninaC P235突然変異体ハエで観察されるバンプの列に注目されたい。ボトムパネル：対応する突然変異体の500ms光パルス（1.5×10 4光子/秒）に対する全細胞電圧クランプ正規化応答。 arr2 3で観察された巨視的応答の緩慢な終結に注意してください ninaC P235突然変異体はWTと比較して飛ぶ。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> d / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; 図4：信号誘発Ca 2+流入後の細胞内Ca 2+ダイナミクスは、カルホチンによって影響を受ける。野生型およびCpn 1％の光受容体画像の時系列は、光刺激中のCa 2+指示薬の蛍光を示す。生強度画像は、偽色コーディング（棒=10μm;矢印はピペットを示す）を用いてプロットされる。 Weiss らの許可を得て再版された図。 4 。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> 図5：WT、trp、およびtrpl変異体の電気生理学的性質。 （ A ）全セル電圧クランプ・リコWT、 trp302 、およびtrp P343ヌル突然変異体ハエにおける連続的な薄暗い光（オープンバー）に応答する量子隆起の範囲。 trp P34 3バンプの振幅が大きく減少しています。挿入：野生型およびtrp P343ヌル突然変異体ハエの拡大単一量子隆起が示される。 （ B ）野生型および対応する突然変異体の3秒の光パルスに応答する全細胞電圧クランプ記録。 trp P343変異体の一過性定常状態応答が観察される。挿入：WTおよびtrp P343突然変異体の拡大された光応答が示される。 （ C ）逆電位（E rev ）付近で測定した、3mVの電圧ステップで、20msの光パルスに応答して誘発された、上記フライひずみの重畳された光誘起電流のファミリー。 （ D ） 野生型の平均E revおよび種々のムタンをプロットするヒストグラムts。エラーバーはSEMである.WTの逆転電位（E rev ）は、TRPのみを発現するtrp302の正のE revと、TRPLのみを発現するtrp P343ヌル変異体のE revとの間にある。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> 図6：フラッシュレスポンスは、光強度が増加するにつれて厳密に線形です。 増加する光強度の簡単なフラッシュに対する即時の一連の応答と、短い光フラッシュの増加する強度に対する光応答のピーク振幅の依存性のプロット。この関係は、フラッシュ応答と光度の増加との間の厳密な直線性を明らかにする。この厳しい直線性光強度が4桁以上に及ぶ、少なくとも数百pAを保持するが、それが直線性であるかそれ以降に分解するクランプ制御であるかは議論の余地がある。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15（NaOHで調整） </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度（mM） </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td>プロリン</td><td> 25 </td></tr><tr><td>アラニン</td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> -20℃で保存する。 </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt;注：この溶液は、名目上はCa 2+を含まないが、Ca 2+緩衝液を添加していないため、約5〜10μMのCa 2+トレースを有するであろう。細胞外溶液（ES）= 0.5mMまたは1Mストック溶液からCaClをES-0Ca 2+に添加して調製した1.5mM CaCl 2を含むES-0Ca 2+ 。 </td></tr></tbody></table> 表1：Ca +2を含まない細胞外溶液（ES）。化学物質の説明およびCa +2を含まないESの製造に必要な特定の量。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 量 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15mL </td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 1.5g </td></tr><tr><td colspan="2"> 1.5mLバイアルで150μLアリコートに分け、-20℃で保存する 76; C。 </td></tr><tr><td>粉砕溶液（TS） </td><td>解剖中に使用された溶液と一致するように、ストック溶液150mLの1バイアルにESまたはES-0Ca 2+ 1350mLを充填する。 </td></tr></tbody></table> 表2：胎児ウシ血清（FBS）+ショ糖ストック溶液。胎児ウシ血清（FBS）+ショ糖ストック溶液の製造に必要な化学的説明および特定量。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15（KOHで調整） </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度（mM） </td></tr><tr><td>グルコン酸カリウム（Kglu） </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATPマグネシウム塩（MgATP） </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTPナトリウム塩（Na 2 GTP） </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（NAD） </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> -20℃で保存する。 </td></tr></tbody></table> 表3：細胞内溶液（IS1）。 IS1の製造に必要な化学的説明と特定量。これは主に強度応答と量子バンプ測定に使用されます。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15（CsOHで調整） </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度（mM） </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATPマグネシウム塩（MgATP） </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTPナトリウム塩（Na 2 GTP） </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（NAD） </td><td> 1 </td></tr><tr><td>テトラエチル - 塩化アンモニウム（TAE） </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> -20℃で保存する。 </td></tr></tbody></table> 表4：細胞内溶液（IS2）。光誘起電流の逆電位測定に主に使用される細胞内溶液IS2を生成するために必要な化学的記述および特定量。

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞記録は、様々な条件下での自然発生的な暗いバンプ、量子隆起、光に対する肉眼的応答、および電流 - 電圧関係の測定を可能にする。 D. melanogaster遺伝子操作ツールと組み合わせて、この方法は、遍在するイノシトール - 脂質シグナル伝達経路およびその標的であるTRPチャネルの研究を可能にする。

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

electrophysiological-method-for-whole-cell-voltage-clamp-recordings

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

15.0K ビュー.  Hebrew University. ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞記録は、様々な条件下での自然発生的な暗いバンプ、量子隆起、光に対する肉眼的応答、および電流 - 電圧関係の測定を可能にする。 D. melanogaster遺伝子操作ツールと組み合わせて、この方法は、遍在するイノシトール - 脂質シグナル伝達経路およびその標的であるTRPチャネルの研究を可能にする。 ...

ビデオ: Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

アダルトショウジョウバエの脳から全細胞レコーディング

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

生物学

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

の巨大線維経路からの電気生理学的記録 D.キイロ</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

神経科学

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

ショウジョウバエ光受容体の光色素レベルを測定するための電気生理学的方法

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

Source: Juusola, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54142">Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

光刺激に対するショウジョウバエ網膜光受容体の電圧応答の電気生理学的記録

1. Recording from R1-R6 Photoreceptors 

	Always be grounded when operating the microelectrode amplifier (for example by touching the metal surface of the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Investigating Prolonged Depolarizing Afterpotential (PDA) in Drosophila Photoreceptors

Source: Gutorov, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63514">Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates an experimental protocol to investigate the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) in white-eyed Drosophila. The fly&#39;s eye is exposed to intense blue light pulses to convert the photopigment rhodopsin to metarhodopsin, initiating a signaling cascade that opens positive ion channels and causes membrane depolarization. Because blue light prevents the reconversion of metarhodopsin to rhodopsin, the continuous influx of positive ions results in sustained depolarization, known as the prolonged depolarizing afterpotential (PDA).

ショウジョウバエの光受容体における長期にわたる脱分極性残電位(PDA)の調査

1. Measuring the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) using the electroretinogram

	Suitable rearing conditions for Drosophila melanogaster ...

Stimulation and Modulation Techniques

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Source:&#160; Katz, B., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55627">Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates recording electrical activity in the photoreceptor neurons of Drosophila&#39;s ommatidium by establishing a whole-cell configuration. It highlights the activation of transient receptor potential channels by light pulses, resulting in measurable quantum bumps.

ショウジョウバエの光受容体からの全細胞電圧クランプ記録

NOTE: During all of the following steps, use only dim red light illumination and ensure that the ommatidia&#39;s exposure to light is minimal (i.e., work ...

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法

要約

さらに動画を探す